银杏时黄酮积累相关基因克隆及查尔酮合成酶基因启动子功能研究-硕士论文

分类号： 曼鱼丝：3 密级：公珏 1 9 3 8 2 3 0 单位代码： ! Q Q 墨鱼 学号：垦2 Q Q 2 l 墨 银杏叶黄酮积累相关基因克隆及查尔 酮合成酶基因启动子功能研究 M o l e c u l a r c l o n i n gi m p o r t a n tg e n e si n v o l v e di nt h e a c c u m u l a t i v ep r o c e s sf o rf l a v o n o i d sa n df u n c t i o no f c h a l c o n es y n t h a s eg e n ep r o m o t e rf r o mG i n k g ob i l o b aL 学位申请人：李琳玲 指导老师：彭建营教授 学科专业：果树学 学位类别：农学博士 授予单位：河北农业大学 答辩日期：二。一O 年六月十三日 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 薏淞 签字日期： 7 , o o 年，月垆E l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：多席b 全 导师签名： 签字日期：伽，D 年月y F t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 签字日期：参。l 。年歹月f 中日 电话： 邮编： 摘要 为了深入研究银杏叶黄酮合成的分子机理，为今后利用生物技术手段提高银杏黄 酮含量奠定基础，本文从银杏中克隆并研究了与黄酮积累相关的几个酶基因：查尔酮 异构酶( G b C H l ) ，类黄酮3 羟化酶( F 3 卸，烯醇式丙酮基莽草酸3 磷酸合成酶( E P S P ) ， 肉桂酰辅酶A 还原酶( C C R ) 及查尔酮合成酶基因启动子( C H S P ) 序列。主要研究内容及 结果如下： ( 1 ) 银杏查尔酮异构酶基因( G b C H l ) 的克隆、性质及表达模式的研究。利用简并 P C R 和R A C E 技术从银杏叶片中克隆得到G b C H I 的e D N A 序列和基因组全长。通过 信息学分析发现，基因组G b C H I 含有两个内含子三个外显子，G b C H Ie D N A 全长为 9 2 6 b p ，含有一个7 3 5 b p 的开放式阅读框( O P t ) ，编码2 4 4 个氨基酸序列，预测分子量 为2 6 2 9 k D a ，等电点为7 7 6 。蛋白质同源序列分析表明，G b C H I 与T y p e I 型C H I 同 源性较高。C H I s 蛋白序列进化树分析结果显示G b C H I 未聚合到两类中，且分化时间 早于T y p e I 和T y p e l I 型C H I 。S o u t h e r nb l o t 分析表明，G b C H I 属于多基因家族；G b C H I 重组蛋白大肠杆菌表达显示，其蛋白大小与e D N A 序列预测蛋白大小一致，亲和层析 及W e s t e r nb l o t 分析显示，重组G b C H I 且含有6 x H i s 标签，G b C H I 能在大肠杆菌中 正常表达；重组G b C H I 酶活性分析表明，G b C H I 具有T y p e l 型C H I 的酶催化特点， 即催化6 羟基查尔酮生成( 2 S ) 黄烷酮；R T P C R 分析显示，G b C H I 基因在银杏不同 组织中都有表达，但存在较大差异，只有成熟叶和雄蕊中表达量最高。C H I 与银杏叶 黄酮含量的年周期变化分析显示，C H I 基因的转录水平与C H I 的酶活性呈线性相关， 相关系数为0 4 2 1 ；酶活性与黄酮的年周期变化之间也呈线性相关，相关系数为0 3 7 3 。 激素和胁迫诱导表达分析显示，虽然诱导表达模式不尽相同，但G b C H I 转录水平能 被U V B 、C C C 、A B A 、A L A 和E T H 诱导上调，而被G A 抑制表达；G b C H I 诱导表 达模式与银杏叶黄酮的调控变化相一致，暗示G b C H I 在银杏黄酮代谢过程中具有关 键酶作用。 ( 2 ) 银杏类黄酮3 羟化酶基因( G b F 3Y 刁的克隆、性质及表达模式研究。利用简 并P C R 和R A C E 技术从银杏叶片中克隆得到了G b F 3H 的e D N A 全长序列。通过信 息学分析发现G b F 3H 的e D N A 全长为2 1 4 4b p ，含有一个1 6 7 1b p 的开放式阅读框 ( O r e ：) ，编码5 5 6 个氨基酸序列。蛋白质同源序列分析表明，G b F 3 H 与其他物种F 3 H 同源性较低，而与菊苣( C i c h o r i u mi n t y b u s ) 同源性最高，为5 6 3 。同源建模分析 显示G b F 3 H 与P 4 5 0 家族蛋白的三维结构及活性位点高度相似，最终定位于微粒体 膜上。F 3 H s 蛋白序列进化树分析结果显示G b F 3 H 与其他植物分化较早。S o u t h e r n b l o t 分析表明，G b F 3H 属于多基因家族。G b F 3 H 重组蛋白大肠杆菌表达显示，其蛋 白大小与e D N A 序列预测蛋白大小基本一致，亲和层析及W e s t e r nb l o t 分析显示，重 组G b F 3 H 含有6 x H i s 标签，G b F 3 胃能在大肠杆菌中正常表达。