二倍体马铃薯遗传群体的构建和抗低温糖化分析-硕士论文

分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 1 8 3 8 3 2 9 二倍体马铃薯遗传群体的构建和抗低温糖化分析 C o n s t r u c t i o no fA D i p l o i dP o t a t oG e n e t i cP o p u l a t i o na n dt h e S e g r e g a t i o ni nC o l dS w e e t e n i n g R e s i s t a n c e 研究生：石伟平 指导教师：谢从华教授 指导小组：柳俊教授 宋波涛副教授 田振东副教授 蔡兴奎副教授 专业：蔬菜学研究方向：分子生物学和生物技术 获得学位名称：农学硕士获得学位时间： 华中农业大学园艺林学学院 二。一O 年一月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 乙 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究蚴：矸孕 帆少口年厂月矽日 学位论文作者签亍：歹中孕导师签名：翻 签名日期：少年朋矽日 签名日期：驯秒年朋罗日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 目录 摘要荽1 A B S T R A C T 2 缩略词表4 1 前言6 1 1 课题的提出6 1 2 前人研究进展7 1 2 1 马铃薯加工性状育种的现状7 1 2 2 影响马铃薯块茎炸片颜色的因素9 1 2 3 马铃薯块茎“低温糖化”的生理研究1 0 1 2 4 马铃薯“低温糖化”育种的策略。1 2 1 2 5Q T L 定位研究1 4 1 3 本研究的意义和目的1 9 2 材料与方法2 0 2 1 实验材料2 0 2 2 实验方法2 0 2 2 1 杂交实验2 0 2 2 2 微型种薯繁殖2 1 2 2 3 多点实验2 1 2 2 4 低温储藏及回暖处理2 2 2 2 5 炸片颜色鉴定2 2 2 2 6 还原糖的测定2 2 2 2 7D N A 的抽提( C T A B 大量抽提法) 2 3 2 2 8P C R 反应体系及反应程序2 4 2 2 。9P C R 产物检测2 5 2 2 1 0 所用到的分子标记2 6 3 结果与分析2 7 3 1 遗传群体构建2 7 3 1 1 二倍体材料的杂交配组。2 7 3 1 2 二倍体材料还原糖含量测定。2 8 3 1 3 遗传群体的选定2 8 3 2E B 群体马铃薯块茎性状鉴定2 9 3 2 1 遗传群体“低温糖化”鉴定3 0 3 2 2 低温储藏后以及回暖处理后炸片鉴定。3 3 3 3 遗传群体分子鉴定3 6 3 3 1D N A 模板检测3 6 3 3 2 分子标记的筛选3 6 3 3 3 群体材料多态性鉴定3 7 4 讨论。4 0 4 1 关于遗传分离群体的构建4 0 4 2 抗低温糖化性状分析。4 l 4 3 分子标记对E B 群体的初步分析4 l 4 4 关于马铃薯抗低温糖化育种4 2 4 5 下一步研究展望。4 4 参考文献4 5 致 谢5 3 附录5 4 摘要 马铃薯是世界第四大粮食作物，用途广泛，其油炸加工产品炸片和炸条全球流行。 为了抑制常温贮藏产生的块茎失水皱缩、病害传播、发芽等现象以延长加工周期， 通常将马铃薯块茎贮藏在低温条件下。但低温常使块茎中的淀粉加速转化为还原糖， 高温油炸加工时，还原糖与游离的氨基酸发生褐化反应，严重影响油炸产品的色泽 和品质，甚至对人体健康产生不良影响。因此，控制“低温糖化”已经成为马铃薯采 后生理学研究的热点。块茎“低温糖化”是个复杂的数量性状，受多个基因协同控制， 涉及淀粉糖代谢的多种路径，调节和反馈因子多，因此“低温糖化”的机理研究是马 铃薯加工品质改良的重要基础工作。 本研究在二倍体水平上，利用差异亲本构建马铃薯遗传分离群体，通过对分离 群体块茎进行低温储藏以及回暖后低温糖化分析和炸片颜色评价，为抗低温糖化性 状的Q T L 定位分析搭建基础平台：同时得到抗“低温糖化”遗传改良材料，为优良加 工品种的选育奠定基础。主要取得如下结果： 1 选得低温储藏后还原糖含量较低的二倍体野生种S o l a n u mb e r t h a u l t i i 和还原 糖含量较高的二倍体群体后代无性系E D 2 5 ，杂交后构建遗传分离群体，命名为E B 群体，共3 0 0 个基因型。 2 选取E B 群体1 9 0 个基因型( 加父母本) 材料，多点实验后抗低温糖化( 4 储藏6 0 天) 鉴定表明，还原糖含量存在明显的遗传分离，而且变异范围都超出亲本 材料，三个点还原糖含量均呈正态分布，并且三点之间差异显著。 