芥菜离体培养芽再生过程中的生理生化变化研究-硕士论文

西南大学 硕士学位论文 芥菜离体培养芽再生过程中的生理生化变化研究 姓名：蒋波 申请学位级别：硕士 专业：蔬菜学 指导教师：宋明;王志敏 20100501 摘要 量皇笪皇曼曼鼍曼曼曼鼍曼曼曼i _ 一 m l 曼曼量皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼皇曼曼量曼曼曼曼 芥菜离体培养芽再生过程中的生理生化 变化研究 蔬菜学专业硕士研究生：蒋波 指导教师：宋明教授 王志敏副教授 摘要 本试验以芥菜( B r a s s i c a j u n c e aC o s s ) 的三个品种：四川榨菜、金研一号香菜、圆大头菜为 实验材料，建立了三个品种的子叶离体培养体系。对三个品种子叶离体培养芽再生过程中的 生理生化指标变化( 可溶性蛋白、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、可溶性糖、 淀粉、核酸) 和可溶性蛋白组分以及过氧化物酶同工酶进行了比较研究，实验结果如下： 1 四川榨菜、金研一号香菜、圆大头菜的子叶在培养基M S + N A A 0 1 m g L + 6 B A 3 0 m g L 上均得到最高分化率，分化率分别为：8 3 、7 6 、5 l 。 2 选择培养基M S + N A A 0 I m g L + 6 - B A 3 0 m g L + 2 ，4 一D O m g L 为金研一号愈伤组织的诱 导培养基，子叶愈伤组织诱导率为9 3 。愈伤组织的最适增殖培养基为M S + N A A 0 3 m g L + 6 - B A 3 0 m g L + 2 ，4 - D O 1m e v ，L 。愈伤组织最适分化培养基为M S + N A A 0 1m g 几+ 6 - B A 3 O m g L ，愈 伤分化率为1 3 。 3 在四川榨菜、金研一号香菜、圆大头菜子叶离体培养芽再生过程中，三个品种在抗氧 化酶( P O D 、S O D 、C A T ) 活性以及可溶性糖含量、淀粉含量和R N A 含量上的变化规律基本 一致，只是在分化过程中品种间表现略有差异，其中四川榨菜先分化出芽，先于另外两个品 种出现变化的峰值，同时由于四川榨菜和金研一号香菜分化率高，代谢活跃，各个生理生化 指标变化趋势也比圆大头菜剧烈。而可溶性蛋白含量和D N A 含量的变化上，金研号香菜因 直接形成芽丛，因此在含量上出现了与其他两个品种不同的变化趋势。如在培养8 天时，金 研一号香菜的可溶性蛋白含量和D N A 含量有小幅上升，其他两个品种则呈下降趋势。 4 三个品种在分化过程中，在不同的培养阶段，都各自有不同的特异蛋白条带和P O D 同 工酶谱的出现和消失。 四川榨菜愈伤组织分化时有5 5 K D a 、3 0 K D a 、3 1 K D a 、1 8 K D a 蛋白组分表达，5 7 K D a 、 两南大学硕十学位论文 3 8 K D a 、2 8 K D a 、1 2 K D a 蛋白组分消失；金研一号香菜子叶分化时有5 5 K D a 、1 4 K D a 蛋白组 分表达，而5 7 K D a 、3 4 K D a 、2 6 K D a 、1 2 K D a 蛋白组分则被关闭；圆大头菜子叶培养1 6 d 愈 伤组织分化时，5 5 K D a 蛋白组分表达，但1 2 K D a 蛋白组分被关闭。三个芥菜品种分化时都有 1 2 K D a 蛋白条带的消失，1 2 K D a 蛋白条带的消失可以作为分化的标志之一。 三个芥菜品种的子叶含有相同的P O D 同工酶谱带。四川榨菜子叶分化时，B 带消失，而 C 、D 、E 带活性进一步增强：金研一号香菜子叶分化时A 带出现，含有A 、B 、C 、D 、E 五 条带；圆大头菜子叶分化时，A 、C 带出现，也含有A 、B 、C 、D 、E 五条带。 5 主成分分析结果表明，P O D 、C A T 、S O D 、可溶性糖、可溶性蛋白含量和D N A 含量6 个指标可以反映芥菜子叶离体培养芽再生过程。 关键词：芥菜组织培养生理生化 I I A B S 下R A C 丁 I I I 。I 皇曼皇曼曼曼曼皇量曼! 曼曼曼曼曼 S t u d i e so nC h a n g e so f P h y s i o l o g ya n d B i o c h e m i s t r yi nt h eC o u r s eo fS h o o t R e g e n e r a t i o no fm u s t a r d C a n d i d a t e ：J i a n gB o S u p e r v i s o r ：P r o f S o n gM i n g A s s o c i a t eP r o f W a n gZ h i m i n A BS T R A C T I n t h i sr e s e a r c h , t h ep l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mw e r ee s t a b l i s h e do nt h r e ev a r i e t i e so fm u s t a r d ( i n c l u d i n gS i c h u a n z h a c a i ，J