R T P C R 分析显示， G b F 3 曰基因在银杏不同组织中都有表达，其中雄蕊表达水平最高，其次为成熟叶。 激素和胁迫诱导表达分析显示，虽然诱导表达模式不相同，但G b F 3W 转录水平能被 U V B 、6 - B A 、S A 、A B A 和诱导上调，而伤害处理对其表达量无明显改变。G 躺冒 诱导表达模式与银杏A N S 基因的表达模式相似，而且其上游调控序列也发现有相关 的调节单元，意味着该G b F 3 H 基因可能参与了银杏花色素的合成代谢。 ( 3 ) 银杏烯醇式丙酮基莽草酸3 磷酸合成酶( E P S P s ) 的克隆、性质及表达模式研 究。利用简并P C R 和R A C E 技术从银杏叶中克隆到E P S P 合酶基因( 俄，E 雕丹) 的 e D N A 全长序列。信息学分析发现，G b E P S P 的e D N A 全长1 4 0 3b p ，包含最大阅读 框( O R F ) 为1 0 3 5b p ，编码一个3 4 4 氨基酸多肽序列。蛋白质同源序列分析表明，银杏 E P S P 合酶蛋白质序列与其他物种的E P S P 合酶同源性较高，在8 1 8 4 之间。进化 树分析结果表明，在参试物种中G b E P S P s 作为裸子植物与被子植物同聚为一类，但 分歧时间相对更早。S o u t h e r nb l o t 分析表明，E P S P s 基因有多个拷贝，属于一个小的 多基因家族。不同组织表达分析显示，E P S P s 基因在银杏的叶和果中表达量最高，其 次为茎，根中表达水平最低。草甘膦处理能显著诱导银杏E P S P s 基因表达量升高， 紫外能上调银杏E P S P s 基因表达，A B A 则诱导G b E P S P s 表达量先升后降；温度对 G b E P S P s 具有不同的诱导作用，其中4 2 C 高温诱导最显著4h 达最大值，后又迅速 降低。暗示银杏叶片中E P S P s 基因在环境压力下表达量升高有可能与芳香族氨基酸 向黄酮类物质的转化有关。 ( 4 ) 银杏肉桂酰辅酶A 还原酶基因( G b C C R ) 的克隆、性质及表达模式研究。利用 简并P C R 和R A C E 技术从银杏叶片中克隆得到了G b C C R 的e D N A 全长序列。信息 学分析发现，G b C C R 的e D N A 全长为11 7 8b p ，含有一个9 7 2b p 的开放式阅读框 ( O R F ) ，编码3 2 3 个氨基酸序列。蛋白质同源序列分析表明，G b C C R 与其他物种C C R 同源性相对较高，与挪威云杉( P i c e aa b i e s ) 匣 源性最高，为6 8 6 ；同源建模分析显 示G b C C R 序列与其他家族蛋白的三维结构及活性位点高度相似。C C R s 蛋白序列进 化树分析结果显示G b C C R 与其他植物分化较早。S o u t h e r nb l o t 分析表明，G b C C R 属 于多基因家族；G b C C R 重组蛋白大肠杆菌表达显示，其蛋白大小与e D N A 序列预测 融合蛋白大小基本一致，亲和层析及W e s t e r nb l o t 分析显示，重组G b C C R 含有6 x H i s 标签，G b C C R 能在大肠杆菌中正常表达；R T - P C R 分析显示，G b C C R 基因在银杏不 同组织中都有表达，但与其他黄酮类代谢基因表达差异较大，其中茎和根中表达水平 最高，其次为成熟叶。G A 和农杆菌诱导表达分析显示，虽然二者都能诱导基因表达， 但G A 能够明显诱导G b C C R 转录水平上调，而农杆菌侵染处理对其表达量无明显改 变。G b C C R 诱导表达模式显示，该基因可能主要参与组织及细胞壁中木质素的合成， 而与抗病虫害无明显关系。 ( 5 ) 银杏查尔酮合成酶基因启动子( G b C H S P ) 的调控元件及功能分析。通过染色体 步移方法从银杏基因组中克隆到查尔酮合成酶基因( G b C H S ) 翻译起始位点上游1 7 1l b p 的启动子序列。生物信息学分析表明，该启动子片段中存在多个顺式作用元件， 包括紫外蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、M Y B 结合位点、 T A T A - b o x 和C A A T - b o x 等。亚克隆了G b C H S 转录起始位点上游1 4 0 2b p 序列，将 其与G U S 基因构建融合表达载体p B l l 2 1 + C H S P ，以p B l l 2 1 3 5 s 作为负对照，通过农 杆菌( L B A 4 4 0 4 ) 介导法分别转入烟草。结果表明，银杏C H S 启动子序列能驱动G U S 基因在烟草中的表达，表达具有组织差异性。其中叶片和茎中表达量较高；在诱导芽 及愈伤组织中亦具有较高表达水平。