3 选取武汉点的7 4 个基因型进行炸片实验，低温储藏后以及回暖处理后炸片鉴 定结果表明，7 4 个基因型回暖后色泽指数平均值由8 0 1 9 下降到6 9 2 0 ，下降1 3 7 ； 还原糖含量和色泽指数回归分析表明，二者相关达到极显著水平。 4 初步发现E B 群体中抗低温糖化较好的材料如0 6 4 、1 7 9 、1 6 6 、1 0 9 、0 3 5 等； 回暖效果较好的材料如0 6 4 ，2 2 4 ，2 3 4 ，2 6 1 ，2 8 2 ，2 8 5 ，2 8 8 ，3 0 1 等。 5 遗传多态性分析中，使用1 3 1 对S S R 引物组合和2 0 8 对E S T 引物组合，对父 母本进行多态性分析，存在多态性的S S R 标记有1 1 1 个，E S T 标记有3 1 个。通过 对E B 分离群体中1 8 3 个基因型鉴定，1 9 个多态性S S R 标记共扩增出3 8 条多态性 带型，经卡方测验，2 6 条带符合1 ：1 分离。 关键词：马铃薯，还原糖，遗传群体，低温糖化，分子标记，遗传分析 A B S T R A C T T h ep o t a t o ( S o l a n u mt u b e r o s u mL ) i st h ef o u r t hf 0 0 dc r o p 、) I ，i mm u l t i p l eu s e si nt h e w o r l d 、析t l lt h e i rc h i p sa n df r i e sa r ef a s h i o n a b l e I no r d e rt or e d u c et h eO V e Tm u c hl o s so f m o i s t u r e ，d e v e l o p m e n to fs p r o u tg r o w t h , c o l ds t o r a g eo fp o t a t ot u b e r sa ta b o u t4 Ci s g e n e r a l l ya d o p t e dt op r o l o n gt h ep r o c e s s i n gp e r i o d H o w e v e r , c o l ds t o r a g ec a u s e sal a r g e a c c u m u l a t i o no fr e d u c i n gs u g a r 皿S ) ，a sac o n s e q u e n c eo ft h ec o n v e r s i o no fs t a r c h , t h a t r e a c t sw i t ht h ea m i n oa c i d su n d e rh i g ht e m p e r a t u r et or e s u l ti nu n d e s i r a b l ed a r kb r o w n c o l o ro ft h ep r o d u c t s T h es t a r c h s u g a rc o n v e r s i o ni n v o l v e sm u l 邱l em e t a b o l i cp a t h w a y s w i t hm a n yr e g u l a t i n gf a c t o r s T h e r e f o r e ，m e c h a n i s mo f c o l d - s w e e t e n i n g ( C S ) i s 姐 i m p o r t a n ti s s u ef o ri m p r o v i n gp o t a t op o s t h a r v e s tq u a l i t y I np r e s e n t s t u d y ，ag e n e t i cs e g r e g a t i o np o p u l a t i o nw a sc o n s t r u c t e dt h r o u g ha c r o s so f t w od i p l o i dp a r e n t sw i t hd i s t i n c tl e v e l si nt h ec o l d - s w e e t e n i n ga n dc h i p p i n gq u a l i t i e s F u r t h e rm o l e c u l a rg e n e t i cm a r k e r sa n a l y s i sw a sp e r f o r m e d T h em a i nc o n c l u s i o n sa l ea s f o l l o w s ： 1 D i p l o i dw i l ds p i c e s b e r t h a u l t i iW a su s e da sm a t e r n a lp