i n y a n y i h a o x i a n g c a ia n dY u a n d a t o u c a i ) I nt h ep r o c e s so f t h es h o o t sw e r e r e g e n e r a t e df r o mc o t y l e d o n s ，t h i sw o r km a i n l yf o c u s e do nt h er e s e a r c ho fb i o c h e m i c a li n d i c a t o r c h a n g e s ( s o l u b l ep r o t e i n , p e r o x i d a s e ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，c a t a l a s e ，s o l u b l es u g a r s ，s t a r c ha n d n u c l e i ca c i d ) s o l u b l ep r o t e i n sa n dp e r o x i d s ei s o e n z y m eo ft h et h r e ev a r i e t i e so fm u s t a r d T h e r e s u l t sw e r el i s t e da sf o l l o w s ： 1 T h em o s ts u i t a b l em e d i u mt og e tt h eh i g h e s ts h o o tr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yw a st h e M Sm e d i u mc o n t a i n i n g6 - B A 3 0 m g La n dN A A 0 Im g L ，a n dt h ef r e q u e n c i e s ( S i c h u a n z h a c a i ， J i n y a n y i h a o x i a n g c a ia n dY u a n d a t o u c a i ) w e r e8 3 ，7 6 a n d5 1 2 1 1 1 eo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o no fJ i n y a n y i h a o x i a n g c a iw a sM S + 0 1m g L N A A + 3 0 m g L 6 一B A + 0 1m g L 2 ，4 D ，a n dt h ei n d u c t i o nr a t ew a s9 3 1 1 1 eo p t i m a lf o rc a l l u sp r o l i f e l a t i o nw a sM S + N A A 0 3 m g L + 6 一B A 0 3 m g L + 0 1i n g L 2 4 D T h eo p t i m a lf o r m u l af o rc a l l u s d i f f e r e n t i a t i o nW a sM S + 0 6 m g L 6 - B A + 0 1m g LN A A ，t h er a t ei s13 3 I nt h ep r o c e s so ft h es h o o tr e g e n e r a t i o nf r o mc o t y l e d o n so ft h r e em u s t a r dv a r i e t i e s 。t h e c h a n g e so fa n t i o x i d a n te n z y m e s ( P O D ，S O Da n dC A T ) a c t i v i t y , s o l u b l es u g a rc o n t e n t , s t a r c hc o n t e n t a n dR N Ac o n t e n th a dt h es i m i l a rt e n d e n c y I nt h ed i f f e r e n t i a t i o np r o c e s s ，t h e r ew e r eal i t t ed i f f e r e n c e d u r i n gt h r e ev a r i e t i e s T h es h o o t Sr e g e n e r a t i o no fS i c h u a n z h a c a iw a se a r l i e rt h a nt h eo t h e rt W O v a r i e t i e sa n di t sb i o c h e m i c a lc h a n g ew a sa p p e a r e dt h ep e a ke a r l i e r 1 1 1 ed i f f e r e n t i a t i o nr a t eo f S i c h u a n z h a c a ia n dJ i n y a n y i h a o x i a