指状青霉促分裂原活化蛋白激酶PdOs2基因功能研究-硕士论文

i 。 l ； 蔓 “ I j r l “ ； 柑橘绿霉菌促分裂原活化蛋白激酶P d O s 2 基因功能研究 论文作者签名： 陉墨醴 一一一一 指导教师签名： 荤纽茸一一 论文评阅人1 ： 评阅人2 ： 评阅人3 ： 答辩委员会主席： 委员l ： 委员2 ： 马忠华教授浙江大学 郑经武教授浙江大学 周国昌研究员浙江省农科院 宋凤鸣教授浙江大学 委员3 ：王荣洲高级农艺师浙江省植物保护检疫局 委员4 ： 楼兵干副教授 浙4 态掌 I l ll lI II IIII III lllI Il Y 18 5 19 0 9 F u n c t i o na n a l y s i so fP d O s 2 , am i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e g e n ef r o m P e n i c i l l i u md i g i t a t u m B y C h a n g s h e n gC h e n AD i s s e r t a t i o nS u b m i a e di nP a r t i a lF u l f i l l m e n to fR e q u i r e m e n t s f o rt h eD e g r e eo fM a s t e ro fS c i e n c ei nP l a n tP r o t e c t i o n S u p e r v i s e db yP r o f H o n g y eL i C o l l e g eo f A g r i c u l t u r ea n dB i o t e c h n o l o g y Z h e ji a n gU n i v e r s i t y H a n g z h o u310 0 58 ，P RC H I N A J a n2 0 11 本研究得到 现代农业产业技术体系建设专项资金资助 S u p p o r t e db yC h i n aA g r i c u l t u r e R e s e a r c hS y s t e m ( C A R S ) 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎婆盘鲎或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：障喜丹乏 签字日期：锄lf 年弓月l o E l 一 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：陈墨艘 导师签名： 签字日期：加年弓月，o 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 签字胁矽f ( 年7 月f ，日 电话： 邮编 浙江大学硕士学位论文 致谢 首先感谢导师李红叶教授三年来对我实验、生活、学习等方面的悉心指导以及培 养教育。从开始论文选题，实验设计到实验的实施以及论文的撰写、修改李老师都倾 注了大量的心血和智慧。导师学识渊博、治学严谨、求实创新、一丝不苟、勤奋积极、 不知疲倦的工作作风以及对科学事业的执着追求精神，对我的工作、学习、生活是一 种无形的感染。衷心祝愿我的导师事业更辉煌，实验室的明天更加优异! 怀着一种崇敬的心情来到浙大，来到华家池畔，在这里让我获取了知识，培养了 能力，更在这里让我收获了一份份难得的回忆。在三年的学习、生活中、实验中大家 一起努力，一起奋斗，一同进步，朝夕相处，结下了深厚的友谊。而今就要离开，就 要要踏上新的旅程，往事一幕幕在心中涌起。感谢大师兄王继业，师姐蔺凌云，师兄 陈国庆，陈广进。感谢一起奋斗，并肩作战的园园、兴红，一起陪我分享实验的成功 与失败、欢喜与痛苦。另外，我要深深感谢我的p a r t n e 卜杩丹，感谢你在我生活中的 鼓励与帮助。谢谢你们：朱丽、孙学鹏、黄峰、许谦、侯欣、许雯婷、陈佑源、游攀、 罗艳岚、孙飞洲对我的帮助与鼓励。 衷心的感谢感谢生物所同学严蕾艳、刘馨师姐、黎飞、臧宪鹏师兄、庄飞龙、陈 国庆同学及陈燕芬师妹对我实验的帮助。特别感谢马忠华、王小红及小余老师对我实 验的帮助。 向参加论文评阅，评议及答辨委员会的专家、教授致以诚挚的谢意! 陈昌胜 2 0 1 1 年1 月1 5 日 华家池 浙江大学硕士学位论文 目录 致谢I 摘要1 1 ， A b s t r a c t V I 第一章文献综述和本研究的意义一l 1 1 柑橘绿霉病及其化学防治1 1 2 双组份信号系统和H o g l 信号传导途径2 1 2 1 双组份信号系统- 2 1 2 2M A P K 信号模块3 1 3 双组份信号系统和H o g l 信号转导途径的功能4 第二章柑橘绿霉菌P d O s 2 基因的克隆、突变体的构建和功能研究6 2 1 材料和方法6 2 1 1 菌株及其培养。