a r e n t 谢廿1C S r e s i s t a n c e a n dd i p l o i ds u c c e s s i o nl i n eE D 2 5w a su s e da sp a t e r n a lp a r e n tw i t hC S s e n s i t i v i t y A f t e r c r o s s i n gb e t w e e nt h e ms e g r e g a t i o np o p u l a t i o nW a so b t a i n e dw h i c hc o n t a i n s3 0 0 i n d i v i d u a l sa n di sd e n o t e da s “E Bp o p u l a t i o n 2 O n eh u n d r e da n dn i n e t yi n d i v i d u a l si n c l u d i n gp a r e n t sw e r eg r o w ni nt h r e e g e o g r a p h i cs i t e sa n d R So ft h e i rt u b e r sw e r ct e s t e da f t e rs t o r a g ea t4 Cf o r6 0d a y s A n o r m a ld i s t r i b u t i o nW a sf o u n di nR Sw i t hac u r v es h o w i n go v e r - p a r e n t - e x t e n t i o n , a l t h o u g ht h ea v e r a g eR So b v i o u s l yd i f f e r e da m o n gt h et h r e es i t e s 3 T h er e e o n d i t i o na t2 0 Cf o r21d a y sa f t e rt h ec o l ds t o r a g e ，t h ec h i pc o l o ri n d e xo f s e l e c t e d7 4g e n o t y p e sd e c r e a s e db y1 3 7 f r o m8 0 1 9t o6 9 2 0 R e g r e s s i o na n a l y s i s i n d i c a t e das i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h er e d u c i n gs u g a rc o n t e n to ft h em b c r sa n d t h e i rc h i pc o l o ri n d e x 4 S o m eg e n o t y p c se x h i b i t e dg o o dr e s i s t a n c et oc o l d s w e e t e n i n g ，s u c ha s0 6 4 、17 9 、 1 6 6 、1 0 9 、0 3 5e ta i ；a n ds o m es h o w e dr e m a r k a b l er e d u c t i o ni nR Sa f t e rr e c o n d i t i o n , s u c h a s0 6 4 ，2 2 4 ，2 3 4 ，2 6 1 ，2 8 2 ，2 8 5 ，2 8 8 ，3 0 1e ta 1 5 O n eh u n d r e da n dt t l i I a r - o n ep a i r so fS S Rp r i m e r sa n d2 0 8p a i r so fE S Tp r i m e r s w e r eu s e dt ot e s tp a r e n t s T h er e s u l t ss h o w e dt h a t111p a i r so fS S Rp r i m e r sa n d31p a i r s f !l ： 2 o fE S T p r i m e r sy i e l d e dd i s t i n c tb a n d sb e t w e e np a r e n t s ；t h ep o l y m o 印 d c 鞠t ew a s8 4 7 a n d14 9 ，r e s p e c t i v e l y N i n e t e e np a i r so fp o l y m o r p h i cS S R p r i m e r sw e r eu s e dt ot e s tt h e E Bp o p u l a t i o