n g c a iw e r eh i g h e rt h a nY u a n d a t o u c a i ，a n dt h e i rp h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a li n d e x e sc h a n g e di n t e n s e rt h a nY u a n d a t o u c a i J i n y a n y i h a o x i a n g c a if o r m e da d v e n t i t i o u s b u dw i t h o u tc a l l u si nt h es a m em e d i u m t h es o l u b l ep r o t e i nc o n t e n ta n dD N Ac o n t e n ts h o w e d I I I 西南大学硕+ 学位论文 d i f f e r e n tt r e n d s 4 T h ep r o t e i na n dP O Di s o e n z y m e sc o m p o n e n t si nd i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e so ft h r e e m u s t a r dv a r i e t i e sw e r ec o m p a r e db yS D S - P A G E T h e r ew e r ed i f f e r e n ts p e c i f i cp r o t e i n sa n dP O D i s o e n z y m e sa p p e a r e da n dd i s a p p e a r e di nd i f f e r e n ts t a g e s T h e r ew e r ef o u rk i n d so f p r o t e i n s ( 5 5 K D a , 3 0 K D a , 31K D aa n d18 K D a ) e x p r e s s e dd u r i n gc a l l u s o fS i c h u a n z h a c a id i f f e r e n t i a t e d , a n df o u rk i n d so fp r o t e i n s ( 5 7 K D a , 3 8 K D a , 2 8 K d aa n d1 2 K D a ) d i s a p p e a r e d W h e nc o t y l e d o n so fJ i n y a n y i h a o x i a n g c a id i f f e r e n t i a t e d ，t w ok i n d so fp r o t e i n s ( 5 5 K d a a n d14 K D a ) e x p r e s s e da n df o u rk i n d so fp r o t e i n s ( 5 7 K D a , 3 4 K D a , 2 6 K d aa n d12 K D a ) d i d nt e x p r e s s W h e nc o t y l e d o n so fY u a n d a t o u c a ic u l t u r e d16d a y s ，t h ec a l l u sd i f f e r e n t i a t e d ，t h ep r o t e i no f 5 5 K D ae x p r e s s e da n dp r o t e i no f12 K D ad i s a p p e a r e d T h ep r o t e i no f12 K D ad i d nte x p r e s sd u r i n g t h r e ev a r i e t i e so fm u s t a r do r g a n o g e n e s i s ，t h e r e f o r e ，t h ep r o t e i no f12 K Dd i s a p p e a r e dc a nb eu s e da s am a r k e ro fc o t y l e d o n sd i f f e r e n t i a t i o ni nm u s t a r dt i s s u ec u l t u r e T h ec o t y l e d o n so ft h r e em u s t a r dv a r i e t i e sh a dt h es a m eP O Di s o e n z y m e s T h ec o t y l e d o no f S i c h u a n z h a c a id i f f e r e n t i a t e d ，w h i l eBb a n dd i s a p p e a r e da n dt h ei n t e n s i t yo fC ，Da n dEb a n d st h e n e n h a n c e d J i n y a n y i h a o x i