6 2 1 2 分子生物学方法及质粒载体。7 2 1 3 本实验中所使用的引物序列8 2 1 4 2 基因和e D N A 序列的克隆9 2 1 5 2 敲除载体的构建1 0 2 1 6P d O s 2 基因回补载体的构建1 2 2 1 7A T M T 法转化柑橘绿霉菌13 2 1 8 突变体的筛选及鉴定14 2 1 9 该基因对柑橘绿霉菌生长速率的影响1 7 2 1 1 0 病原菌在环境胁迫过程中的作用1 7 2 1 11P d O s 2 基因对氟咯菌腈和异菌脲敏感性的影响研究；1 8 2 1 1 2 致病性比较1 8 2 2 结果与分析1 9 2 2 1P d O s 2 基因的克隆和序列分析1 9 2 2 2P d O s 2 基因敲除和回补载体的构建2 2 2 2 3 朋仇2 基因敲除及过表达突变体的筛选及验证2 3 2 2 4P d O s 2 基因参与生长和孢子形成过程2 5 2 2 5 胁2 基因参与渗透压调节过程2 8 2 2 6 腑2 基因参与杀菌剂氟咯菌腈和异菌脲的敏感性2 8 2 2 7P d O s 2 基因在致病中的作用3l 2 3 结果和讨论3l 第三章双组份和H o g 信号途径M 材、船七2 、彳卿基因的克隆与缺失突变体构建3 4 3 1 材料和方法3 4 3 1 1 菌株及其培养3 5 3 1 2 分子生物学方法及质粒载体3 5 3 1 3P d N i k A 、P d S s k 2 、P d A l 7 么基因的克隆3 5 3 1 4 凡j 翩基因的突变体构建和农杆菌转化3 6 3 1 5 凡融船基因的缺失载体构建和突变体获得3 8 浙江大学硕士学位论文 3 1 6P d A 私基因的载体构建和突变体获得4 0 3 2 结果与分析4 1 3 2 1 凡f 翩基因的克隆、序列分析4 2 3 2 2 凡撕M 基因敲除及过表达突变体的筛选及验证4 3 3 2 4 尸掘七2 基因的克隆、序列分析和突变体获得4 4 3 2 3p 姒o A 基因的克隆、序列分析和突变体获得4 7 3 3 结果和讨论5 0 参考文献5 3 I I I 浙江大学硕士学位论文 摘要 由Pd i g i t a t u m 引起柑橘绿霉病是最重要的柑橘产后病害。采后药剂处理依然是 柑橘绿霉病防治的最重要手段。苯基吡咯类( p h e n y l p y r r o l e s ) 杀菌剂氟咯菌腈 ( f l u d i o x o n i l ) 最近在美国登记使用在柑橘产后病害防治上，但其作用机制尚不明确， 从模式真菌和一些植物病原真菌的相关研究结果看，氟咯菌腈极有可能通过干扰影响 病菌甘油合成的双组份( t w o c o m p o n e n ts y s t e m ) 和高渗透压甘油途径( h i g ho s m o l a r i t y g l y c e r o lr e s p o m ep a t h w a y ，H o g lp a t h w a y ) 。因此我们选择柑橘绿霉菌H o g l 信号传递 途径的关键性元件M A P K 激酶( m i t o g e na e t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) P d O s 2 基因进行功 能分析。并对该信号途径中的双组分组氨酸激酶N i k 4 基因、M A P K K K 激酶彪、转 录调控因子么织基因进行了基因克隆和缺失突变体构建工作。 通过兼并性引物P C R 扩增并结合T a iI - P C R 技术从柑橘绿霉菌中获得了与脉胞菌 ( N e u r o s p o r ac r a s s a ) M A P K 基因O s 2 同源的M A P K 基因序列，称之为P d O s 2 。该序 列包括其上游启动区和下游终止区在内的4 2 4 7 b p 核苷酸。通过e D N A 扩增测序和 D N A m a n 软件分析，发现该序列包含一个长度为1 6 0 4b p 开放阅读框( O R F ) ，9 个外显 子和8 个内含子。内显子长度分别为8 6b p 、7 3b p 、5 2b p 、5 5b p 、5 4 b p 、6 0b p 、 6 0b p 和5 7b p ，分别位于在5 6 1 4 3 b p ，1 9 0 2 6 4b p ，3 9 3 - 4 4 6b p ，4 8 9 5 4 5b p ，6 4 4 - 6 9 9 b p ，1 0 5 5 1 1 1 6b p ，1 1 9 4 1 2 55 b p ，1 4 3 8 1 4 9 6b p 之间。预测编码3 6 8 a a ，P I 为5 1 6 ， 分子量为4 2K D 的蛋白。