nc o n t a i n i n g18 3i n d i v i d u a l sw h i c hs h o w e d3 8p o l y m o r p h i cb a n d s ，2 6o f t h e mp e r f o r m e das e g r e g a t i o nr a t i oo f1 ：1 K e yw o r d s ：p o t a t o ( S o l a n u mt u b e r o s u mL ) ，r e d u c i n gs u g a r ，g e n e t i cp o p u l a t i o n ， c o l d - s w e e t e n i n g ，m o l e c u l a rm a r k e r ，q u a n t i t a t i v eg e n e t i ca n a l y s i s 3 缩略词表 4 1 前言 1 1 课题的提出 马铃薯( S o l a n u mt u b e r o s u mL ) 起源于南美安第斯山，是粮菜兼用的农作物， 也可用来做饲料和工业原料。马铃薯种植面积仅次于水稻、玉米和小麦，是世界第 四大粮食作物。由于其适应性广、产量高、营养全面等优点，在农业生产和人民生 活中占有重要地位。国际马铃薯中心( I n t e m a t i o n n a lP o t a t oC e n t e r ，C I P ) 统计表明， 过去2 0 年发展中国家的马铃薯产量增加一倍，到2 0 2 0 年世界需求还有望再增长 2 0 ，发展中国家需求更将达到2 0 0 0 年的两倍水平。马铃薯四百年前从欧洲传入到 我国后，迅速扩展到全国各地，我国已经成为马铃薯生产第一大国。据联合国粮食 及农业组织报道，2 0 0 8 年我国马铃薯栽培栽培面积为5 3 0 万公顷左右，总产达到8 0 0 0 万吨( F A O ，2 0 0 9 ) 。 然而，多年来我国生产的马铃薯绝大部分用于鲜食和饲料，附加值极低。马铃 薯淀粉生产出的精细化工产品高达2 0 0 0 多种，广泛应用于食品、医药、饲料、纺织、 化工、环保等行业( 李贵春等，1 9 9 7 ) 。欧美等主要生产国的马铃薯加工利用率都 在4 0 以上，用于食品加工的比例也都高于2 0 ，年销售额达数十亿美元( 屈冬玉等， 2 0 0 2 ) 。造成这种差异，除了生活饮食习惯不同以外，最主要的原因是我国缺少可供 加工的马铃薯优良品种。 油炸制品( 炸片、炸条等) 在马铃薯加工产品中占有重要地位，据美国国家马 铃薯委员会统计，早在1 9 9 9 年时期，北美生产的马铃薯就有1 1 用于炸片加工( H a y e s a n dT h i l l ，2 0 0 2 a ；2 0 0 2 b ) 。而在英国等欧洲主要国家，用于炸片和炸薯条加工的马铃 薯约占5 0 ( h t t p ：w w w a t c b i o t e c h c o m p o t a t o h t m ) 。欧美国家人们日常食用的马 铃薯食品仅次于牛奶，而高于其他食品。近年来，日本等亚洲国家的马铃薯方便食 品消耗日趋加大，我国也具有同样的发展趋势。 马铃薯块茎收获后，为了减少失水和呼吸消耗，抑制过早发芽，降低病害损失， 延长市场供应或加工时间，收获的块茎通常在4 。C 低温条件下贮藏，这就促进了淀 6 粉向还原糖的转化，这种现象被称为“低温糖化 ( C o l dS w e e t e n i n g ，C S ) 。将这些 低温储藏过的薯块高温油炸，块茎中的己糖与自由氨基酸发生反应，使炸片或薯条 色泽褐化，严重影响了加工品质。 我国的马铃薯育种长期以高产、抗病为主，在过去的6 0 多年中育成了将近3 0 0 个品种，但是油炸加工品种极为缺乏，在目前的栽培品种中，仅少数品种收获时基 本符合加工要求，经低温储藏后多数不能用于油炸加工。因此，加速马铃薯加工品 种的选育步伐，是发展马铃薯食品加工业的重要前提，更是我国马铃薯科研和生产 发展的战略重点。 常规杂交育种手段在马铃薯育种中仍居很重要的地位。然而常规育种效率低， 周期长，短期内难以育出高质量的加工品种。事实上，由于马铃薯是无性繁殖植物， 又是同源四倍体植物，遗传背景复杂，尤其对于加工性状的遗传研究比较落后。类 似于绝大多数重要经济性状一样，马铃薯的还原糖含量是个数量性状，长期以来， 只能借助数理统计的方法，将控制数量性状的多基因系统作为一个整体来研究，用 平均值和方差来描述数量性状的遗传特征，根本无法了解单个基因和Q T L 的位置和 效应，这种状况限制了人们对性状的遗传研究和利用能力。 伴随现代生物技术的快速发展，科学家试图通过生物技术手段在较短的时间创 造并筛选出抗“低温糖化”的品种或育种中间材料，选育适宜加工炸片炸条的品种 就是当前马铃薯育种工作非常重要的任务。 