结果说明，C H S P 具有基本启动子功能，但表现 出空间上的表达差异性 关键词：银杏；类黄酮：查尔酮异构酶；肉桂酰辅酶A 还原酶；类黄酮3 - 羟化酶； 烯醇式丙酮基莽草酸3 磷酸合成酶；启动子；克隆；功能分析 M o l e c u l a rc l o n i n gi m p o r t a n tg e n e si n v o l v e di nt h ea c c u m u l a t i v ep r o c e s sf o r f l a v o n o i d sa n df u n c t i o no fc h a l c o n es y n t h a s eg e n ep r o m o t e rf r o mG i n k g ob i l o b aL M a j o r P o m o l o g y D o c t o r a ld i s s e r t a t i o n ：L il i n l i n g S u p c r v i s e r ：P e n gj i a n y i n g ；C h e n gs h u i y u a n A b s t r a c t I no r d e rt os t u d yb i o s y n t h e t i cm e c h a n i s mo ff l a v o n o i d si nG b i l o b aa n dd e v e l o p b i o t e c h n o l o g yo fi n c r e a s i n g t h ec o n t e n to ft h ef l a v o n o i d s ，s e v e r a lk e yg e n e ss u c ha s G b C H I , G b F 3EG b C C R ，G b E P S P sa n dG b C H S pw h i c ha l ei n v o l v e di nt h ef l a v o n o i d s a c c u m u l a t i o np r o c e s sh a v e b e e nc l o n e da n ds t u d i e di nt h i sp a p e r T h em a i nr e s u l t sa l ea s f o l l o w s ： ( 1 ) M o l e c u l a rc l o n i n g , c h a r a c t e r i z a t i o n a n de x p r e s s i o nm o d e l so fc h a l c o n e i s o m e r a s eg e n ef r o mG i n k g ob i l o b a Af b l l l e n g t hc D N Aa n dg e n o m i cD N Ao fc h a l c o n e i s o m e r a s e g e n ew e r e i s o l a t e df r o mG i n k g ob i l o b aL b yu s i n gP C Ra n dR A C E t e c h n o l o g i e s C o m p a r e dw i t l lt h ee D N As e q u e n c e ，t h eg e n o m i cs e q u e n c ec o n t a i nt w o i n t r o na n dt h r e ee x t r o n T h ec o d i n gr e g i o no ft h eg e n ei s7 3 5b pl o n g , a n di t sd e d u c e d p r o t e i nc o n s i s t so f 2 4 4a m i r l oa c i l sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f 2 6 2 9k D aa n dap I o f7 7 6 P r o t e i ns e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l st h a tG b C H Ih a dc l o s e rr e l a t i o n s h i pw i t hT y p eI C H I s P h y l o g e n c t i ct r c ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tG b C H I d o e sn o tb e l o n gt oT y p eIo rt y p eI I g r o u p S o u t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tG b F 3 Hb e l o n g e dt oam u l t i - g e n ef a m i l y 1 1 1 e r e s u l t so fp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns h o w e dt h a tt h ep r o d u c to fr e c o m b i n a n tG b C H Ip r o t e i n W a si na c c o r d a n c ew i t ht h ea n t i c i p a t i o n 1 1 1 ev i 们e n z y m ea c t i v i t ya s s a yb yH P L C i n d i c a t e dt h a tr e c o m b i n a n tG b C H Ip r o t e i nc o u l dc a t a l y z et h ef o r m a t i o nt h e ( 2 S ) - n a r i n g e n i nf r o m6 - h y d