毕业设计（论文）-高效液相色谱法对样品的分离与纯化.doc

高效液相色谱法对样品A的分离与纯化目 录摘要IAbstractII引 言1第1章 绪论21.1高效液相色谱简介21.1.1正相色谱和反相色谱21.1.2制备色谱的概况31.2高效液相色谱柱选择与使用61.2.1色谱分离模式的选择61.2.2制备型高效液相色谱柱7第2章 样品中杂质的分离与纯化92.1实验仪器92.2实验试剂92.3实验步骤9第3章 结果与讨论18结 论19致 谢20参考文献21 高效液相色谱法对样品A的分离与纯化摘要：高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生物化学中、医药品、化学、环保、生命科学和食品工业的研究上。本论文采用反相高效制备液相色谱对样品A进行了分离，纯化和制备。在样品的制备过程中，对流动相、洗脱梯度、进样量、色谱柱的种类等制备条件进行了优化。优化出制备条件后，使用制备型高效液相色谱对样品进行分离纯化，收集大量样品目标峰的馏分，进行减压蒸馏和冷冻干燥后，得到干燥的样品。经LC-MS检测，其纯度仅有89.733%。通过对液相色谱分离条件的再次优化，经过多次的制备分离，对样品进行富集。经LC-MS检测，最终纯度达到了100%。该方法操作简单，方便，安全性强，污染性小，检测限低。关键词: 高效液相色谱 反相 分离 制备Separation and Purification of Compound A by High Performance Liquid ChromatographyAbstract: High performance liquid chromatography as an important analytical method, widely used in chemical and biochemical, medicine, chemical, environmental protection, life sciences, and food industry research. The samples were separated, purified and prepared by reversed phase high performance liquid chromatography. In the preparation of the sample, the preparation method was screened, including the mobile phase, the elution gradient, the injection volume, the type of column and so on. After the preparation conditions were optimized, the samples were separated and purified by preparative high performance liquid chromatography, and the fractions of the target peaks were collected. After vacuum distillation and freeze drying, the dried samples were obtained. The purity was only 89.733% by LC-MS analyze. The sample was enriched by re-optimization of the separation conditions of the liquid chromatography and by several preparative separations. By LC-MS detection, the final purity is 100%. The method is simple, convenient, high safety, less pollution, low detection limit.Key words: high performance liquid chromatography; reverse phase; separation; preparation21引 言制备型高效色谱是利用“吸附-洗脱”的原理进行分离纯化。在国外已有多年的发展，而在我国只是在20世纪90年代末期才渐渐开始普及。近年来，随着生物化学，有机化学，制药行业等相关行业的快速发展，制备型高效液相色谱已经越来越广泛的被应用在相关项目和产品的产业化之中。随着高效液相色谱的快速发展，出现了各种新的色谱技术。其中，反相高效液相色谱因其分离效果好，选择性高等优点，已成为分离纯化天然产物的重要方法。一般的高效液相色谱在分离样品的过程中，由于色谱技术的限制，导致色谱柱固定相上的载体流失。反相高效液相色谱是为了解决这一问题而发展出来的一种新型分离技术。反相液相色谱技术是将有机官能团和烷基硅胶载体表面的游离羟基通过化学反应键合而成。