1 2 前人研究进展 1 2 1 马铃薯加工性状育种的现状 伴着马铃薯加工业的蓬勃发展，良种选育方向由传统的高产、抗病育种逐渐转 向具有特色性状的优良加工品质育种，这就要求对马铃薯的外观及内含物更为严格。 外观外形：炸片薯块圆球型，炸条薯块长椭圆型，两端宽圆；直径以5 - 8 厘米为 宜，重量2 0 0 克以上；薯皮乳黄色或黄棕色，表皮要薄而光滑；芽眼浅而少。薯 肉：薯肉白色或乳白色；块茎生长膨大均匀，内外部没有缺陷，块茎无生理性坏疽、 7 空心、开裂；薯皮不易绿化；块茎比较抗机械损伤，无感病、腐烂等。干物质含 量或块茎比重：干物质含量2 0 2 4 ；炸条品种的要求高于1 0 8 5 ，炸片品种的要求 高于1 0 8 0 。块茎还原糖含量：还原糖含量越低，炸片的颜色越好，理想的炸薯 片品种要求还原糖含量不超过0 3 ；炸条品种还原糖含量不超过O 5 。对于油炸 加工来讲，块茎干物质含量和还原糖含量是两个重要的指标，高含量的干物质不但 可以提高产品率，同时能减少油炸食品中油的含量，减少油腻感觉，从而提高加工 产品的产量、质量和效益。马铃薯还原糖含量与炸片色泽密切相关，是确定一个品 种是否适合炸片的重要指标，但是还原糖含量受到品种遗传因素和贮藏条件等诸多 综合因素的影响，其作用机制极为复杂( 王合里，1 9 9 9 ) 。 虽然对块茎中还原糖含量性状的研究起步较晚，但是近年来取得了不少成果。 据统计，北美地区过去一百多年共育成了4 0 多个适合炸片炸条的品种，加工品质得 到大大改善，还原糖含量年均降低0 0 0 1 3 - - - 0 0 0 3 1 ，炸片合格率年均提升0 2 3 。 到目前为止，通过常规育种方法选育出的新品种大致有：炸片加工品种 A t l a n t i c ”、 “S n o w d e n 、“D a k o d aP e a r l ”，炸条品种“R u s s e t 、“S h e p o d y 、B u r b a n k 等。然而， 这些品种适应性和抗逆性稳定性不够好，难以保证高产稳产，而且，这些品种的血 缘关系亲近，都具有S p h u r e j a 与S a n d i g e n a 的特征，进一步提升的空间被限制 ( B u s oe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。我国利用栽培种常规杂交手段，已经选出一些还原糖含量小于 0 4 的耐低温糖化优良材料，为下一步选育出高质量的加工品种奠定了基础( 张庆 娜等，2 0 0 6 ) 。 近年来，通过品种引进、新品种培育，我国也选育出了一些薯形好、高淀粉低 还原糖、适合油炸加工的马铃薯新品种，如中薯5 号”、“内薯7 号 等。但是， 这些品种经低温贮藏后，还原糖含量大幅度增加，难以用于非生产季节的原料供应 ( 周成业，2 0 0 2 ) 。 8 1 2 2 影响马铃薯块茎炸片颜色的因素 1 2 2 1 马铃薯块茎的还原糖含量 块茎还原糖含量是影响马铃薯炸片颜色最关键的因素。研究认为，在马铃薯油 炸过程中，还原糖和氨基酸共同参与了炸片颜色的形成和变化，还原糖含量的增加 导致炸片颜色变深，是炸片颜色变化的一个关键性因素，而果糖在炸片褐化中的作 用要弱于葡萄糖。P r i t c h a r d 等( 1 9 9 4 ) 认为，块茎中各种糖含量与炸片颜色的相关 性因品种和年份而异，但葡萄糖含量与炸片颜色的相关性比全还原糖含量高，因此 更适合用于评价马铃薯炸片颜色。陈芳等( 2 0 0 0 ) 研究了还原糖与炸片色泽的关系， 随着马铃薯块茎低温贮藏时间的延长，炸片色泽加深，还原糖含量与炸片色泽呈显 著相关，4 C 贮藏时，相关系数达r - - 0 7 7 5 ，1 0 时相关系数为0 6 7 8 。 1 2 2 2 马铃薯块茎的贮藏温度和时间 G o u l d ( 1 9 7 9 ) 认为，对未经贮藏的马铃薯片进行油炸，炸片颜色的质量都较好。 当块茎分别在4 4 、7 2 、1 0 的条件下贮藏3 个月或6 个月后，随后进行回暖 处理2 0 天后的炸片结果显示，4 4 。C 贮藏温度下，只有少部分块茎的炸片颜色趋于 可接受的程度；而在7 2 和1 0 贮藏温度下，几乎所有块茎炸片的颜色都合格。 E w i n g 等( 1 9 8 1 ) 研究认为，马铃薯块茎在1 低温下贮藏4 天以后，再在1 0 或 1 9 。C 回暖l 周，结果块茎还原糖含量增加，炸片颜色也变深，若回暖时间在8 天以 上，则块茎中还原糖含量有所下降，炸片颜色也得到改进。另有实验证明，1 2 贮 藏1 0 周后，块茎中还原糖的含量有少量降低，但是炸片颜色符合加工标准。屈冬玉 等( 2 0 0 2 ) 提出，马铃薯块茎在低温下贮藏后，须要经过回暖足够时间，才可能使 炸片颜色达到商业要求，然而回暖的时间长短因不同品种而异。 1 2 2 3 其它因素 根据经典遗传学理论，T h i l l 等( 1 9 9 4 ) 在二倍体水平上提出三个位点假说，这 三个位点既能控制炸片颜色的变化，又能控制回暖时炸片颜色的反转现象。