微小RNA及其在医学中的应用.ppt

微小RNA及其在医学中的应用,一、微小RNA的发现,人类基因组中，蛋白质编码区只占1-2。其它98的基因组有什么功能呢？约24为内含子序列，这么冗长的内含子序列有什么生物学功能呢？,后基因组时代的中心法则,RNA加工,基因调节,DNA修复和重组,基因组的保持,基因组的表达,后基因组时代的基因调控：RNA调控,人类基因组绝大部分被转录成RNA非编码RNA的数量是编码RNA的数百倍生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内，而非编码序列内。,2006年的诺贝尔生理学奖获得者：,AndrewZ.FireCraigC.Mello,第一个被发现的miRNA(lin-4)由哈佛大学的VictorAmbros发现的（1993）第二个被发现的miRNA（let-7）由哈佛大学的博士后FrankSlack(Ruvkun实验室）发现的（2000),VictorAmbros,GaryRuvkun,微小RNA（microRNA,miRNA）的发现,第一个被发现的miRNA:lin-4,RuvkunG,WightmanB,HaI.The20yearsittooktorecognizetheimportanceoftinyRNAs.Cell.2004Jan23;116(2Suppl):S93-6.LeeR,FeinbaumR,AmbrosV.AshorthistoryofashortRNA.Cell.2004Jan23;116(2Suppl):S89-92,近年来被鉴定的miRNAs越来越多至今超过17000miRNAs已被发现可以免费获得http:/microrna.sanger.ac.uk/sequences/,二、微小RNA的特点,微小RNA的作用特点,主要是在蛋白质水平调控端-个核苷酸高度保守，主要作用在靶mRNA的端非翻译区（unstranslatedregion,UTR）分完全和不完全配对两种方式，哺乳动物主要为不完全配对结合，影响mRNA的成熟、转运、稳定性或者在直接调控翻译是翻译抑制还是剪切mRNA，除配对因素外，还取决于RISC中组装元件的功能，如Arg蛋白,小干扰RNA（smallinterferingRNA;siRNA）和微小RNA的异同点,siRNA和miRNA的相同点,三、微小RNA的主要功能,miRNA,发育增殖(干细胞),疾病,分化凋亡,VictorR.Ambros,秀丽线虫C.elegans,1.调控发育过程,miR-124a局限表达于神经组织miR-1局限表达于骨骼肌和心肌,青鳉,斑马鱼,小鼠,果蝇,miRNA的表达具有组织特异性,(Science2004),3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程,2.调控细胞分化,3.miRNAs与心血管疾病,（调控心肌前体细胞的增殖）,4、miRNA与病毒感染,miRNA与肝炎病毒,HCV,HBV,miRNA,基因表达,信号传导,肝细胞肝癌发生、发展,诊断、治疗,在肝炎模型中发现的肿瘤相关miRNA,HCV,HBV,has-miR-191,Worsesurvivalinacutemyeloidleukemia,p53tumorsupressorpathway,has-miR-34,has-let-7a,rasandc-mycgenes,has-miR-133b,Sequamouscellcarcinoma,has-miR-142-5p,Hematopoieticspecific,Normal,5.微小RNA与肿瘤的关系,微小RNA调控癌基因表达,下调miRNA表达，促进了E2F1的表达,WesternBlotting,NorternBlotting,有些微小RNA可能是致癌基因,mir-1792高表达,增加mir-1719b的表达，加速了c-myc诱导的淋巴瘤形成,miRNAs与肿瘤的关系,miRNA与疾病关系的研究策略,哪些miRNA表达,miRNA文库筛选,分离,克隆,测序,miRNA表达谱分析,哪些基因是miRNA的靶基因,哪些重要的miRNA影响到某种生命活动,miRNA在什么时候、在哪里表达,功能分析,治疗,诊断,(一)胃癌概述,胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。中老年发病较多，男女比例约2比1全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位。,四、微小RNA与胃癌的关系,(二)目前胃癌诊治的现状,早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。进展期胃癌，从症状出现到死亡，平均约1年。胃癌5年总生存率一般在10%左右。胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物,胃癌组织癌旁组织,总RNA提取,定量RT-PCR,miRNA芯片,细胞培养,MGC803,SGC-7901,组织类型细胞分化侵润深度TNM分期转移,生长曲线MTT定量PCR检测细胞周期凋亡检测靶基因分析,(三)技术路线临床研究体外实验功能分析,反义寡核苷酸阻断miRNA的表达,综合分析确定miRNAs可能的致癌机制,(四)胃癌组织中微小RNA的表达谱,芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNA,GuoJ,etal.JGastroenterolHepatol.2009,24(4):652-657,19种差异表达的微小RNA127miR-139-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达,高表达的微小RNA（miR-106a）与胃癌分期的关系,(五)临床病理因素分析结果,XiaoB,GuoJ,etal.ClinChimActa.2009;400(1-2):97-102.,miR-106a异常表达的临床意义,因素病例数变化倍数P直径5cm3068.59258.490.0015cm2514.6529.21分化中237.3615.480.001低2259.62299.13淋巴结转移+4650.69209.880.001-910.2420.52远处转移+9142.35414.600.001-4624.84107.37侵润T120.140.04T2266.0912.720.001T31750.49173.91=0.005T410140.69390.79,实时定量PCR结果,JiangC,GuoJ,etal.JournalofGastroenterology.DOI10.1007/S00535-009-0135-6,癌组织中mir-421的表达明显高于癌旁组织,体外实验结果,合成特异性微小RNA引物、用未转染肿瘤细胞中的对照，比较转染后癌细胞中微小RNA表达的变化,蒋振，郭俊明，等.中国病理生理杂志2009,25(9):1726-1730.,下调miR-421表达对胃癌细胞生长的影响,JiangC,GuoJ,etal.JournalofGastroenterology.DOI10.1007/S00535-009-0135-6,miR-421靶蛋白实验结果,筛选微小RNA匹配度最高的肿瘤相关靶基因、检测靶基因在蛋白质水平上的变化,JiangC,GuoJ，etal.JournalofGastroenterology.DOI10.1007/S00535-009-0135-6,胃癌相关微小RNA的功能研究肿瘤抑制基因Rb和PTEN分别受到miR-106和miR-21的调控;E2F1受到miR-17-92基因簇调控,免疫组化,RbPTENE2F1,癌旁癌,GuoJ,etal.JGastroenterolHepatol.2009,24(4):652-657,