中药材中5种特殊农药的残留分析方法研究-硕士论文

浙江大学硕士学位论文 M a s t e rD i s s e r t a t r i o n A N A L Y S I So fF I V ES P E C I A LP E S T I C I D ER E S I D U E Si n C H I N E S EH E R B A LM E D I C I N E S M a s t e rc a n d i d a t e ：W a n gT i a n y u S u p e r v i s o r ：A s s o c i a t eP r o f e s s o r W uJ i a l u n I n s t i t u t eo fP e s t i c i d e & E n v i r o n m e n t a lT o x i c o l o g y 一- C o l l e g eo f A g r i c u l t u r e & B i o t e c h n o l o g y Z h e j i a n gU n i v e r s i t y , H a n g z h o u ，C h i n a J a n u a r y , 2 0 1 1 IIl!，i 分类号： 密级： 1 1 1 111T Ir il lI r1 1 1 11IIl Y 18 5 18 8 8 单位代码：! Q 三三5 研究生学号：2 Q 墨! 鱼1 2 3 中药材中5 种特殊农药的残留分析方法研究 答辩委员会主席：割维屋数援浙江太堂巫资堂院 答辩委员会成员：隧建明研究旦逝迤省盔型暄 旌塑堡数握逝江太堂壅生堂院 虞云蕉麴援逝江太堂盔生堂院 论文评阅人：瞳鱼适 塾援上瀣交通友堂壅堂瞳 鄞：睑塍圭堡虫药! 亘植趔直药品捡验压 黄国注硒究员逝江省壅药捡定筻理压 本研究受下列资金资助： 国家重大科技专项课题“重大新药创制新药研究开发关键技术研究中药中农药残留、重金 属检测与分析关键技术研究”( 2 0 0 9 Z X 0 9 5 0 2 0 2 7 ) 。 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝逛太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：壬天玉 签字日期：功J J 年；月堙日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝塑太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文i ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)。 学位论文作者签名：王天，玉 导师签名： 签字日期：加年乡月移日 签字日期：，。，年岁月22 日 浙江大学硕士学位论文 摘要 中药材中农药超标问题，日益受到人们的关注，它不仅危害广大人民群众的 身体健康，同时也影响到中药材进入国际市场，研究出简单、快速、准确、有效 的农药残留分析方法，是保证药材质量、促进药材出口急需解决的问题。本文对 多菌灵、杀虫双、代森锰锌、草甘膦和咪酰胺等几种农药在1 0 0 多批次的中药材 进行了残留分析方法的研究。主要内容如下： 1 建立了一种测定白芍、麦冬、黄芪、三七、红参、浙贝母、山茱萸、白术、 黄芩、元参、金银花、杭白菊、人参、西洋参、黄连、丹参、白茯苓、山药、元 胡、赤芍等2 0 多种中药材中多菌灵残留的反相高效液相色谱分析方法( R - H P L C ) 。 样品经丙酮提取，柱层析( 弗罗里硅土：中性氧化铝= 7 ：4 ，质量比) 和液液分 配净化，以甲醇一水( 体积比为6 0 ：4 0 ) 为流动相，在波长2 8 1n m 对待测组份进 行检测，外标法定量。结果表明，多菌灵在这些中药材中的添加回收率为： 7 0 6 - 9 8 3 ，相对标准偏差( R S D ) 为0 5 - 9 1 ；该杀菌剂在0 0 5 1 0m g L 之间 具有良好的线性关系，r = O 9 9 9 4 ，方法的最低检测浓度元参和杭白菊为 0 0 1 m g k g ，其它均为0 0 5m g k g 。方法简单易行，净化效果较好，适合各种中 药材中的多茵灵残留检测。 一 2 建立了一种测定人参、西洋参、玄参、麦冬、温郁金、积雪草、黄姜片、何 首乌、柴胡、白茯苓、浙贝母、白菊花、山药、莪术、甘草、刺五加、蒲公英、 黄连、当归、丹参、红参、白芍、铁皮枫斗等药材中代森锰锌农药残留量的顶空 进样气相色谱法( F P D S ) 。在装有样品的顶空反应瓶中加入H C l S n C l 2 溶液，在 8 0 反应1 2 0 m i n 后，进样检测，以二硫化碳量表示代森锰锌残留量，保留时间定 性，外标法定量。