对推导的P d O s 2 序列比对搜索表明，P d O s 2 与灰葡萄孢菌 ( B o t r y t i sc i n e m a ) 的B c S A K l ，稻瘟菌( M a g n a p o r t h eg r i s e a ) 的O s m l ，以及A l t e r n a r i a a l t e r n a t e 的A a H O G l 分别由有9 0 、9 2 和9 1 的一致性。典型的O s 2 蛋白保守性 结构域T G Y 存在于1 7 3 1 7 5 位氨基酸上。 为了研究P d O s 2 基因的功能，我们通过农杆菌介导的遗传转化体系构建了P d O s 2 的缺失突变体；比较了缺失突变体在生长，产孢，渗透压敏感新和杀菌剂氟咯菌腈及 异菌脲抗性方面与野生型菌株的差异。结果显示菌丝生长轻微下降，同时产孢能力受 到严重损伤，缺失突变菌株对渗透压的敏感性增强。此外病原菌致病性也有轻微的降 低。这些结果表明P d O s 2 基因参与病原菌生长，分化渗透压调节。杀菌剂氟咯菌腈可 能通过激活真菌H o g l 信号途径来发挥杀菌效果。 I V 浙江大学硕士学位论文 此外，我们还克隆了柑橘绿霉菌双组份H o g l 途径中的关键性基因：组氨酸激酶 基因N i k A 、M A P K K 激酶S s k 2 基因、转录调控因子彳拙基因的全长序列。并构建获 得了它们的缺失突变体，为进一步研究该信号传递途径奠定了一定的基础。 关键词：柑橘绿霉菌( P e n i c i l l i u md i g i t a t u m ) ，促分裂原活化蛋白激酶( M A P K ) ， 氟咯菌腈，渗透压调节，致病性 V 浙江大学硕士学位论文 A b s t r a c t 户d i g i t a t u mi s t h em o s td e v a s t a t i n gp a t h o g e no fc i t r u sf i u i t , b e i n gr e s p o n s i b l ef o r a b o u t9 0 o fp r o d u c t i o nl o s s e sd u r i n gp o s t - h a r v e s th a n d l i n g F l u d i o x o n i l ，ap h e n y l p y r r o l e f u n g i c i d e ，r e c e n t l yr e c e i v e df e d e r a lr e g i s t r a t i o nf o rp o s t h a r v e s tu s eo nc i t r u si nt h eU S B u t i t sa n t i f u n g a lm e c h a n i s mi su n c l e a r R e l a t e dr e s e a r c hf r o mm o d ef u n g ia n dc e r t a i np l a n t p a t h o g e n i cf u n g is h o w e dt h a tf l u d i o x o n i l i s e x t r e m e l yl i k e l y t oi n t e r f e r ew i t ht h e t w o c o m p o n e n ts y s t e m h i g ho s m o l a r i t yg l y c e r o lr e s p o n s ep a t h w a y( H K - H o g 1 ) T h e r e f o r e ，i na l la t t e m p tt os t u d yt h ea n t i f u n g a lm e c h a n i s mo ff l u d i o x o n i li nP d i g i t a t u m ， w ec l o n e dt h ec r i t i c a lg e n eP d O s 2o ft h eH o g ls i g n a l i n gp a t h w a y sa n da n a l y s i si t s f u n c t i o n T h es e q u e n c e ( 4 2 4 7 b p ) i n c l u d i n gt h eP d O s 2c o d i n gr e g i o n , a sw e l la si t su p s t r e a m a n dd o n s t r e a mw a sc l o n e db yu s i n gt h em e t h o do fd e g e n e r a t ep r i m e rf o l l o w e db yT a i l - P C R S e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h eP d O s 2c o n t a i n e da