r o x y c h a l c o n e T h ee x p r e s s i o na n a l y s i sb yR T - P C Rs h o w e dt h a t G b C 田c o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e di na l lt h et e s t e dt i s s u e s ，a n dh a dt i s s u es p e c i f i cm a n n e ri n G b i l o b a G b C H lw a sa l s of o u n dt ob eu p r e g u l a t e db yU V ，A L A ，E T H ，A B A ，C C C ，a n d b ed o w n - r e g u l a t e db vG A C o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t w e e nC H Ia c t i v i t ya n df l a v o n o i d a c c u m u l a t i o nd u r i n gg i n 豳g ol e a fg r o w t hi n d i c a t e dt h a tG b C H Im i g h tb et h er a t e - l i m i t i n g e n z y m ei n t h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f f l a v o n o i d si ng i n k g ol e a v e s R e s u l t so fq u a n t i t a t i v e R T P C Ra n a l y s i ss h o w e dt h a tC H Ia c t i v i t yc o r r e l a t e dw i t ht h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo f c h a n g ei nc H lg e n e 。s u g g e s t i n gc H Ig e n ea st h es p e c i f i ck e yg e n er e g u l a t i n gf l a v o n o i d a c c u m u l a t i o ni ng i n k g o ( 2 ) M o l e c u l a rc l o n i n g , c h a r a c t e r i z a t i o na n de x p r e s s i o nm o d e l so fF l a v o n o i d 3 - h y d r o x y l a s eg e n ef r o mG b i l o b a F l a v o n o i d3 - h y d r o x y l a s e ( G b F 3 四，i s am e m b e ro f s t e m s ，r o o t sa n df i u i t s ，a n dh a dt h eh i g h e s te x p r e s s i o ni nl e a v e sa n df i u i t s ，t h en e x ti n s t e m s ，t h el e a s ti nr o o t s 1 1 地e x p r e s s i o no fG b E P S P sc o u l db ei n d u c e db yg l y p h o s a t ea n d U 一B 。A B Ac o u l di m p r o v et h ee x p r e s s i o no fG b E P s P sf i r s t , b u ta 昏嗽l a t e r D i f f e r e n t t e m p e r a t u r et r e a t m e n t sh a v ed i f f e r e n te f f e c t si nt h ec o n t e n to fG b E P s Pg e n e a n dt h e h i g h e s te x p r e s s i o na t4 2 f o r4 h ( 4 ) M o l e c u l a r c l o n i n g , c h a r a c t e r i z a t i o na n d e x p r e s s i o n m o d e l so f C i n n a m o y i - 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g e n ef a m i l y T h ee x p r e s s i o na n a l y s i sb y R T - P C Rs h o w e dt h a tG b C C Rh a dt i s s u es p e c i f i cm a n n e ri nG b i l o b a ，a n dt h eh i 曲e s t e x p r e s s i o ni ns t e m sa n dr o o t s ，t h en e x ti nm a t u r el e a v e s ，w h