结果表明：代森锰锌在这些中药材中的添加回收率为： 7 4 6 - 1 0 2 6 ，相对标准偏差( R S D ) 为0 6 1 3 3 ；该杀菌剂在0 5 - 1 0m g L 之间 具有良好的线性关系，r = O 9 9 8 4 ，方法的最低检测浓度为0 2 m g k g 。 3 建立了一种测定白芍、浙贝母、薏苡仁、甘草、山药、板兰根、人参、莪术、 丹参、柴胡、白菊花、金银花、黄芪、麦冬、防风、白茯苓、山楂、党参、当归、 黄连、蒲公英等药材中杀虫双残留的气相色谱法( E C D ) 。在碱性条件下，可以 利用杀虫双在硫化钠和空气氧化的作用下转化为沙蚕毒素的特性，测定沙 蚕毒素的含量来表示杀虫双的量。结果表明：杀虫双在这些中药材中的添加回 收率为：7 2 6 - 1 0 2 8 ，相对标准偏差( R S D ) 为0 5 - 9 6 ；该杀虫剂在O 5 - 1 0m g L 之间具有良好的线性关系，r = O 9 9 9 8 ，方法的最低检测浓度为0 0 5 m g k g 。 4 建立了一种测定白芍、浙贝母、薏苡仁、白茯苓、山药、西红花、刺五加、莪 术、甘草、覆盆子、积雪草、黄姜片、玄参、防风、长春花、西兰花、何首乌、 浙江大学硕士学位论文 白菊花、板兰根、黄芪、金银花等药材中草甘膦农药残留量的分析方法( N P D ) 。 样品经去离子水提取，二氯甲烷液一液分配，过C 。8 J 、柱净化后吹干，与T F A A 和T F E 反应，然后检测反应物。结果表明：草甘膦在这些中药材中的添加回收率为： 6 8 7 - 1 0 7 7 ，相对标准偏差( R S D ) 为0 4 - 7 8 ；该除草剂在0 0 5 - 1 0m g L 之间 具有良好的线性关系，r = O 9 9 8 7 ，方法的最低检测浓度为0 0 5 m g k g 。 5 建立了一种测定人参、白术、板兰根、莪术、山药、山楂、蒲公英、刺五加、 金银花、元胡、白茯苓、芦笋、防风、黄芪等药材中咪酰胺残留量的气相色谱分 析方法( E C D ) 。样品经过盐酸和丙酮提取，吡啶盐酸盐水解，浓硫酸净化，最后 以2 ，4 ，6 一三氯苯酚定性和定量。结果表明：咪酰胺在这些中药材中的添加回收率 为：7 6 6 - 1 0 5 2 ，相对标准偏差( R S D ) 为0 7 - 7 9 ；该杀菌剂在0 0 0 5 2 m g L 之间具有良好的线性关系，r = O 9 9 9 6 ，方法的最低检测浓度为0 0 0 5 m g k g 。 关键词：中药材，多菌灵，代森锰锌，杀虫双，草甘膦，咪酰胺，农药残留 I l 浙江大学硕士学位论文 目录 摘要I 目录I I I 第一章文献综述l l 中药材的发展现状与面临的挑战1 2 农药的残留分析方法研究进展。3 3 农药多菌灵、杀虫双、代森锰锌、草甘膦和咪酰胺的研究进展1 4 4 本论文研究的目的及意义1 7 第二章中药材中多菌灵残留量的检测方法高效液相色谱法1 9 l 范围一1 9 2 原理1 9 3 试剂和材料。：一l9 4 仪器和设备1 9 5 样品的采集与制备2 0 6 分析步骤2 0 7 结果计算21 8 方法检测限、回收率2l 9 与其对比的两个方法2 3 l O 结果与分析2 3 第三章中药材中代森锰锌残留量的检测方法气相色谱法3 2 l 范l 虱3 2 2 原理3 2 3 试剂和材料：3 2 4 仪器和设备3 3 5 样品的采集和制备3 3 6 分析步骤3 3 7 结果计算3 4 8 方法检测限、回收率3 4 9 结果与分析3 6 第四章中药材中杀虫双残留量的检测方法气相色谱法4 0 l 范围4 0 2 原理4 0 3 试剂和材料4 0 4 仪器和设备4 l 5 样品的采集和制备4 l 6 分析步骤4 1 7 结果计算4 2 8 方法检测限、回收率4 3 9 结果与分析。4 4 第五章中药材中草甘膦残留量的检测方法气相色谱法5 4 l 范围5 4 2 原理5 4 3 试剂和材料5 4 4 仪器和设备5 5 5 样品的采集和制备5 5 6 分析步骤5 5 7 结果计算5 6 I I I 浙江大学硕士学位论文 8 方法检测限、回收率5 7 9 结果与分析5 8 第六章中药材中咪酰胺残留量的检测方法- 气相色谱法6 9 1 范围6 9 2 原理6 9 3 试剂和材料6 9 4 仪器和设备7 0 5 样品的采集和制备7 0 6 分析步骤7l 7 结果计算7 2 8 方法检测限、回收率7 2 9 结果与分析7 4 第七章总结8 2 A b s t r a c t 8 6 参考文献一8 8 致谢9 7 I V 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 中药材的发展现状与面临的挑战 1 1 中药材的发展现状 我国中药材生产历史悠久，有关中药材及其种植的记载可追溯至U 2 6 0 0 多年以 前。