no p e nr e a d i n gf r a m eo f10 7 6b p ， i n t e r r u p t e db y8i n t r o n so f8 6 b p ，7 3 b p ，5 2 b p ，5 5 b p ，5 4 b p ，6 0 b p ，6 0 b p ，a n d5 7 b p ，l o c a t e da t p o s i t i o n sb e t w e e n5 6 b pt o1 4 3 b p ，1 9 0 b pt o2 6 4 b p ，3 9 3 b pt o4 4 6 b p ，4 8 9 b pt o5 4 5 b p ，6 4 4 b p t o6 9 9 b p ，1 0 5 5 b pt o1 1 1 6 b p ，1 1 9 4 b pt o1 2 5 5 b p ，a n d1 4 3 8 b pt o1 4 9 6 b p ，r e s p e c t i v e l y T h e d e d u c e dP d O s 2 pc o n s i s t e do f3 6 8a m i n oa c i d s ，w i t ha l le s t i m a t e dm o l e c u l a rm a s so f4 2 k D a a n dap Io f5 16 A l i g n m e n to fp u m t i v ea m i n oa c i d es h o w e dt h a tP d O s 2W a sh i g h l yi d e n t i t y t ot h es e q u e n c e so fB o t r y t i sc i n e m aB c S A K l ( 9 0 ) ，M a g n a p o r t h eg r i s e aO s m l ( 9 2 ) a n d A l t e r n a r i aa l t e r n a t eA a H O G l ( 9 1 ) M o r e o v e r , s e q u e n c ec o m p a r i s o no f P d O s 2w i t ho t h e r M A Pk i n a s e sr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fa l lc h a r a c t e r i s t i cc o n s e r v e ds u b d o m a i n s ，i n c l u d i n g t h ed u a lp h o s p h o r y l a t i o ns i t eT G Ya tp o s i t i o n s17 1 t o17 3 I no r d e rt os t u d yt h ef u n c t i o no fP d O s 2 , t h eP d O s 2d i s r u p t e dm u t a n t sa n di t s c o m p l e m e n tm u t a n t sw e r ec r e a t e db yt h em e t h o do fA g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ( A T M T ) ，a n dt h e i rg r o w t h , s p r o l a t i o n , s e n s i t i v i t yt oh i g ho s m a t i cs t r e s sa n d f u n g i c i d ei p r o d i o n ea n df l u d i o x o n i l ，a sw e l la L sp a t h o g e n i c i t yw e r ec o m p a r e dw i t l lt h e i r p a r e n t a li s o l a t eP d 0 1 T h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em y e i l i a lg r o w t hw a si m p a i r e ds l i g h t l y , V I 浙江大学硕士学位论文 w h e r e a si t s s p o l i a t i o nW a sb l o c k e de x t r e m e l ya sP d O s 2W a sd i s r u p t e d T h eP d O s 2 d i s r u p t i o nm u t a n t s ( A O s 2 ) e x h i b i t e di n c r e a s e ds e n s i t i v