a n g c a ic o t y l e d o nd i f f e r e n t i a t i o no c c u r r e dw h e nt h eAb a n da p p e a r e d W h e n c o t y i e d o no fY u a n d a t o u c a id i f f e r e n t i a t e d ，Aa n dCb a n d sa r i s e d n l e ya l lh a v eA ，B ，C ，Da n dE b a n d s 5 T h ep r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea n t i o x i d a n te n z y m e s ( P O D ，S O Da n dC A T ) a c t i v i t y , s o l u b l es u g a rc o n t e n t , s o l u b l ep r o t e i nc o n t e n ta n dD N Ac o n t e n tc o u l dr e f l e c tt h ep r o c e s so f t h es h o o tr e g e n e r a t i o nf r o mm u s t a r dc o t y l e d o n s K e yW o r d s ：M u s t a r d ；T i s s u ec u l t u r e ；P h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y I V 缔写词说明 缩写词说明 缩写名 英文名中文名 6 - B A 6 - B e n z y l a m i n o p u r i n e 6 一苄氩摧腺嘌呤 2 4 D A c r B j s C A T D N A N A A N B T P G R P O D R N A S D S S O D T D Z 2 4 - D d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i cA c i d A c y l a m i d e B i s - A e r y l a m i d e C a t a l a s e D e o x y r i b o n u c l e i ca c i d I - N a p h t h l c e t i cA c i d r e t r a n i t r o b l u et e t r a z o l i u mc h l o r i d e P l a n tG r o w t hR e g u l a t o r s P e m x i d a s e R i b o N u c l e i cA c i d S o d i u md o d e c y ls u l f a t e S u p e r o x i d eD i s m u t a s e T h i d i a z u r o n 2 , 4 二氯苯氧乙酸 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 过氧化氢酶 脱氧核糖核酸 小萘乙酸 氯化硝基四氮唑蓝 植物生长调节剂 过氧化物酶 核糖核酸 十二烷基硫酸钠 超氧化物歧化酶 噻苯隆 T E M E D T e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 四甲基乙二胺 5 7 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 标注。 学位论文作者：蔼班 签字日期： 矽年f 月节日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：哜保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：筲旌 导师签名：二等州 签字日期：加铲乡月缛日 签字E l 期：) ，t 口年r 月2 p 日 。 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 植物组织培养的定义 植物组织培养( p l a n tt i s s u ec u l t u r e ) 是根据植物细胞具有全能性的理论，在无菌条件下，将 离体的植物器官( 根、茎、叶、花、果实和种子等) 、组织( 花药组织、形成层、胚珠、胚乳和 皮层等) 、细胞( 体细胞和生殖细胞) 以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的 培养条件( 含有营养物质和植物生长调节物质等) ，使其长成完整的植株，统称为植物组织培 养。由于培养对象是脱离植物母体的培养物，在试管内培养，所以也叫离体培养( C u l t u r e nv i t r o ) 或试管培养( I nt e s t - t u b ec u l t u r e ) 。根据所培养的植物材料不同，植物组织培养分为愈伤组织 培养、器官培养、胚培养、原生质体培养等。 1 2 植物组织培养发展概况 植物组织培养技术历史开始于1 9 世纪。