贾思勰著齐民要术( 6 世纪4 0 年代) ，记述了地黄、红花、姜、栀子、桑、 胡麻、蒜等2 0 余种中药材栽培法；诗经( 公元前1 1 - - - 6 世纪中期) 记述了蒿、 芩、葛根、芍药等1 0 0 多种中药材；明代李时珍( 公元1 5 1 8 1 5 9 3 ) 在本草纲 目( 公元1 5 7 8 年) 这部医药巨著中，仅“草部”就记述了荆芥、麦冬等6 2 种中 药材为人工种植，为世界各国研究中药材种植提供了极其宝贵的科学资料。新中 国成立以来，我国的中药材产业得到了迅速恢复和发展，在改进栽培技术、引种 驯化野生药材、引进国外中药材以及规范化生产等方面都取得了重大进展，各地 积累了许多经验( 蔡小红，2 0 0 9 ) 。目前我国的药用资源总数达1 2 8 0 7 种，其中经 营药材1 2 0 0 多种，常用药材6 0 0 多种，年产量3 5 万吨( 甘师俊等，1 9 9 8 ) 。除其中 不足l 的矿物药材外，9 9 以上均为可更新的生物再生资源，尤以中药材为最， 占全部种数的8 7 ，涉及3 8 5 科，2 3 1 2 属，计1 1 1 1 8 种( 包括9 9 0 5 种、1 2 0 8 个种以 下单位) 。目前我国市场上流通的中药材中，主要依靠人工栽培的已达2 5 0 多种。 各地在生产中将中药材种植与当地的地理环境、民族传统、种植习惯相结合，形 成了具有鲜明特色的北药、南药、怀药、浙药、川药、云药等道地药材。 现代中药行业已将现代生产技术应用到传统中药领域形成的一种发展最活 跃、进展最快的行业之一，随着全球范围内“回归自然 浪潮的涌起以及人们对 化学药品毒副作用的深入认识( 任丽萍，2 0 0 8 ) ，国际市场对天然药物的重视程 度正在不断加强，发达国家对植物药品的态度已明显改变，对中成药的管制也已 开始出现松动的迹象，中药在整个医药行业中的地位和作用有扩大的趋势( 潘良 春等，2 0 0 8 ) 。2 0 0 9 年4 月，国务院公布国务院关于扶持和促进中医药事业发展 的若干意见，提出要坚持中西医并重的方针，充分发挥中医药作用，表明国家 对大力发展中医药态度坚决，从政策和舆论上为中医药的发展保驾护航。 其中产业化已经成为中药材的发展趋势，产业体系在发展中日益丰满，逐步 完善，可以说是日新月异。现在，国内专家们着眼于研究中药现代化标准化体 系的建立，促进科技成果转化，规范生产质量管理等方面的研究，已经取得初步 的进展，中国中药材产业已基本完成了G A P 、G M P 、G S P 等指标体系的改造，虽然 在这过程中出现了相当多的问题，但对中药材产业的升级起到了积极的作用，有 利于发展中药材产业化体系，提升行业规模。如北京同仁堂、江西汇仁制药、广 浙江大学硕士学位论文 州白云山中药厂等企业，纷纷投资建药材基地，与中药材规范化种植基地签订购 销合同。一些地区还涌现出一些中药材生产的经济合作组织，向农民提供种子、 技术及销售服务，这些经济合作组织的建立，对促进中药材发展起到了积极作用。 2 0 0 8 年我国中药企业已有近1 5 0 0 家，生产中成药品种9 0 0 0 余个，产业经济规模 突破1 0 0 0 亿元，中药产品出口总额超过1 0 亿美元( 新华社，2 0 0 8 ) 。 在实施“无公害食品行动计划”的过程中，把无公害农产品生产与中药材 G A P 基地建设有机结合起来，加大了中药材产地环境监测评价力度，突出抓好生 产全过程的质量跟踪管理，逐步推进无公害产品质量追溯制度，中药材产品质量 明显提高。河北省在无公害中药材生产管理中，积极推行标准化生产管理，实现 绿色无公害，按照国家中药材G A P 规范化生产标准，制定中药材无公害生产地方 标准，推动中药材生产向规范化和标准化发展，建设了安国、承德、巨鹿等l O 个基地，极大提高了中药材的质量。 总体来说，现在中药材产业的发展呈现出五个趋势：一是加强了对药源的质 量控制管理，成立中药材产业科研中心；二是中药材产业结构调整加快，企业市 场、品种结构发生巨大变化；三是中药材产业市场集中度进一步提高，但市场竞 争日益激烈；四是中药材产业将形成新的产业经营模式；五是国际资本将更多地 瞄准中药材企业。 _ - ， 1 2 中药材面临的挑战 随着人类疾病谱的改变和化学药品毒副作用的日益显现，人们崇尚返朴归 真，对于使用天然药物的兴趣日趋高涨，向传统医学回归已成为不可抗拒的历史 潮流，这给传统中医药的发展带来了新的契机。过去，世界上只有少数几个国家 承认中医药的合法地位，现在，欧共体对中草药有了新的统一立法；美国2 0 0 0 年成立了中医中药教育委员会，2 0 0 1 年建立了研究中国草药中心；澳大利亚及 东南亚各国也有新的举措；而日本、韩国、德国等国家在中草药开发研究的某些 方面已超过我国。