i c hw e r eg r e a td i f f e r e n c ew i t h o t h e rf l a v o n e sb i o s y n t h e t i cp a t h w a yg e n e G b C C RW a Sa l s of o u n dt ob es i g n i f i c a n t u p - r e g u l a t e db yG A ，b u ta g r o b a e t e r i u mt r e a t m e n th a dn os i g n i f i c a n tc h a n g e T h eh i g hl e v e l o fG b C C Rg e n ee x p r e s s i o na l o n gt h es t a l ks u g g e s t st h a tt h ec o r r e s p o n d i n ge n z y m ei s p r o b a b l yi n v o l v ei nc o n s t i t u t i v el i g n i f i c a t i o n ( s 3R e g u l a t o r yE l e m e n ta n dF u n c t i o nA n a l y s i so fC h a l e o n eS y n t h a s eG e n e P r o m o t e rf r o mG i n k g ob i l o b aL T h er e g u l a t i v es e q u e n c e ( 17 1lb p ) o fc h a l c o n es y n t h a s e g e n ep r o m o t e r ( C H S P ) f r o mG i n k g ob i l o b aL w a sc l o n e db yg e n o m i cw a l k i n g I n b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i so fs e q u e n c es u g g e s t e dt h a tt h es e q u e n c ec o n t a i n e ds e v e r a lt y p i a l c i s a c t i n ge l e m e n t s ，i n c l u d i n g U V b l u e l i g h tr e s p o n s i v ee l e m e n t s ，P h y t o h o r m o n e r e s p o n s i v ee l e m e n t s ，f u n g a le l i c i t o rr e s p o n s i v ee l e m e n t s ，M Y Bb i n d i n gs i t e , T A T A - b o x a n dC A A T - b o x A1 4 0 2b pp r o m o t e rs e q u e n c eu p s t r e a m5 o ft r a n s l a t i o ns t a r ts i t eo f G b C H Sw e r ec l o n e da n dd e s i g n a t e da sG b C H S P , r e s p e c t i v e l y p B l l 2 1 + C H S Pa n d p B l l 21 3 5 sw e r ec o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t ot o b a c c ob yL B A 4 4 0 4 T h e s er e s u l t s h o w e dt h a tp B I l 2 1a n dp B l l 2 I + C H S Pb o mc o u l dd r i v et h et r a n s i e n te x p r e s s i o no fG U S i nt o b a c c oa n dp B l l 2 1 + C H S Pe x p r e s s e dd i f f e r e n t i a l l yi nr o o t , s t e ma n dl e a ft i s s u e so f t o b a c c o O u rd i s c o v e r i e sw i l lb eh e l pt ou n d e r s t a n dt h et r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r y m e c h a n i s mo nG b C H S e x p r e s s i o na n da c c u m u l a t i o nf l a v o n o i d s K e yw o r d s ：G i n k g ob i l o b a ；f l a v o n o i d s ；c h a s c o n ei s o m e r a s e ；5 - e n o l p y r u v y l s h i k i m a t e - 3 - - p h o s p h a t es y n t h a s e ；F l a v o n o i d3 - h y d r o x y l a s e ；C i n n a m o y l - C o AR e d u c t a s e ； p r o m o t e r ；A n a l y s i s ；F u n c t i o na n dE x p r e s s i o n ； 目录 弓l言1 l 银杏叶黄酮类化合物的生物合成研究进展l 1 1 黄酮类化合物种类和作用1 1 2 银杏叶类黄酮种类3 1 3 黄酮类化合物的生物合成。