同时指 9 出炸片颜色是高度遗传的，在二倍体水平上炸片色泽受两个主效基因控制。 品种、年份、土壤条件等，对马铃薯炸片色泽都有影响。C o f f i n 等( 1 9 8 7 ) 在 相同的条件下贮藏3 个不同的马铃薯品种的块茎，结果只有一个品种的炸片色泽在 可接受范围之内。S i n h a 等( 1 9 9 2 ) 在不同的年份对几个品种炸片分析，结果表明高 比重低葡萄糖含量的品种炸片色泽好，生产年份对炸片色泽有着显著的影响。有研 究表明，马铃薯高湿土壤中生长，由于潮湿降低了土壤的通气性，引起二氧化碳在 马铃薯块茎中积累，最终影响炸片色泽。R o e ( 1 9 9 0 ) 研究马铃薯施用氮肥量，结果 表明随增加施用氮肥量，块茎的还原糖含量和自由氨基酸含量也得到增加，最后导 致炸片色泽加深。在马铃薯炸片加工过程中，油炸温度对炸片颜色影响较大，而切 片厚度对炸片色泽只有微小影响( 谢智明等，1 9 9 2 ) 。另据G i c h o h i 等( 1 9 9 5 ) 研 究表明，使用马来酰肼( M H ) 在抑制块茎发芽过程中，同时也能提高块茎中的葡萄 糖含量，从而加深炸片色泽。 1 2 3 马铃薯块茎搿低温糖化刀的生理研究 和液泡膜，生物膜通透性变化是冷胁迫生理障碍的理论已广泛被人们认知。一些研 究认为冷胁迫下淀粉体膜的分子组成和组织结构发生一定的变化，膜脂流动性降低， 从而造成膜通透性发生改变。 S o w o k i n o s ( 1 9 9 0 b ) 提出了“液泡膜渗透模型，该模型解释，冷胁迫导致了 细胞生物体膜选择通透性功能的破坏，主要原因是液泡膜发生了渗漏，从而使得基 质内的一些离子尤其是无机磷( P i ) 从液泡向细胞质渗透，最后到达淀粉体内，此 类物质促进了淀粉磷酸化酶对淀粉的降解，同时抑制了A G P a s e 催化的淀粉再合成， 最终造成还原糖的积累。 1 2 3 3 马铃薯块茎碳代谢与“低温糖化一 马铃薯块茎的碳水化合物代谢是个复杂的生理生化过程，块茎“低温糖化 不仅 涉及到块茎发育形成期间蔗糖合成与运输，同时与贮藏期间块茎淀粉的降解和再合 成等相关密切，这种复杂的代谢网络涉及到如S P 、A G P a s e 、S S 、U G P a s e 、S u S y 、 V I 、G B S S 、S S 等一系列重要酶以及P P P 、E M P 重要生化反应。因此，贮藏期间马 铃薯块茎的淀粉一糖转化的机理研究以及有效调节，是选育抗“低温糖化 马铃薯 品种的前提和基础。 低温使淀粉分解酶活性上升，淀粉合成酶活性降低 马铃薯贮藏块茎还原糖主要来源于淀粉，淀粉的分解和再合成直接影响块茎的 加工品质。S o w o k i n o s 等( 1 9 8 2 ) 研究发现，马铃薯块茎在低温贮藏条件下，A G P a s e 活性持续降低。也有观点认为，淀粉降解起主要作用是淀粉磷酸化酶( S P ) ，在低 温贮藏中，块茎S P 活性上升导致还原糖含量上升，他们认为淀粉降解主要是通过磷 酸降解方式进行，因此S P 活性的升高是块茎“低温糖化”的起始信号( M o r e l la n da p R e e s ，1 9 8 6 ) 。 低温使糖酵解关键酶活性下降 对碳水化合物的糖酵解研究发现，磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶到了至关重要的 作用。H a m m o n d 等( 1 9 9 0 ) 发现有四种类型的磷酸果糖激酶存在于马铃薯块茎中， 其中一些对低温尤为敏感，低温导致活性下降，糖酵解代谢受阻，还原糖因此积累。 低温使糖异生重要酶活性上升 糖异生过程中U G P a s e 和I n v e r t a s e 是影响马铃薯块茎“低温糖化 重要的关键 酶。S p y c h a l l a 等( 1 9 9 4 ) 通过克隆马铃薯的U G P a s e 基因，结合R N A 技术抑制U G P a s e 的活性，当U G P a s e 酶活性大幅下降到3 0 以后，在低温储藏下，转基因马铃薯块 茎中蔗糖含量比对照品种大大降低，证实了U G P a s e 在“低温糖化过程中的显著 作用。 低温贮藏期间转化酶的活性也是上升的。U p p a l 等( 1 9 9 0 ) 发现还原糖含量与 转化酶活性存在极显著相关( r = 0 8 2 1 ) ，在“低温糖化 过程中转化酶起到了关键 性的作用；低温贮藏初期由于转化酶抑制剂的大量存在，使得转化酶的活性较低， 随着贮藏时间的加长，由于抑制剂分解，转化酶活性的显著升高。 1 2 3 4 淀粉结构与块茎的“低温糖化一 马铃薯淀粉由支链淀粉和直链淀粉组成，其中支链淀粉占7 0 - - - 8 0 左右。直 链淀粉构成的结晶区属热力学稳定结构，而由支链淀粉构成的无定形区对酶的降解 敏感，同时支链淀粉的高分支度阻碍了结晶区的形成，所以认为支链淀粉含量越高， 淀粉粒结构越不稳定。