面对这种严峻的形势，国家有关部门已制定战略和部署，加速 中医药学现代化的进程，迎合时代的发展潮流( 中国中医药学会，1 9 9 7 ) 。 据不完全统计，1 9 9 5 年我国中药生产企业9 4 0 家，中药材生产基地6 0 0 多 个，中药材种植面积5 8 0 万亩，产量3 5 万吨。然而，在国际市场上，中药出口 创汇仅1 0 亿美元( 其中中药材占7 1 9 ，其余为中成药及保健品) ，只占当年全 球草药贸易总额3 0 0 亿美元的3 ，与天然药材生产大国的地位极不相称。技术 缺失，药材质量不高，截至2 0 0 6 年底，全国共有4 6 家中药材企业通过中药材 G A P 认证，通过的品种仅3 9 个，不足常用药材的7 ，其中道地药材仅1 8 个，不 到道地药材的1 。种植、加工技术不规范，导致中药材质量不稳定，严重影响 其治病功效的发挥，从而阻碍了中药的出口( 薛健等，2 0 0 1 ) 。其中农药及重金 2 浙江大学硕士学位论文 属含量严重超标无法通过美国、日本、欧美等国有关药材的进口质量标准( 即绿 色屏障) 系主要原因( 李光耀等，2 0 0 9 ) 。这些影响了临床用药的安全性、有效 性、稳定性以及中药现代化的发展，与我国的中药材资源大国的地位不符。 中药材重金属污染比较严重，其中包括铜、铅、镉、汞、砷等，其毒性作用 在于重金属进入人体后与体内酶蛋白上的巯基和二硫键牢固结合( 张晖芬等， 2 0 0 4 ) ，从而使蛋白质变性，酶失去活性，组织细胞出现结构和功能上的损害， 导致不同类型的中毒性肾病、抗生育、骨质疏松及变形、神经系统损害、致突变， 甚至致癌等( 陈建存，2 0 0 0 ；王书林，一2 0 0 4 ) 。1 9 9 9 年，美国加州卫生署公布的 第一批2 6 0 种中成药的检测结果中有1 2 3 种存在违规和重金属污染问题，不合格率 高达4 7 。 据中国药典2 0 0 5 年版专项研修资料汇编报道，经对上海地区4 4 个品种1 6 7 批中药材和中药饮片的有机氯农药残留量检测发现，若以美国F D A 农药残留标准 为依据评价，则有1 5 的检测样品不合格，若以日本农产品农药残留标准为依据 评价，不合格率将达到8 5 。如浙麦冬中滴滴涕( 或同系物) 残留量较高，主要是 由于过去曾长期、大量使用滴滴涕、六六六，导致种植麦冬的部分土壤中滴滴涕 残留量高达1 6m g k g ( 吴加伦等，2 0 0 8 a ) _ ；有机磷农药情况也不容乐观，我国明 文规定禁止在中药材上使用的高毒品种“甲胺磷”，“对硫磷”检出率十分普遍， 有些还超过了允许残留标准( 吴加伦等，2 0 0 8 b ) 。所以要保证我国中药材生产的 “安全、有效、稳定、可控 ，必须要进行有关农药安全使用的技术研究，控制 农药残留量在允许标准以内，在保证产品的安全性和人民身体健康的同时，可以 减少农药的使用对环境造成的污染，保护生态环境，并提升中药材产品的总体质 量，提升我国中药材的国际竞争力，故中药材农药安全使用技术的研究成了中药 现代化的重要组成部分。 2 农药的残留分析方法研究进展 2 1 农药的前处理技术 农药在中草药中的残留、代谢，已成为农业、环保、卫生、药检、商检等部 f - J 年 4 研和监测的重要任务。要完成这些工作，就必须确立方便，快捷，经济，高 灵敏度，高效率的农药残留检测方法。但由于中药材样品组成成分比较复杂，如 一般含有生物碱、甙类、挥发油、鞣质、糖类、氨基酸、蛋白质、酶、油脂、蜡、 色素和无机成分。其成份还会因产地环境、气候条件、采收季节、时间不同而有 所变化。基质成分或许与目标物含量相差悬殊，或存在农药的同系物、异构体、 降解产物、代谢产物以及轭合物的影响。由于环境的迁移作用，环境中残留的各 种化学污染物也可能在农作物组织中蓄积，从而增加了中药材农药残留分析的难 浙江大学硕士学位论文 度。 样品前处理是农药残留分析的关键步骤，农药残留测定之前要有适合于各种 样品理化性质的提取、净化、浓缩等预处理步骤，样品前处理过程的好坏直接影 响整个分析结果的准确性。中药材样品中农药提取、净化等前处理方法有其特殊 性，对于不同性质样品中的不同目标物需要采用不同的前处理技术。 2 1 1 农药的提取方法 农药提取的目的在于从样品中将痕量的目标化合物提取出来，同时尽可能少 的提取干扰物质。这就要求我们首先要了解农药的理化性质和样品基质的成分， 然后结合一些前处理技术选择合理的方法。在选择提取溶剂时，应当根据“相似 相溶原理 选择和待测农药极性相近的溶剂，并且提取剂不能与样品发生反应， 毒性要低。对极性小的农药，可以用非极性溶剂来提取，也可用混合溶剂来提取： 对含水量较高的样品，如蔬菜、水果等，宜用极性溶剂。常用的提取剂有丙酮、石 油醚、甲醇、苯、乙酸乙酯、环己烷、二氯甲烷和三氯甲烷等。