i t yt oN a C I ，K C Ia n dD s o r b i t o l ， a n ds u c hi n c r e a s e ds e n s i t i v i t yw a sr e s t o r e db yr e i n t r o d u c i n gt h eP d O s 2g e n ei n t oA O s 2 I nc o m p a r i s o nt oP d O1 ，A O s 2e x h i b i t e dd e c r e a s e ds e n s i t i v i t yt of u n g i c i d e si p r o d i o n ea n d f l u d i o x o n i l I na d d i t i o n , t h ep a t h o g e n i c i t yo fPd i g i t a t u mP d 0 1W a si m p a i r e ds l i g h t l yo n c e P d O s 2w a sd i s p r u p t e d T h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tP d O s 2i si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no f v e g e t a t i v eg r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o n ，v i r u l e n c e ，a d a p t a t i o nt oh y p e r o s m o t i cs t r e s s A n dt h e f u n g i c i d e si p r o d i o n e a n df l u d i o x o n i lm o s tl i k e l ye x h i b i t e f u n g i c i d a le f f e c t st h r o u g h h y p e r a c t i v a t i o no faf u n g a lH o g ls i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y I na d d i t i o n ，t h ec r i t i c a lg e n e sH K - H o gl p a t h w a y , h y b r i dt w oh i s t i d i n ek i n a s eN i k A ， M A P Kk i n a s e k i n a s eS s k 2 ，T r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r yf a c t o r s 彳弘，i nH o gl s i g n a l i n g p a t h w a y sw e r ec l o n e da n dt h e i rd e l e t i o nm u t a n t sw e r ec o n s t r u c t e di n t h i ss t u d y S u c h w o r k sw o u l db ef a c i l i t et ot h ef u n c t i o ns t u d yo ft h e s eg e n e s K e y w o r d s ：P e n i c i l l i u md i g i t a t u m ；M A P K ；f l u d i o x o n i l ；o s m o t i cr e g u l a t i o n ；v i r u l e n c e V 第一章文献综述和本研究的意义 1 1 柑橘绿霉病及其化学防治 柑橘是世界上最大宗水果之一，是我国的第二大水果，我国是世界上第二大柑橘 生产国( 张玉等，2 0 0 7 ) 。由指状青霉( Pd i g i t a t u m ( P e r s ：F r ) S a c c ) 引起的柑橘绿霉 病是柑橘采后最重要的病害。在不用药处理前提下，常规年份因柑橘绿霉病引起的损 失可占柑橘产后病害损失的9 0 以上( 陈利峰等，2 0 0 1 ；陈国庆等，2 0 0 6 ) 。该病菌只能 为害果实，引起果腐。病菌从伤口侵入，最初为水渍状软化，病部组织湿润柔软，用 手指按压病部果皮容易破裂。 目前，采后药剂处理依然是预防柑橘绿霉病的防治的最重要手段。但是，随着使 用时间的延长，抗药性菌系得以选择，其种群也随着施药的压力持续而不断扩大和扩 散，以致原有的药剂丧失应用价值，不得不开发和筛选新的药剂。