L e s z k o w i a t 等( 1 9 9 0 ) 研究证明，相比抗“低温糖化的品 种，易“低温糖化 的品种支链淀粉比例较高，淀粉粒结构更不稳定。 1 2 4 马铃薯“低温糖化刀育种的策略 1 2 4 1 马铃薯常规育种 马铃薯家族中有几百个野生种中7 0 以上是二倍体，这些丰富的遗传资源拥有 许多栽培种不具备的优良性状，如良好的抗性、优良块茎品质等，当然也不缺乏块 茎还原糖含量十分低的材料( P e l o q u i ne ta 1 ，1 9 8 9 ) 。如何有效挖掘利用以及创新这 些潜在的巨大种质储备资源是选育优良马铃薯加工品种的首要工作。 杂交育种仍然是选育加工型品种的重要手段。同源四倍体理论( b i n g h a m ，1 9 8 3 ) 认为后代的最大杂合优势是来源于最多的基因位点互作，这些基因位点内的互作显 性和杂合性直接影响数量性状的表现，加性效应同样对数量性状影响较大。马铃薯 1 2 野生种& p h u r e j a ，& g o n i o c a l y x ，g o u r l a y i ，& o k a d a e 和r a p h a n i f o l i u m 等含有 耐“低温糖化 的某类基因( H a n n e m a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。L a u e r 等( 1 9 7 0 ) 用马铃薯栽 培种与p h u r e y a 杂交，得到的U S W 7 3 3 4 8 株系在4 贮藏5 周后炸片色泽依然良 好。同样，具备Sp h u r e j a 遗传背景的两个品系N D 8 6 0 2 、N D 2 2 2 1 - 6 ，经块茎4 。C 贮藏1 0 0 天后还原糖含量仍然保持在较低水平( E h l e n f e l d te ta 1 ，1 9 9 0 ) 。N o v y 等 ( 1 9 9 8 ) 用N D 8 6 0 2 为母本通过杂交手段获得了抗“低温糖化 的炸片加工品种 “N o r V a U e y 。 常规杂交育种程序育成一个新品种( 品系) 大约花1 2 1 5 年( T a ie ta 1 ，1 9 8 4 ) 。 马铃薯常规育种存在诸多生物学障碍：马铃薯属的同源四倍体，高度杂合特性和 四体遗传造成基因分离异常复杂，隐性基因难以表现，加上又是大株行距作物，杂 交群体常常满足不了某些基因表达所需的个体数目，因此很容易造成优良基因型的 丢失；马铃薯大多数重要的经济性状都是数量性状，如：产量、块茎外形、比重、 干物质含量、晚疫病抗性、还原糖含量、炸片色泽等，都受多基因综合控制，而且 容易受到环境条件的影响，准确选择到目标性状的概率较低；现有的马铃薯栽培 种遗传背景比较狭窄，常规育种难以突破现有基因范围，同时广泛的杂交不亲和现 象( J o h n s t o ne ta 1 ，1 9 8 0 ) 也大大降低了常规育种的有效性。 1 2 4 2 马铃薯的基因改良育种 马铃薯块茎的还原糖主要来自于淀粉的降解，因此，淀粉糖代谢转化过程中相 关酶基因及其主要调节因子成为了该领域的研究热点和重点。目前采用基因工程手 段进行马铃薯抗“低温糖化 育种的研究主要在以下方面展开。 提高A G P a s e 活性，促进淀粉的再合成。宋波涛( 2 0 0 5 ) 通过克隆腺苷二磷 酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基I 因( s A G P ) ，转化马铃薯栽培种，研究表明：块茎经4 贮藏6 0 天后，转正义s A G P 基因株系A G P a s e 酶活性比对照平均提升9 3 ，还 原糖含量平均降低l1 4 ；另一方面，转反义s A G P 基因株系A G P a s e 酶活性平均 下降8 ，还原糖含量平均上升6 0 。证明了s A G P 基因的表达影响了马铃薯块茎 在贮藏期间的A G P a s e 活性，从而影响了还原糖含量的积累。 抑制转化酶活性，减少还原糖积累。张迟( 2 0 0 7 ) 通过R N A 干涉载体以及 反义基因( 或片段) 载体转化马铃薯栽培种，研究酸性转化酶基因在调控马铃薯块茎 低温糖化中的作用。结果表明，在4 C 贮藏6 0 天条件下，株系E S 4 3 酸性转化酶活 性下降了7 2 ，还原糖含量下降了6 8 7 ，同时引起蔗糖含量的上升9 2 4 和淀粉 的含量增加7 2 。 成善汉( 2 0 0 4 ) 构建了烟草液泡转化酶抑制子N t - V I F 基因表达载体p B I C N I ， 并转化马铃薯植株。结果表明，1 4 个马铃薯转基因株系的块茎分别在4 C 下贮藏3 0 天后，测定还原糖含量和液泡酸性转化酶活性，马铃薯转基因株系的块茎还原糖含 量与对照相比下降了3 4 7 6 8 ，说明液泡转化酶抑制子有效地抑制了液泡酸性转 化酶的活性，导致还原糖含量明显降低。 