目前的提取方法 主要有索氏提取法、振荡提取、超声提取、微波法、固相微萃取法、基质固相分 散法、凝结法、加速溶剂萃取法、超临界流体萃取法，而且这些方法不断的朝着 省时、省力、廉价、减少溶剂用量等快速测定的方向发展( 吴春先，2 0 0 2 ) ，其 各有不同的特点： 2 1 1 1 索氏提取法 一 利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶 利萃取效率又高。萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触的面积。然后将固 体物质放在滤纸套内，置于提取器中，提取器的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶相连， 上面接回流冷凝管。加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管上升， 被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的最高 处时，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固 体物质不断为纯的溶剂所萃取、将萃取出的物质富集在烧瓶中。 索氏提取装置可以防止萃取溶剂在加热到沸点时的蒸发损失，但操作麻烦、 耗时长，有逐渐被替代的趋势，曾有报道用索氏提取法与超声波提取法对比测定 土壤中六六六残留( 杨伟球等，2 0 0 6 ) ，中药材中有机氯和拟除虫菊酯类农药的 多残留分析方法等( 吴加伦等，2 0 0 6 ) 。 2 1 1 2 震荡提取 振荡提取是一种非常常见的提取步骤，意义在于将样本混合均匀，大幅度加 大液体的流动性，从而提高提取效率，方法本身而言不对样本有多大伤害，如果 4 浙江大学硕士学位论文 对待些有内吸性农药的提取，回收率可能会受到影响，最常见的则是土壤中化 合物的提取( 刘素美等，2 0 0 1 ；朱广伟等，2 0 0 3 ；R u t t e n b e r gKC ，1 9 9 2 ) ，且 回收率较高。 2 1 1 3 超声波提取( U A L ) 超声波提取( U l t r a s o u n d a s s i s t e dl e a c h i n g ) ，亦称为超声波萃取 e U l t r a s o n i c W a v eE x t r a c t i o n ) 、超声波辅助萃取( U l t r a s o u n d a s s i s t e d e x t r a c t i o n ) ，是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效 应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动 频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行， 同时超声波的热效应使水温基本在5 7 ，对原料有水浴作用。与常规萃取技术相 比，超声波辅助萃取快速、价廉、高效。在某些情况下，甚至比超临界流体萃取 和微波辅助萃取还好( 谢振伟等，2 0 0 5 ) 。D A g o s t i n o 等( 2 0 0 5 ) 利用超声波提取 土壤中沙林、索曼，节约了时间和溶剂；邓延慧( 2 0 0 3 ) 在水样和土壤样中分别加 入二氯甲烷和丙酮，用超声波提取水样中敌敌畏等5 种有机磷农药。 一- 2 1 1 4 微波法( M A E ) 微波法在提取过程中具有反应高效性和强选择性等特点，而且操作简便，副 产物少，产率高及产物易提纯等优点。本法多用在药材的浸出上，它的原理是利 用磁控管所产生的每秒2 4 5 亿次超高频率的快速震动，使药材内分子间相互碰 撞、挤压，这样有利于药材有效成分的浸出。浸出过程中药材细粉不凝聚，不糊 化，克服了热水法易凝聚易糊化的不足。已经在环境化学分析、农药残留分析、 食品化学分析、药物分析、生物分析等领域得到广泛的应用，萃取对象包括有机 磷农药、除草剂、杀菌剂、邻苯二甲酸酯、杀虫剂、酚类化合物、甲基汞等。酚 类化合物、甲基汞等。D i a g n e 等( 2 0 0 2 ) 用H P L C 和E C G C 检测大豆中杀螟磷残留， 分别用索氏提取法和微波加热提取大豆中杀螟磷残留，两种提取方法的平均回收 率分别为8 8 4 ( S E ) ，8 9 8 ( M A E ) ，但是微波加热提取法可以大大节约时问和溶 剂。