3 1 4 银杏叶类黄酮调控研究进展5 2 植物基因启动子结构与功能研究9 2 1 植物基因启动子结构与特征。9 2 2 启动子分离的技术方法1 0 3 7C Z 盯对银杏黄酮代谢的调控4 0 3 8U V - B 及外施激素对银杏C 仞7 转录的调节4 2 4 小结与讨论4 4 第二章银杏丹曰基因克隆及表达分析4 6 l 材料和方法一4 7 1 1 材料4 7 1 2 方法4 7 2 结果与分析5 0 2 1G b F 3 He D N A 的克隆及其序列特征分析。5 0 2 26 铆召 HS o u t h e r n 印迹分析。5 4 2 3 彻H 蛋白质三维结构预测5 4 2 4F 3 H 基因原核表达及W e s t e r nb l o t 分析5 5 2 5 饼3 何不同组织表达分析5 7 2 6G 6 丹曰诱导表达分析。5 7 3 小结与讨论5 9 第三章银杏E P S P 合酶基因克隆及表达分析6 l I 材料与方法6 2 1 1 实验材料6 2 1 2 酶与分子试剂等6 2 1 3 总R N A 提取、反转录。6 2 1 4 基因e D N A 序列扩增6 2 1 5D N A 提取及S o u t h e r n 杂交6 2 1 6 诱导处理。6 3 1 7 表达检测6 3 1 8 生物信息学分析6 4 2 结果与分析6 5 2 1 俄厩憨两c D l 妊的克隆及其序列特征分析6 5 2 2 俄I E 陋& 进化树分析6 7 2 3 俄l E 隧丹S o u t h e r n 印迹分析6 7 2 4G b E P S P s 不同组织表达分析6 8 2 5G b E P S P s 诱导表达分析6 8 3 小结与讨论7 0 第四章银杏C C R 基因克隆及表达分析7 l l 实验材料与试剂。7 3 1 1 实验材料7 3 1 2 酶与分子生物学试剂7 3 2 实验方法。7 4 2 1 银杏总R N A 提取7 4 2 2 鼢队质量检测。7 4 2 3C C R 基因的e D N A 全长扩增7 4 2 4 银杏总D N A 提取7 5 2 5G b C C R 基因的S o u t h e r nb l o t 分析7 5 2 6G b C C R 基因上游启动子调控序列扩增7 5 2 7G b C C R 基因启动子信息学分析7 5 2 8G b C C C R 基因在银杏不同组织中的表达分析7 5 2 9G b C C R 基因的原核细胞表达分析7 6 2 1 0G b a 豫基因诱导表达7 6 3 结果与分析。7 9 3 1G b C C Re D N A 的克隆及其序列特征分析7 9 3 2G b c I 强蛋白质三维结构预测8l 3 3G b RS o u t h e r n 印迹分析8 l 3 4G b C C R 不同组织表达分析8 2 3 5G b C C R 基因原核表达及W e s t e r nb l o t 分析8 3 3 6G b C 冗诱导表达分析8 5 4 小结与讨论8 6 第五章银杏查尔酮合成酶基因启动子( G b C H S P ) 的调控元件及功能分析8 8 l 实验材料与试剂。8 9 1 1 实验材料8 9 1 2 试剂8 9 2 实验方法。9 0 2 1 总D 1 妣。和m 呵A 的提取9 0 2 2G b C H S 启动子( C H S P ) 克隆9 0 2 3G b C H S 启动子( C 强妒) 作用元件分析9 l 2 4 银杏C H S P 基因的植物表达载体的构建9 l 2 5 植物表达载体向农杆菌的转化9 4 2 6 转化烟草9 5 2 7 转基因植株的鉴定9 6 3 结果与分析9 8 3 1G b C H S 上游D N A 序列获得及验证9 8 3 2 启动子顺式作用元件预测和序列分析9 8 3 3 功能验证表达载体构建1 0 0 3 4 转化阳性烟草G U S 组织化学检测1 0 1 4 小结与讨论1 0 4 结论及创新点1 0 6 参考文献10 8 在读期间已发表论文1 2 0 作者简历1 2 1 致谢1 2 2 ， 符号说明 银杏叶黄酮积累相关基因克隆及查尔酮合成酶基因启动子功能研究 引言 银杏( G i n k g ob i l o b aL ) 又名白果、公孙树，是世界上最古老的孑遗树种之一，素有“活化石” 之称。银杏繁盛时代是中生代的侏罗纪，到白垩纪初仍分布全球，第四纪冰川后仅在我国存留一 种中国银杏【l 】。银杏具有极高的经济、生态、观赏和科研价值，其药用价值已受到世界范围 内研究者广泛关注。银杏叶片主要含有两种活性成分黄酮类化合物( F l a v o n o i d s ) 和萜内酯 ( 银杏内酯G i n k g o l i d e s ) 。其中黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、消炎、抗过敏、抗肿瘤、 抗心血管疾病、抗衰老以及防治更年期综合症等药理活性 2 1 ，近年来银杏叶提取物制剂日趋火爆， 其黄酮含量亦成为衡量制剂质量的关键因素之一，如何提高银杏叶黄酮含量已成为研究的热点与