S c h e i d e n 和S c h w a n ( 1 8 3 8 ，1 8 3 9 ) 提出了细胞学说， 它包括两个基本方面：( 1 ) 所有生物都是由细胞和细胞的产物所构成，细胞是生物有机体的 基本单位；( 2 ) 细胞有机体的每一个生活细胞在适宜的外部环境条件下都有独立发育的潜 能。这一学说后来成为植物细胞组织培养研究的思想基础。1 8 5 8 年V i r c h o w 出版的细胞病 理学一书，更有力的支持了细胞学说。V o c b t u n g ( 1 8 7 8 ) 完成的切技经典实验，提供了植物细 胞组织培养的启蒙信息【2 1 。1 9 0 1 年，M o r g a n 首次提出一个全能性细胞应具有发育出一个 完整植株的能力。所谓全能性细胞就是指具有完整的膜系统和细胞核的生活细胞，在适 宜的条件下可通过细胞分裂与分化，再生出一个完整植株。H a b e r l a n d t ( 1 9 0 2 ) 首次提出细 胞培养的概念，提出了人们可以培养植物的体细胞成为人工胚，植物的单个细胞可能具有分 化成完整植株的全能性【3 】，也是第一个用人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人，但 未获得成功。1 9 2 2 年，H a l m i n g 用胚胎培养首次获得成功，K o a e 等获得了离体根尖培养的某 些成功。我国李继桐( 1 9 3 3 ) 进行了银杏胚胎培养获得小植株。至此，植物细胞组织培养获得了 器官培养方面有价值的结果【4 1 。 W h i t e ( 1 9 3 4 ) 平l J 用离体的番茄根，建立了第个活跃生长的番茄根尖无性繁殖系【5 】，并能进 行继代培养，使根的离体培养实验首次获得了成功。1 9 3 7 年，他首先配置成综合培养基，发 现和提出B 族维生素B 1 、维生素B 6 和烟酸对离体根生长的重要性，建立起W h i t e 培养基。 同年，法国的G a u t h e r e t ，N o b e c o u r t 也发现了B 族维生素的作用，并且培养块根和树木形成层 获得成功。这个时期主要由于W h i t e ，G a u t h e r e t 和N o b e c o m 等人的出色工作，建立了植物组 织培养的综合培养基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激物质，同时也建立了组织培养 的基本方法，成为了当今各种培养技术的基础。从此植物组织培养进入快速发展时期。1 9 4 1 年，O v e r b e e k 、C o n k l i n 和B l a k e s | e e 等用附加椰乳到培养基中，获得了曼陀罗离体胚 培养的成功【6 】。椰乳成分复杂，含有多种不同的有机物，后来的研究发现，其中在组织 两南大学硕十学伊论文 曼皇蔓皇曼I ；I 一一一一一一 ；I I I ! 曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼 培养中起主要作用的是腺嘌呤类激素或类似物。1 9 4 2 年，L a m m e r t s 进行了杏、油桃和桃 的杂种胚培养，提高了杂种的萌芽率。1 9 4 3 年W h i t e 撰写的植物组织培养手册是第一部 有关植物组织培养技术的专著，从此，植物组织培养成为一门新兴的学科。 2 0 世纪4 0 年代末由于植物实验形态学方面的需要，开始进行调控细胞培养物器官分化的 研究。1 9 4 8 年S k o o g 和我国学者崔微在烟茎切段和髓培养以及器官形成研究中，发现嘌呤或 腺苷可以解除吲哚乙酸对芽形成的抑制，并提出腺嘌呤与生长素的比例是控制根芽分化的决 定因素，即：细胞分裂素与生长素的比值，控制器官的发育，生长素与细胞分裂素的比例大 时促进生根，比例小时促进芽的分化【7 J 。成为后来控制器官分化与形成的激素调控模式，为植 物组织培养技术发展做出了杰出贡献。以后很多科学工作者发现并应用6 - B A ，玉米素等激素。 2 0 世纪5 0 年代是植物组织培养蓬勃发展阶段。植物组织培养工作已经遍及世界大多数国 家，组织和器官培养技术日趋成熟和完善，越来越多的植物物种通过离体培养获得了再生植 株【8 】。小麦、玉米、烟草、胡萝卜、茄子和马铃薯等主要作物已相继建立了稳定高效的离体再 生体系1 9 ，为这些作物的生物技术研究奠定了稳固的基础。1 9 5 8 年美国的S t e w a r d 1 和德国 的R e i n e r t 分别由胡萝卜髓细胞诱导形成了胚状体，1 9 6 5 年由V a s i l 和H i l d e b r a n d t l l 2 1 用单个分 离的烟草细胞培养获得整个植株的再生，从而使植物细胞全能性的理论真正得到了科学的证 实。从此之后，一批又一批植物的组织或器官通过培养的方法获得了再生植株。 2 0 世纪6 0 年代，在植物组织培养方面的另外两项成就就是小孢子培养和原生质体培养的 成功。1 9 6 4 年，G u h a 首次获得花药单倍体植株。1 9 7 1 年，T a k e b e l l 3 1 等首次利用原生质体培养 获得再生植株。1 9 7 2 年，C a r i s o n 首次诱导原生质体融合实现体细胞杂交。事实一次又一次证 明了植物细胞的全能性，从而在各种水平上数以干计的植物细胞均能再生植株，为组织培养 的应用研究奠定了良好的基础，同时也为组织培养工作应用于作物改良开辟了广阔前景【1 4 】。 