H oWH 等( 2 0 0 1 ) 利用M A E S P I E 联用技术对莪术、甘草及茯苓固体样品中残 余有机氯农药含量进行检测，检出限低于0 1 3 r i g g ，技术的重复性( R S D ) 低于 2 4 ，认为M A E 对待测物的提取效果具有良好的稳定性 2 1 1 5 固相微萃取法( S P M E ) 固相微萃取技术( S P M E ) 是一种集萃取、浓缩、解吸、进样于一体的样品前处 理新技术，该技术以固相萃取为基础，保留了其全部优点，摒弃了需要柱填充物 和使用有机溶剂进行解吸的弊病。S P M E 是以涂敷在纤维上的高分子涂层或吸附剂 浙江大学硕士学位论文 为固定相，通过吸附或吸收机理对目标分析物进行萃取和浓缩，并在气相色谱( G C ) 进样器中直接热解吸，进行分析检测，该联用技术只适合于挥发性和半挥发性有 机物的浓缩检测。随着S P M E 法与高效液相色谱( H P L C ) 、电泳( C E ) 、紫外光谱( U V ) 等检测仪器联用技术的实现，S P M E 法的应用范围将趋于更广。 固相微萃取装置类似于一支气相色谱的微量进样器，萃取头是在一根石英纤 维上涂上固相微萃取涂层，外套细不锈钢管以保护石英纤维不被折断，纤维头可 在钢管内伸缩。将纤维头浸入样品溶液中或项空气体中一段时间，同时搅拌溶液 以加速两相间达到平衡的速度，待平衡后将纤维头取出插入气相色谱汽化室，热 解吸涂层上吸附的物质。被萃取物在汽化室内解吸后，靠流动相将其导入色谱柱， 完成提取、分离、浓缩的全过程。由于S P M E 法具有样品用量少、对待测物的选择 性高、方便、快捷的特点，已成功地应用于气态、水体、固态中的挥发性有机物 ( V O C S ) 、半挥发性有机物以及无机物的分析。同时，S P M E 法可以对环境中的污 染物进行监测，如：农药残留( 魏立青等，2 0 0 4 ；耿星等，2 0 0 1 ) 、酚类、多氯联 苯( P C B S ) 、多环芳烃( P A H ) 、脂肪酸、胺类、醛类。 2 1 1 6 基质固相分散法( M S P D ) 将涂浸有C 1 8 等各种聚合物担体的固相萃取物与固体、半固体或粘性液体一 起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同极性的溶剂淋 洗柱子，将各种待测物洗脱下来、M S P D 较S P E 复杂，它将样品分散到整个柱中， 并与固定相、担体、淋洗溶剂都发生动态反应。 2 1 1 7 凝结法 提取物中的脂肪、蜡质、色素在低温下的丙酮溶液中沉淀析出而农药则留 在冷的丙酮溶液中，经过滤达到分离净化的目的。待净化溶液中加入一定量的凝 结剂( 氯化铵加磷酸) 。能使溶液中的蛋白质、脂肪、蜡质等干扰物质析出，经离 心后，可达净化目的，农药残留在此方面的应用比较少。 2 1 1 8 加速溶剂萃取法( A S E ) 加速溶剂萃取( A c c e l e r a t e dS o l v e n tE x t r a c t i o n ，A S E ) 是一种在升高温度 和压力条件下，增加物质的溶解度和溶质的扩散效率，提高萃取效率的自动化方 法。温度的升高能够打断溶剂与基质之间的作用力，使被溶物快速从基质中解析 出来。还能够降低溶剂的黏度，使之能更快速地萃取。压力的升高能够使溶液的 沸点增高。在较高温度下使溶剂保持液态，同时使溶剂进入基质微孔，与基质更 全面地接触。与传统的萃取方法相比，A S E 更方便、快速、溶剂用量少、回收率 高，其重现性与传统的索氏萃取和超声萃取相当。还避免了索氏萃取溶剂用量大、 6 浙江大学硕士学位论文 超声萃取所带来的多次清洗的问题，并能实现自动化控制。A S E 是一种全新的处 理固体和半固体样品的方法，可以萃取蔬菜、鱼肉、水果、茶叶和土壤中农药残 留。萃取的目标化合物包括有机氯、有机磷、拟除虫菊酯类农药等( 叶明立，2 0 0 3 ) 。 C h u a n g 等( 2 0 0 1 ) 用S F E 和A S E 从富含脂肪的儿童食品中提取马拉硫磷、滴滴涕、 毒死蜱3 种农药，经相同的C 1 8 - S P E 净化，G C M S 分析，S F E 的回收率低于5 0 ，优 化后A S E 的回收率均大于7 0 ，R S D d 、于1 0 。 2 1 1 9 超临界流体萃取法( S F E ) 超临界流体萃取( S u p e r i t i c a lF l u i dE x t r a c t i o n ，S F E ) 是近2 0 多年出现的 一种以超临界流体作为流动相的新型的分离技术。其原理是根据相似相溶原理， 在高于临界温度和临界压力的条件下，利用超临界流体的特性，从样品中萃取目 标物，当恢复到常压和常温时，溶解在流体中的成分立即以溶于吸收液的液体状 态与气态分开，从而达到萃取目的。目前被用于超临界流体的溶剂有乙烷、乙烯、 丙烷、丙烯、甲醇、乙醇、二氧化碳等物质，其中C 0 。是首选的萃取剂。