1 2 5Q T L 定位研究 1 2 5 1 分子标记技术 随着各种分子标记技术的层出不尽，数量遗传学和Q T L 定位研究得到了飞速发 展，目前，常用的分子标记大致可分为以下四类。 基于分子杂交技术的分子标记。这类分子标记以R F L P 作为代表，R F L P ( R e s t r i c t i o nF r a g m e n tL e n g t hP o l y m o r p h i s m ) 基本原理是利用限制性内切酶酶切基 因组D N A ，由于酶切位点的差别而得到不同大小的D N A 片段，通过凝胶电泳分析产 物，就形成不同的带；同时与克隆D N A 探针进行S o u t h e r n 杂交和放射显影，便可得 出特异性的R F L P 图谱( B o t s t e i ne ta 1 ，1 9 8 0 ) 。该技术的优点是检测到的等位基因 具有共显性，不受环境影响，能稳定遗传；缺点是对D N A 质量要求较高，操作复杂。 基于P C R 扩增技术的分子标记。这类分子标记以R A P D 、S S R 等分子标记为 代表。R A P D ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cD N A ) 是W i l l i a m s 等( 1 9 9 0 ) 和W e l s h 等( 1 9 9 0 ) 等同时提出的一种标记技术。基本原理是利用大约1 0 个碱基的随机引物 对基因组D 】W 进行P C R 由 增，经琼脂糖电泳检测可以获得多态性。后人由R A P D 标 记发展了S C A R 标记，采用的方法是将R A P D 扩增进行末端测序，设计特定引物，对 基因组D N A 再进行分析。相比R A P D ，S C 蜥记更加稳定可靠。 1 4 S S R ( S i m p l eS e q u e n c eR e p e a tS S R ) 标记的基本原理是利用在物种或品种间微 卫星序列的重复次数的不同，根据重复序列的两边的相对保守序列设计特异引物进 行P C R 扩增，扩增出微卫星位点( T a u t ze ta 1 ，1 9 8 9 ) 。I S S R 分子标记技术( Z i e t k i e w i c z e ta 1 ，1 9 9 4 ) 是由S S R 演变出的一种技术类似的标记，特异序列来源于简单重复序列 区域。 基于P C R 扩增和限制性酶切技术相结合的分子标记。这类分子标记以A F L P 为代表。A F L P ( A m p l i f i e dF r a g m e n tL e n g t hP o l y m o r p h i s m ) 是V o sE h19 9 5 年提出，可 以看作是R F L P 和R A P D 两种技术的结合( V o se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。基本原理是采用两种不 同的限制性内切酶对基因组D N A 进行酶切，在酶切得到的片断末端接上双链接头， 根据接头核苷酸序列和酶切位点设计引物，对酶切片段进行P C R 扩增，最后用P A G E 胶检测多态性。该技术的优点多态性特别丰富，一般每对引物可以扩增得到5 0 1 0 0 条带，然而技术要求较高。 新一代的分子标记技术。随着分子标记开发技术的日趋进步，出现了各种 新型的分子标记，其中以最具发展前途的S N P 标记作为代表( 陈兆波，2 0 0 9 ) 。 S N P ( S i n g l eN u c l e o t i d eP o l y m o r p h i s m s ) 主要体现在单个碱基的转换、颠换、 缺失或插入引起的突变，使得个体之间D N A 序列出现多态性，S N P 在基因组中出现 的比例约为1 o ( C h a s m a ne ta 1 ，2 0 0 1 ) ，研究表明，S N P 比S S R 分布密度更大，S N P 多数为二态性，这种新的分子标记正逐渐被研究者广泛使用。 候选基因标记技术由于在分子辅助选择方面的巨大优势而被广泛应用。作为某 个性状的候选基因( C a n d i d a t eG e n e ，C G ) 通常是指一些已知核酸序列和功能的基因， 它们参与性状的生长发育和调控过程，既可能是结构基因或调节基因，还可能是调 控生化代谢从而影响性状表达的基因。 1 2 5 2Q T L 定位研究 长期以来，数量遗传学是以统计原理为前提，将控制数量性状的多基因系统作 为整体来研究分析，通过数理统计的方法来剖析描述Q T L 的遗传特征，但是无法确 定控制数量性状的Q T L 数目，以及具体Q T L 在染色体上的位置及其遗传效应( 方宣 钧，2 0 0 2 ) 。2 0 世纪8 0 年代以