自2 0 世纪6 0 年代始，植物组织与细胞培养逐渐走向了工厂化和商品化阶段。1 9 6 0 年， M o r e l 通过培养兰花的根尖，得到兰花的脱毒株，并能快速繁殖兰花。其后，国际上相继建立 了兰花的脱毒和快繁体系，建立了“兰花工业”。1 9 6 4 年，C u h a 等利用曼陀罗花药培养首次获 得了单倍体植株，由此证明性细胞也具有全能性。1 9 7 2 年，C a r l s o n 等通过两个烟草植物之间 原生质的融合，获得了第一个体细胞杂种。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合过程中 的重要作用，花药培养在2 0 世纪7 0 年代得到迅速发展。 进入2 0 世纪7 0 年代中期，植物组织培养技术更趋成熟，应用于实践的研究进入高潮。 至今已有一万多种植物再生植株获得成功，并培养出许多生产上有用的新品种、新资源，如 我国利用花培技术育成了烟草、水稻、小麦、大麦等作物新品种【2 15 1 6 J 。 组织培养的研究与发展像其他科学领域一样，开始也只是一种纯学术性的研究，用以回 答有关植物生长和发育的某些理论问题，但其发展的结果却显示出巨大的应用价值，现在， 植物组织培养走向工厂化和商品阶段已经取得了显著的经济效益。 2 第1 章文献综述 - - II, 皇 1 3 植物组织培养的应用 植物组织培养技术既是一种基础性研究，又是一种极具普及意义的生物技术，推广利用 可以形成一批高新技术产业。发达国家植物组织培养的产业化主要在保健品和药物原料工厂 化生产及人工种子和苗木工厂化生产两个方面。植物组织培养技术的进步，有力地促进了我 国各地农林、园艺产业化的发展，为园林、花卉、经济林木和传统要用植物的生产、保存、 纯化、抗病毒和快速繁殖提供了极为有效地植物生物技术方法。该项技术的发展正迸一步展 示出巨大的经济潜力。组织培养既可为基因工程提供理想的受体材料，也可为植物改良程序 提供新的手段，使运用传统方法难以解决的问题迎刃而解。现今，植物组织培养其应用主要 在以下几个方面： 1 3 1 离体快繁 植物组织培养的快速繁殖，就是应用组织培养和细胞培养技术，在人工控制的环境条件 下快速繁衍珍稀濒危植物或快速繁殖名优特新品种，并经过反复继代，达到周年生产【 】。快 速繁殖的植株能保持母本的生物特性和遗传性状，并可在短时间内种植于田间。它是当前植 物组织培养中应用最广泛，最有效的方法之一。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种 苗生产不仅能够获得显著的经济效益，同时能够挽救珍稀濒危物种，而且能够帮助解决药用 植物野生资源缺乏而造成的短缺问题。快速繁殖主要应用于：良种快繁，新育成的、新引 进的、新发现的稀缺良种的快繁；少量脱毒良种苗的快繁和无病毒苗的大量快繁；特殊 育种材料的快繁；制种材料的快繁；基因工程植株的快繁；自然和人工诱变有用突变 体的快繁；离体保存种质的快繁：濒危植物的离体快繁等。目前，快速繁殖的花卉有数 百种，如月季、菊花、牡丹、花叶芋、龟背竹、竹芋、山条、各种兰等。像花叶芋这种植物， 常规繁殖每年仅几倍到十几倍，组织培养则每年可繁殖出几万至百万倍的小幼苗。这对珍稀、 优、新品种是非常有价值的方法。目前，一些具有重要价值的用材、经济树种和花木等也实 现了工业化、商业化生产，有的建成“植物微型繁殖中心”等【1 8 】。B r o w n 等1 9 8 6 年统计进行 快速繁殖研究的植物超过1 0 0 0 种以上f 1 9 1 。 1 3 2 培育脱毒苗 无病毒植株的生产消除病毒、生产无病毒植株是植物组织培养的一大杰出贡献。很多农 作物都有可能感染1 种或数种病毒或类病毒，已发现的病毒超过5 0 0 种。特别是无性繁殖植 物( 采用扦插、分株等营养繁殖的各种作物) ，如马铃薯、大蒜等。在植物的生长和发育过程 中，由于病毒的感染而严重影响作物的产量和品质。应用组织培养方法，获得无病毒植株， 为大规模的无病毒工厂化生产提供了途径【2 0 1 。 2 0 世纪8 0 年代人们就广泛采用了茎尖组培脱毒的方法，茎尖生长点通常没有或只有很少 病毒，以茎尖为材料或加以适当的热处理，在无菌条件下培养即可获得脱毒植株，然后通过 3 两南大学硕+ 学位论文 快繁得剑大量无毒苗【2 1 1 。由于利用茎尖培养脱毒技术成功地克服了病毒的感染，因而在栽培 这些脱毒植株时，往往不需要化学农药防治，从而减轻了生产投入，同时还减轻了环境污染， 因而具有良好的经济效益和社会效益。目前，这种方法已成为有效克服病毒病危害的主要方 法之一，自从2 0 世纪5 0 年代发现通过植物组织培养技术可以去除植物体内的病毒以来，这 方面发展很快。通过茎尖脱毒获得无病毒种苗的植物己超过1 0 0 多种，被脱除的病毒更多。 1 9 世纪6 0 年代后，国际上逐渐建立了无病毒试管苗，欧美国家无病毒种苗年产值已达千万元 以上，预计今后几年内无病毒种苗的需求量还会不断增加。目前，生产上栽培的香蕉、甘蔗、 甘薯、马铃薯大多数均为无病毒种苗。 1 3 3 生产次生代谢产物 植物组织培养在次生代谢物提取方面的应用是这一领域的又一大亮点。利用组织或细胞 的大规模培养，有可能生产出人类所需要的一切天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、 药物、香料、生物碱及其他活性化合物。