其在低 温下具有较强的萃取能力，对于热敏感性强和复杂样品中微量组分萃取显示出它 的高效、快速、后处理简单等特性。其在低温下具有较强的萃取能力，对于热敏 感性强和复杂样品中微量组分萃取显示出它的高效、快速、后处理简单等特性。 S F E 过程中一般不用有机溶剂，从而减少对操作者和环境的危害( 李雪梅等，1 9 9 9 ； M D L u q u ed eC a s t r o 等，1 9 9 8 ；骆望美等，2 0 0 3 ) 。超临界C 0 2 的极性小，适宜 非极性和极性小的物质的提取。若要提取极性大的成分。则可以加人适宜的夹带 剂( 如甲醇、乙醇和水等) ，以提高对萃取组分的选择性和溶解性。如Z u i n 等( 2 0 0 3 ) 采用S F E G C E C D F P D 法，快速、经济、简便的对西藩莲花( P a s s i f l o r aa l a t a D r y a n d e r ) 及黄鸡蛋果( P a s s i f l o r ae d u l i sS i m s f f l v i c a r p aD e g ) 叶中的 有机氯和有机磷进行了测定，平均回收率为6 9 8 - 1 0 7 1 ，重现性R S D I 4 - 1 4 7 。 Z h a o ( 2 0 0 2 ；2 0 0 6 ) 等通过优化S F E 条件，在不影响当归及党参有效成份的含量下， 成功萃取分离出1 2 种有机氯。 2 1 2 提取液的净化 通过有机溶剂等从基质体中提取出目标化合物后，往往会不可避免的存在很 多干扰物质，不能直接进行检测。样品净化的目的在于有效的去除干扰物质，以 满足不同的色谱分析要求目前常用的净化方法主要有液液分配法、柱层析法、磺 化法、凝胶渗透色谱和固相萃取法等，它们各有自己的特点： 2 1 2 1 液一液分配萃取法( L L E ) 液一液分配是利用农药与杂质在不同溶剂中溶解度的差异。通常采用一种极 浙江大学硕士学位论文 性溶剂与非极性溶剂配成一溶剂对进行多次分配，使杂质与待测农药分离达到净 化目的，是目前比较常用的一种净化方法，但是受到乳化的限制，有待进步完 善。如赵维佳等( 2 0 0 4 ) 报道了采用固相萃取、液一液分配的提取净化方法，用 气相色谱仪一次测定小青菜中8 种有机磷的残留量；饶勇等( 2 0 0 3 ) 以乙酸乙酯 正己烷( 8 ：2 ，v v ) 提取，加无水硫酸钠及活性炭，经振荡、离心、浓缩后，用 乙腈和石油醚液液分配净化，经膜过滤，G C N P D 分析猪血浆、肌肉、肾脏、肝 脏及脂肪中二嗪农残留，方法最低检测限可达5 O n g g 。罗晓梅( 2 0 0 3 ) 用有机 溶剂提取蔬菜样品中伏杀硫磷农药，再经液液分配、微型柱净化等步骤除去干扰 物质，方法重现性好，准确、灵敏、无杂质干扰，数据准确可靠。 2 1 2 2 柱层析法 提取液中的农药与杂质一起通过一支适宜的吸附柱，使它们被吸附在吸附剂 上，然后用适当极性的溶剂来淋洗，农药一般先被淋洗出来，而脂肪、蜡质、色 素等杂质留在吸附柱上，从而达到分离净化的目的。一般分为正相萃取和反相萃 取：正相萃取就是极性萃取，目标物是带有极性官能团( 氨基、羧基、杂原子等) 的化合物，用极性吸附剂从非极性溶剂( 正己烷、油、氯仿等) 或中等极性有机 溶剂中萃取；反相萃取就是非极性萃取，目标物是带有非极性官能团( 芳香环、 脂肪链等) ，均可使用非极性吸附剂( C 1 8 、C 8 、p H 、C H 、C H - E 等) 从极性溶液 ( 水、缓冲液) 中进行萃取。常用的吸附剂有弗罗里硅土( F l o r i s i l ，也称硅镁 型吸附剂) 、氧化铝( 中性、酸性、碱性) 硅胶、硅藻土、活性炭、P S A 、G C B 等， 它们有各自的特点：弗罗里硅土吸附油脂的能力比较好，属于中等极性的吸附剂， 加入少许的氧化铝可以吸附更多的杂质，每次使用前在6 0 0 - 6 5 0 活化6 小时， 储存在干燥器当中，每次使用前1 3 0 烘4 个小时，并加入3 的水脱活，常用于 有机氯类农药的净化，也可用于低、中等极性的有机磷农药的净化( 谢明勇等， 2 0 0 3 ) ；中性氧化铝，属于强极性吸附剂，其处理方式和弗罗里硅土基本相似， 主要用来去除脂肪和蜡质( 庞艳华等，2 0 0 5 ) ；活性炭是一种非极性的吸附剂，对 极性强的物质吸附能力比较差，但对色素的吸附能力较好，尤其在有机磷农药方 面的应用( 王守箐，2 0 0 5 ) ；硅胶是一种非晶态的二氧化硅，空隙不同，则有不同 的吸附特点，属于强极性吸附剂，对糖有很强的吸附，便于净化，使用前需活化， 温度在1 0 0 1 1 0 ，烘1 0 个小时，之后加入5 水脱活；P S A 是一种与N H 2 基 相似的吸附剂，极性比N H 2 基稍弱，但有比N H 2 基更强的离子交换能力，可以与 金属离子产生螯合作用，用于提取金属离子，具有高的容量，同时还可以有效的 去除脂肪酸、有机酸、一些极性色素、糖盒脂类等，属于正相萃取柱；G C B 是一 种石墨化炭黑，在对含有胡萝卜素或叶绿素高的样品处理时，除了P S A ，还可加 入一定量的G C B ，由于G C B 对于具有平面结构的农药有很强的亲和力，其用量一 8 浙江大学硕士学位论文 定要控制，只要用肉眼能够观察到萃取液中的色素，C - C B 的用量就不会导致这些 农药明显的损失，否则可以加入适量的甲苯破坏这种吸附。 