因柑橘绿霉菌的抗 药性问题，生产上先后淘汰了邻苯酚( O P P ) 和邻苯酚钠( s o o P ) ，苯并咪唑类 ( b e n z i m i d a z o l e s ) 杀菌剂甲基硫菌灵( t h i o p h a n a t e - m e t h y l ) 、多菌灵( c a r b e n d a z i m ) 和噻苯唑 ( t h i a b e n d a z o l e ，T B Z ) 等在柑橘防腐中的使用( B u se ta 1 ，1 9 9 1 ；H o l m e sa n dE c k e r t ，1 9 9 9 ； K i n a ye ta 1 ，2 0 0 7 ) 。当今广泛使用的咪唑类杀菌剂抑霉唑( i m a z a l i l ) 和咪鲜胺 ( p r o c h l o r a z ) 已经受到了严峻的挑战( B u s e ta 1 1 9 9 1 ；S m i l a n i c ke ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 氟咯菌腈( f l u d i o x o n i l ) 是苯基吡咯类( p h e n y l p y r r o l e s ) 杀菌剂中的一个成员，业已证 明对M o n i l i n i as p 、B o t r y t i ss p 、R h i z o p u ss p 、P e n i c i l l i u ms p ，以及F u s a r i u ms p p 和 M u c o rs p 引起的采后水果腐烂有很好的防治效果( O l a y aa n dT a l l y , 2 0 0 4 ) 。此外，氟咯 菌腈杀菌谱广，使用剂量低，对哺乳动物毒性低。1 9 9 1 年氟咯菌腈在日本通过用于梨 果和蓝莓灰霉病防治的评估，1 9 9 8 年在美国登记用于核果采后病害的防治，2 0 0 5 年 已登记用于柑橘采后病害的防治，还计划着用于防治猕猴桃、梨果和番石榴病害的登 记( U SE P A ，2 0 0 4 a ) 。 但是，迄今有关氟咯菌腈的杀菌作用机制尚无一致的认识。从模式真菌和一些植 物病原真菌的相关研究结果看，氟咯菌腈极有可能通过干扰影响病菌甘油合成的双组 份和高渗透压甘油途径( t w o - c o m p o n e n ts y s t e ma n dt h eh i g h - o s m o l a r i t yg l y c e r o l ( H O G ) p a t h w a y ) 而发挥杀菌作用( J e s p e r sa n dD e w a a r d ，1 9 9 5 ；K o j i m ae ta 1 ，2 0 0 4 ；Z h a n ge ta 1 ， 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 2 ) 。最近，K a n e t i s 等( K a n e t i se ta 1 ，2 0 0 8 ) 定量柑橘绿霉菌比较田间氟咯菌腈敏感、 中抗和高抗菌株在氟咯菌腈处理和不处理条件下的甘油积累也支持这种假说。在扩展 青霉青霉中的研究也表明对氟咯菌腈高抗的4 个菌株都对渗透压敏感( L ia n dX i a o ， 2 0 0 8 ) 。推测氟咯菌腈的作用机制与渗透压的敏感机制相关。但是对氟咯菌腈确切作 用位点并不清。 1 2 双组份信号系统和H o g l 信号传导途径 ”所有病原菌都要感受和适应外界信号条件，而这些信号传递过程必然依赖一定的 信号途径才能完成相应的调整和适应过程。真菌中已经发现几种对不同环境胁迫做出 回应的信号传递机制。研究的比较清楚的有C A M P 循环信号途径( c y c l i cA M Ps i g n a l i n g p a t h w a y ) 、C a + 钙依赖磷酸酶途径、蛋白激酶C 有丝分裂激活蛋白酶途径和胁迫激活 H o g ( h i g ho s m o l a r i t yg l y c e r o lr e s p o n s e ) 途径( B a h ne ta 1 ，2 0 0 7 ；B r o w ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。其 中胁迫激活H o g 途径又有两个模块：一个是上游的双组份信号模块，另一个是下游的 有丝分裂原信号激酶( M A P K ) 模块( B a l m ，2 0 0 8 ) 。 1 2 1 双组份信号系统 双组份H o g 信号途径广泛存在于细菌、黏菌、真菌、植物中，在高等动物中尚未 发现，因此，被认为是杀菌剂的理想作用靶标0 3 a h n , 2 0 0 8 ；C a t l e Re ta 1 ，2 0 0 3 ；L i na n d C h u n g ，2 0 1 0 ；M a t s u s h i t aa n dJ a n d a , 2 0 0 2 ；T h o m a s o na n dK a y , 2 0 0 0 ) 。