目前，已对5 0 0 多种植物进行了研究并建立了细胞 培养体系，从培养细胞中分离得到6 0 0 多种次级代谢产物，其中6 0 多种化合物在含量上超过 或等丁其原植物【2 2 1 ，2 0 种以上干重超过l ，国际上已获得这方面专利1 0 0 多项。 次生代谢物的研究和组织培养方面，开展工作最多的是德国和日本。用组织培养可以生 产的化合物有强- t l , 苷、吲哚生物碱、黄连素、辅酶Q 1 0 等，现已筛选出高产的细胞系，大规 模生产亦有成效。我国采用植物组织培养技术生产次级代谢产物也取得了飞速的发展，现已 有洋苏草、人参、烟草、长春花、茜草等l o 余种植物的次生代谢物已进入工业化生产或中试 阶段I 乃J 。 近年来，用单细胞培养生产蛋白质，将给饲料和食品工业提供广阔的原料生产前途；用 组织培养方法生产微生物以及人工不能合成的药物或有效成分的研究，正在不断深入，有些 已投入工业化生产，预计今后将有更大发展。 1 3 4 保存种质资源 农业生产是在现行种质资源的基础上进行的，由于自然灾害和生物之间的竞争以及人类 活动对大自然的影响，已有相当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。具有独特遗传性 状的生物物种的绝迹是一种不可挽回的损失。利用植物组织和细胞法低温保存种质，可大大 节约人力、物力、财力和土地，同时也便于种质资源的交换和转移，防止有害病虫的人为传 播。近年来，人们研究用于组织培养保存的材料较多，如茎尖、花粉、体细胞胚、细胞系等。 目前，国际上多采用液氮将种质进行超低温冷冻保存，建立基因库，可以使离体培养的器官、 组织、细胞在1 9 6 条件下，长期保存而不丧失细胞分裂和植株再生的能力，延长种质寿命。 目前超低温保存己在4 0 多种植物中获得成功，广西林科院林木花卉培养工厂经过多年的引进 与研究，现已建立了品种4 0 多个称猴桃品种的离体种质，达5 0 多种花卉组培基因库【2 4 】。 4 第1 章文献综述 1 3 5 生产人工种子 人工种子是通过组织培养技术，将植物的体细胞诱导成在形态上和生理上均与合子胚相 似的体细胞胚，然后将它包埋在含有营养成分和保护功能的物质中，组成便于播种的类似种 子的单位，在适宜的条件下发芽出苗。与天然种子相比，生产人工种子不受季节限制。通过 组织培养的方法可以获得数量很多的胚状体，而且繁殖速度快，结构完整，可能更快地 培养出新品种来，还可以在凝胶包裹物里加入天然种子可能没有的有利成分，使人工种子具 有更加好的营养供应和抵抗疾病的能力，从而获得更加茁壮生长的可能性。人工种子则可以 完全保持优良品种的遗传特性，生产上也不受季节的限制。人工种子比采用试管苗的繁殖 方法更能降低成本，而且方便机械化播种，可节省劳动力。人工种子外层是起保护作用的 薄膜，类似天然种子的种皮，因此，可以很方便地贮藏和运输。据报道，目前己对2 6 个科， 3 6 个属的植物的人工种子进行了研究【2 卯，有的已经进入了开发阶段。 1 3 6 植株的遗传转化 植物遗传转化是把经过分离或人工构建的基因，通过细胞组织培养或系统转化技术等方 法插入到植物基因组中，得到基因产物相生物活性的表达，并能遗传至后代【2 6 】。近几年来植 物基因工程的研究进展十分迅速。在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改变作物的某些成分方面 部己得到了不少转基因植株，有的已经建成了品系，为提高作物的产量、抗逆能力，改进它 们的品质，进行快速、优质、稳产的良种选育提供了一条诱人的全新途径。作为生物技术的 一个重要部分，植物基因工程的研究和开发利用已被列入我国高技术研究计划之内。目前， 植物基因工程技术研究中的首批成果已经接近或初步进入了开发利用阶段。1 9 9 6 年转基因作 物全球销售额为2 3 5 亿美元，估计到2 0 1 0 年将达到2 5 0 亿美元【2 7 1 。植株基因工程被认为是 2 l 世纪农业的希望，是新的农业技术革命的重要组成部分。 1 3 7 新品种的培育 组织培养可使育种材料微型化，保存暂时不用的原始材料，或在培养条件下选育，以便 从大量素材中选出有益的变异，避免在田间条件下做选择。在培养条件下可方便安排各种理 化诱变因子，如各种辐射线、秋水仙碱及其他化学诱变剂。利用胚培养和试管内授粉受精技 术克服杂交的不亲和性和杂种胚的早期败育。利用花药、花粉做单倍体育种试验，也可缩短 育种年限，提高选择效率。各种水平的突变系筛选等都是常规育种手段的升华和突破，随着 研究的深入，肯定会做出很有价值的贡献。目前，国内外把植物组织培养已普遍应用于作物 育种，并在以下几个方面取得了较大进展： 倍性育种单倍体植株由具有单套染色体的性细胞生成的植株，以一定量的诱变剂如 秋水仙素等处理可得纯合二倍体植株，该育种方法具有高效、基因一次纯合的特点f 2 引。在单 倍体育种方面，我国科学家做出了突出贡献。1 9 7 4 年我国最先在作物上进行单倍体育种，育 5 两南大学硕+ 学伊论文 成了世界上第一个作物新品种单育1 号烟草品种，随后有应用于水稻和小麦等大面积作物， 获得了许多新品系。据不完全统计，到1 9 8 7 年为止我国各地用花药或花粉培育出的植物已有 2 2 科5 2 属1 6 0 个种，取得了较大的成就【2 9 3 们。