2 1 2 3 磺化法 利用脂肪、蜡质等杂质与浓硫酸的磺化作用，生成极性很大的物质与农药进 行分离。一般来说不会被浓硫酸分解的农药可用磺化进行净化，如茶叶中六六 六、D D T 等有机氯农药的残留分析用磺化法可以获得很好的净化效果( 赵云峰等， 1 9 9 9 ；李庆等，2 0 0 1 ；王会丽等，1 9 9 8 ；范广平等，1 9 9 6 ；田金改等，2 0 0 0 ；丛 晓东等，1 9 9 9 ；汪锡灿等，1 9 9 6 ；薛健等，2 0 0 3 ；李月茹等，2 0 0 2 ；赵春杰等， 2 0 0 2 ；李欢欣等，2 0 0 2 ；楼健等，2 0 0 1 ；乐巍等，2 0 0 2 ；马长清等，2 0 0 2 ) 。 2 1 2 4 凝胶渗透色谱( G P C ) 一 G P C 也被称为空间排阻色谱( S E C ) ，其原理是通过多孔性凝胶固定相，使得 样品中大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。G P C 以不同孔径的多孔凝胶 装柱，根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离，大分子的油脂、色素 ( 叶绿素、叶黄素) 、生物碱、聚合物等先淋洗出来，农药等相对分子质量较小， 后淋洗出，收集含有农药成分的洗脱液，再进行检测分析( ：P C 法的柱填料和被 分离试样没有任何相互作用完全靠分子自身的大小进行分离这种按体积大小，进 行分离的方式决定了G P C 技术可在温和条件下进行。因为没有可逆吸附，所以每 个适用G P C 分离的样品都能完全洗脱，G P C 柱性能可保持较长时间，能反复使用。 在用多残留分析法分析脂溶性、水溶性农药以及其代谢物时，G P C 可把所要分析 的农药从食品和饲料中分离、净化出来。B i o B e n d sS X 。作为G P C 柱填料，乙酸 乙酯一环已烷( 体积比1 ：1 ) 作为洗脱剂，收集6 5 m l 洗脱液后浓缩后的洗脱液直接 注人G C 中，用该法检测了9 0 种农药残留，可检测到n g m L 级有机氯农药。 S t e i n w a n d t e r 提出新的G P C 洗脱体系，采用环己烷一丙酮、丙酮一石油醚作为洗 脱剂，研究了1 0 0 多种农药的洗脱特征，保持了农药的定量回收，使用自动化 G P C 系统大大节约了时间和溶剂。该方法提取效率高、省时、经济，适用于常规 大量样品分析，已收录在美、英及欧洲药典中作为富集分析天然药用植物中农残 的方法( B r i t i s h ，1 9 9 6 ；T h eU S ，2 0 0 0 ；E u r o p e a n ，1 9 9 7 ) 。凝胶填料是G P C 具有分离作用的关键，目前主要有交联葡聚糖凝胶( S e p h a d e xL H - 2 0 ) 和交联聚苯 乙烯凝胶( B i o - B e a d sS - X ) ，其结构直接影响仪器性能及分离效果。G P C 在食品 及农产品农药残留检测上己广泛应用( 刘咏梅等，2 0 0 5 ) ，张健国等( 2 0 0 5 ) 使 用凝胶渗透色谱去除会沉积污染进样吸柱头的油脂及部分叶黄素，再以G C - M S 测 定玉米中三种农药的残留，回收率都高于9 0 ，检出限度为0 0 0 2 - 0 0 5 0 u g g 。 9 浙江大学硕士学位论文 2 1 2 5 固相萃取法( S P E ) 固相萃取( S o l i d P h a s eE x t r a c t i o n ，S P E ) 技术基于液一固相色谱理论，采用 选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相 和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。固相萃取 过程分为吸附和洗脱2 个部分。在吸附过程中，当溶液通过吸附剂时，由于吸附 剂对目标物质的吸附力大于溶剂的吸附力，因此目标物质被选择性地吸附在吸附 剂上进行了富集。在此过程中由于共吸附作用、吸附剂选择性等因素的存在，部 分干扰物也会在吸附床上吸附。吸附