双组份信号模块主 要是通过感受和传递外界信号刺激，然后将信号传递激活下游的M A P K 信号通路 ( B a l ：l I l ，2 0 0 8 ) 。双组分信号转导系统有两种类型：一种是简单双组分系统，另一种是 杂合双组分系统。简单双组分系统由组氨酸激酶和应答调控蛋白组成。细菌和黏菌属 于这种类型( B a h i a , 2 0 0 8 ) 。杂合双组分系统由一个蛋白构成，该蛋白同时含有组氨酸 激酶核心区域和应答调节蛋白的接受区域。在病原真菌中，杂合型双组分系统是主要 的存在形式( C a t l e t te ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 真菌中典型的双组分系统由三部分组成：杂合型组氨酸激酶( h i s t i d i n ep r o t e i n k i n a s e ，H P K ) 、组氨酸磷酸运载体蛋白( h i s t i d i n e c o n t a i n i n gp h o s p h o t r a n s f e rH p t ) 和 应答调节蛋白( r e s p o n s er e g u l a t o rp r o t e i n ，R R ) 。组氨酸激酶由结构和功能上截然不同 的两部分组成：一个可变的N 端传感器区域( s e n s o rd o m a i n ) 和一个保守的C 端的激 2 浙江大学硕士学位论文 酶核心区域蛳ec o r ed o m a i n ) 。N 端传感器区域感受外界信号，结构是可变的，一 些激酶缺少传感器区域；而C 端的激酶核心区域具有高度保守序列，其中含有接受磷 酸基团的组氨酸位点。应答调节蛋白( R R ) 由N 端的接受区域和C 端的输出区域组 成。接受区域含有一个保守的天冬氨酸残基，该残基是接受磷酸化的位点。杂合型组 氨酸激酶通过感受外界环境变化，在组氨酸残基上发生自身磷酸化，自身磷酸化的组 氨酸残基再将磷酸基转移到同一个激酶的应答调控d o m a i n 的保守天冬氨酸残基上， 随后磷酸基被转移到中间转运蛋白H p t 上的组氨酸残基上，最终H p t 把磷酸基转移到 反应调节器的天冬氨酸残基上。磷酸基团传递到反应调节器而完成。而反应调节器通 常会作为转录因子，调控下游基因表达或者通过激活下游H o g l 的M A P K 模块( a a h n , 2 0 0 8 ；K o j i m ae ta 1 ，2 0 0 4 ；T h o m a s o na n dK a y , 2 0 0 0 ) 。 原核细胞和真核细胞在信号转导方面的一个主要区别就是真核细胞的传递需要 一个中间蛋白- H p t 。H p t 将磷酸基从组氨酸激酶的组氨酸残基上转移到应答调节蛋 白的保守天冬氨酸残基上。双组分信号转导利用不同的细胞内信号元件( 如促分裂原 活化蛋白激酶，环化核苷酸等) 进行细胞内信号转导。研究的比较清楚的是在酿酒酵 母中调控渗透压和氧化压的H 0 9 1 促分裂原活化蛋白激酶调控途径。有三种上游蛋白 参与H o g l 促分裂原活化蛋白激酶途径( H 0 9 1 - M A P K ) 的调控，包括跨膜的组氨酸 激酶S l n l p ，细胞质组氨酸磷酸转移蛋白( H p t ) Y p d l p ，应答调节蛋白S s k l p 。在非 逆境条件下，S l n l p - Y p d l p S s k l p 这个磷酸传递链可以传递磷酸基，但是磷酸活化的 S s k l p 不能激活H o g l - M A P K 途径中的S s k 2 p 。相反在逆境胁迫条件下，未磷酸化的 S s k l p 可以激活S s k 2 p ( H o h m a n n , 2 0 0 2 ；K r a n t z e ta 1 ，2 0 0 6 ；P o s a se ta 1 ，19 9 6 ) 。 1 2 2M A P K 信号模块 M A P K 信号模块主要由一些列的激酶构成。包括M A P K 、M A P Kk i n a s e ( M A P K K ) 、M A P K Kk i n a s e ( M A P K K K ) 等。在双组份H o g 传递过程中主要的传递过 程是因磷酸化或者脱磷酸化而被激活的反应调控器R R 可以与M A P K 信号模块的 S s k 2 ( M A P K K K ) 相互作用，使S s k 2 上S e r T h r 保守d o m a i n 暴露和释放出来，进而在 S s k 2 上的T h r 上发生自我磷酸化反应。因磷酸化反应而被激活的S s k 2 进而磷酸化P b s 2 类M A P K k 的S e r T h r 残基，从而激活P b s 2 类M A P K k 。