多倍体的特点主要表现在相对产品器官较大、 品质较好、某些营养成分含量高、可孕性低、抗性强等特征，但用常规育种方法时间较长， 如果将组织培养技术和人工诱变相结合【3 1 】，可以缩短多倍体育种时间，从而大大提高育种的 效率。利用此项技术已在多种植物材料中成功诱导出多倍体1 3 2 。 胚胎培养在植物的种间杂交和远缘杂交中存在杂交胚不能正常发育的困难，将早期 形成的胚进行离体培养，可以使胚正常发育并成功地培养出杂交后代，甚至可以通过无性系 繁殖获得数量较多、性状一致的群体。胚胎培养已在5 0 多个科属中获得成功【3 3 1 。 细胞融合通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种， 从而创造新种或育成优良品种，目前，已获得4 0 余个种间、属间、甚至科间的体细胞杂种、 愈伤组织，有些还进而分化成苗【3 4 1 。随着原生质体融合、选择、培养技术的不断成熟和发展， 今后可望获得更多有一定应用价值的经济作物体细胞杂种及新品种。 目前，植物组织培养技术已经渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种学等生 物学各个研究领域，在种植资源的保存和交换、育种和快速繁殖无性系及进行药物生产等方 面也已获得了广泛的实际应用效果，成为生物科学中的重要研究技术和手段之一。在农业、 林业、工业、医药业等多个行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，成为当代生物科学中 最有生命力的一门学科。将来，组织培养的主要研究方向将是：一是应用在各种重要经济植 物上和濒临灭绝的植物上的研究；二是加强细胞生长、增殖和分化机理以及细胞遗传变异方 面的研究。 1 4 植物组织培养外植体分化过程中的生理生化研究 植物细胞脱分化、再分化和形成完整植株是植物细胞全能性理论实现的基础。细胞内的 生理生化变化是组织形态变化的基础，分生细胞的分化是愈伤组织再生的细胞学基础，而细 胞内生理生化变化是分生细胞分化的前提【3 扪。了解可溶性蛋白、抗氧化物酶活性及其同工酶、 多糖、核酸等在组织培养过程中的变化，有助于了解组织培养过程中的动态变化，为高效率 进行植物愈伤组织诱导和分化提供理论上的参考。 1 4 1 可溶性蛋白变化 在植物组织培养过程中，外植体脱分化、再分化过程是受基因调控的，是基因在组织培 养过程中特定时期表达的结果，而基因表达的产物以蛋白质的形式表现，因此在外植体脱分 化、再分化过程必会有蛋白含量的变化，以及特异蛋白的出现和消失【3 6 】。特异蛋白的出现或 消失与细胞的功能和愈伤组织的形态建成关系密切。因此，特异蛋白对筛选胚性细胞和组织， 了解细胞脱分化、再分化过程中基因活动的规律是十分有用的。因此，对植物体细胞的器官 6 第1 章文献综述 I I I 曼暑曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼! ! 曼曼曼曼量曼曼皇曼寰皇曼曼曼舅曼曼量曼曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼皇曼曼皇 发生途径过程中特异性蛋白质的研究具有十分重要意义。 有关愈伤组织形成和分化过程中可溶性蛋白质含量和组分的变化已有大量的研究报道， 尽管结果不尽相同，但变化的趋势相近，一般认为愈伤组织分化过程中蛋白质的合成动态大 致成S 型。王亚馥等( 1 9 8 9 ) 【”】在对枸杞叶片组织培养规程中可溶性蛋白含量的研究中发现，外 植体接种培养基后，可溶性蛋白的含量逐渐降低，愈伤组织形成时含量增加，在愈伤组织分 化前又下降，而在愈伤组织形态建成时达到最高峰，之后又下降，呈现S 型。 刘本叶等( 1 9 9 5 ) 【3 8 1 在对非洲紫罗兰叶片脱分化的研究中发现，在有激素的培养基上外植体 在脱分化过程中，可溶性蛋白含量显著下降，没有激素的培养基上可溶性蛋白含量上升，推 测不能脱分化的外植体中原有的蛋白继续合成，但蛋白性质没有改变，不能促进细胞分裂， 外植体不脱分化，因此，外植体脱分化前，必须分解原有蛋白，合成新的蛋白，并且蛋白性 质发生改变，以促进细胞分裂，由此认为，细胞脱分化过程中可溶性蛋白含量下降是其脱分 化的标志。可溶性蛋白含量的变化在一定程度上反映了基因表达的变化，由此可推测在愈伤 组织诱导期可溶性蛋白含量的增加可能暗示在这一阶段正进行着活跃的基因表达，为愈伤组 织的出现进行生理生化上的物质贮备。 刘世琦等( 2 0 0 2 ) 【3 9 】认为在植物可溶性蛋白中含有5 0 以上的酶蛋白，因此可溶性蛋白含量 越高，细胞内代谢活动就越强。曾l a ) j ( 2 0 0 5 ) 1 4 0 】报道在金桔愈伤组织分化前，愈伤组织仍在进行 旺盛的细胞分裂，可溶性蛋白大量被消耗而处于低水平，当芽原基出现时，可溶性蛋白含量 开始上升，说明可溶性蛋白合成加快，为芽的形成准备物质基础，该上升一直持续到出芽时 达到峰值。说明在愈伤组织分化过程中，愈伤组织由增殖状态转向分化状态时需要的大量合 成蛋白质，由此认为可溶性蛋白含量峰值的出现是为愈伤组织的分化提供物质基础。 植物愈伤组织形成和分化过程中不仅存在蛋白质含量的变化，而且还存在特异蛋白的形 成，推测这些特异蛋白既可以作为调控因子，又可以作为结构蛋白、贮藏蛋白、酶蛋白起作 用【4 1 1 。 在细胞脱分化和再分化过程中，不同的特异性蛋白质可能作为不同的调控因子，发