P b s 2 被激活后，进而与H o g l 类M A P K 相互作用，使H 0 9 1 上T G Yd o m a i n 上的苏氨酸( T h r ) 和酪氨酸双重磷酸 浙江大学硕士学位论文 化( A l d o re ta 1 ) 。双重磷酸化激活的H o gl 进而进入细胞核调控( B a h n , 2 0 0 8 ) 。 在粗糙脉胞菌( N e u r o s p o r ac r a s s a ) 中，H o g 信号途径由O S - 1 ( h i s t i d i n ek i n a s e ) ， 0 S - 4 ( M A P K Kk i n a s e ) ，0 S - 5 ( M A P Kk i n a s e ) ，和O S - 2 ( M A Pk i n a s e ) 等参与渗透压敏感 性相关的基因构成( C h a n ga n dK a r i n , 2 0 0 1 ；N o g u c h ie ta 1 ，2 0 0 7 ) 。该信号传递的结果是 使O S 2 蛋白上的T G Y 结构域的络氨酸和苏氨酸被二重磷酸化，磷酸化的O S 一2 基因 进一步去调控与甘油表达相关的基因( C h a n ga n dK a r i n , 2 0 0 1 ) 。在& c e r e v i s i a e 中该信 号途径可以被上游的两个支路所激活。在非常高的渗透压胁迫条件下通过s i n 起始的 信号途径激活，该途径是位于其上游的双组份组氨酸信号途径，包括跨膜的组氨酸激 酶S l n l p ，细胞质内的组氨酸磷酸转移蛋白( H p t ) Y p d l p ，应答调节蛋白S s k l p 。然 后通过M A P K k k 类激酶S s k 2 p 或S s k 2 2 p 激活下游的P b s 2 。在不太高的渗透压胁迫下 通过通过在S h o l 或M s b 2 、C d e 4 2 、S t e 5 0 或S t e 2 0 、S t e l l 间的信号传递激活P b s 2 ( P o r t e r a n dW e s t , 2 0 0 5 ；S a i t oa n dT a t e b a y a s h i ，2 0 0 4 ；Z h a oe ta 1 ，2 0 0 7 ) 。在青霉近缘种构巢曲霉 ( A s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) q 已研究的组分包括杂合型组氨酸激酶H y b r i dH K ( N i k l 、T c s A 、 T c s B 、F p h A ) ；组氨酸转运蛋白( h i s t i d i n ep h o s p h o t r a n s f e rp r o t e i nY p d A ) ；应答调控蛋 白( r e s p o n s er e g u l a t o rS s k AS r r A ) ；M A P K K K ( S s k B ) ；M A P K K ( P b s B ) ；M A P K ( S a k A H o g A ) ，另外在构巢曲霉基因组中还有尚未研究的1 1 个组氨酸激酶类基因 ( B a h n , 2 0 0 8 ；C a t l e t te ta 1 2 0 0 3 ) 。 1 3 双组份信号系统和H o g l 信号转导途径的功能 在病原真菌中双组份和H o g 信号途径有着非常广泛的功能，参与调控各种外界刺 激反应包括渗透压剧烈刺激、紫外照射、氧化压和重金属胁迫、高温。还参与生长、 形态构成、分化、病原菌毒力、次生代谢、病原菌对苯基吡咯和二甲酰亚胺类的抗药 性等重要过程( B a h n , 2 0 0 8 ；B i l s l a n de ta 1 ，2 0 0 4 ；F u n l k a w ae ta 1 ，2 0 0 5 ；W a r m k ae ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。在B D 鲫t sc i n e m a 中，双组份和H o g 信号途径中已克隆研究了三个重要元件， 双组份组氨酸激酶b o s J 基因失活后，病原菌对氟咯菌腈产生抗性，对高渗透压敏感； 同时对蚕豆叶片和马铃薯叶片的致病性降低，尚失分生孢子的产孢能力( V i a u de ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。B o t r y t i sc i n e m a 的酵母菌H 0 9 1 的同源基因b c s a k I 缺失导致病原菌生长力和致 病性显著受损伤，不能侵染未受伤的植物组织；同时不能形成分生孢子( S e g m u l l e r e ta 1 ， 4 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 7 ) 。最近的研究表明：b