化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由学键合固定相制备的反相液相色谱柱具有分离效果好，使用时间长，重现性好，对各种有机化合物都有很好的选择性，使用梯度洗脱等优点，避免了分配色谱法的缺点。第1章 绪论1.1高效液相色谱简介早在20世纪初就出现的色谱分离技术已经成为有机化学和生物化学中一项十分重要的分离与纯化技术。随着生物技术的快速发展，特别是重组DNA技术和杂交瘤技术的广泛应用，某些以生物活性大分子为主的重要生物制剂和药品(如干扰素，生长激素，标准蛋白质等)，采用传统的分离提纯技术如超滤，萃取，沉淀，超离心等往往达不到所需要的纯度要求。人们在对高效的分离与提纯技术的探索中，将研究的重点转向了色谱分离法，进而促进了色谱分离技术的快速发展，使得色谱分离在理论上由线性色谱发展为非线性色谱，在实践中由分析规模发展为制备规模和生产规模1。近十几年以来，高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)已成为当代的高效分离与提纯技术的研究前沿。1.1.1正相色谱和反相色谱高效液相色谱分为正相色谱和反相色谱2。正相色谱和反相色谱又分为吸附色谱和极性化学键合色谱。其中，正相吸附色谱中流动相的极性小于固定相的极性，流动相一般采用甲醇/正庚烷，乙醇/正庚烷等溶剂，由于使用梯度洗脱时，基线漂移过大，正相色谱的洗脱程序一般为等度洗脱。正相色谱的出峰时间为非极性物质先出峰，极性物质后出峰。反之，反相色谱中流动相的极性大于固定相的极性，流动相一般使用水/乙腈，水/甲醇等溶剂，反相色谱的出峰时间为极性物质先出峰，非极性物质后出峰3-5。由于极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相色谱系统一般适用于分离极性化合物，反相色谱系统一般适用于分离非极性或弱极性化合物。表1.1列出了正相吸附色谱和反相分配色谱的部分特点。反相色谱在使用液相色谱分离中最为广泛。反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而进行分离6。在生物大分子分离中，采用的流动相一般为添加一定量缓冲盐的低离子强度的水溶液，再与乙腈或甲醇以一定的比例混合。一般都是使用两个色谱泵来分别抽取不同的溶剂，混合均匀后输送进色谱柱。表1.1 正相色谱与反相色谱对比正相色谱反相色谱极性固定相流动相固定相流动相固定相极性非极性流动相己烷，庚烷等非极性溶剂甲醇，乙腈，四氢呋喃等极性溶剂出峰顺序极性物质后出峰非极性物质后出峰洗脱程序等度洗脱梯度洗脱缓冲溶液一般不添加缓冲溶液添加TFA，NH3HCO3，HCL等缓冲溶液调节pH适用范围分离极性化合物分离非极性或弱极性化合物1.1.2制备色谱的概况在医药开发的每个阶段，制备色谱都起到很重要的作用。例如，在目标化合物鉴别的阶段，需要多维制备色谱保证得到高纯度的样品，以便于测试生物活性。在动物体内测试阶段，需要制备色谱分离出实验室所需要的大量的潜在药物，来保证实验室级别验证药物的安全性及药效。在生产阶段，需要简化纯化工艺，建立最经济的分离生产流程，而制备色谱以其低投入，高产出，分离效率高等特点可以说是最佳选择。因此，其在国内的需求越来越大7-9。制备色谱根据制备样品量的多少可简单分为半制备色谱(百毫克级)，制备色谱(克级)以及大规模制备色谱(千克级)。实验室常用的制备色谱有反相色谱(RPLC)，固定相为非极性固定相(如C18，C8，苯基和氰基等)，流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈，异丙醇等。超临界流体色谱(SFC），固定相为HPLC的大多数固定相，常用的非手性固定相有氰基，氨基，苯基，二醇等。常用的手性固定相是多糖衍生物，如AD，AS，OJ，OD等，流动相为超临界CO2和甲醇或异丙醇等。制备色谱由进样系统，泵，制备柱，检测器，馏分收集器等5个部分组成，这5个部分通过工作站连接并进行控制。制备型高效液相色谱并不是分析型高效液相色谱的简单放大，它与分析型高效液相色谱有很多不同之处。分析型高效液相色谱的特点是峰形好，分离度高，定性分析、精确度高、分析时间短，使用的色谱柱的差别10等。分析色谱需要全面的反映出样品组成的信息，具有高灵敏度、分析速度快、进样量少、不需要收集特定的馏分等优点，洗脱液通常废弃。同时分析色谱要求信噪比小，检测下限低，以取得可靠的分析数据；而制备液相色谱的要考虑的因素有Work up的简易度、回收率、收集馏分的纯度(分离效果好）、上样量(处理量）、时间(分离速度快），安全性以及成本(花费低）等11-15。在制备型高效液相色谱中，目标产物的产量、制备纯度、生产周期还有系统的运行成本等是要考虑的主要因素。在产品的纯度达到目标要求后，产品的生产费用就成为优先考虑的因素，以便节约投入，提高效益。所以，在制备型高效液相色谱中经常采用非线性进样。一般的，我们把组分在固定相和流动相的平衡浓度呈正比关系，吸附(分配)等温线为一条直线的色谱成为线性色谱。由于分析型液相色谱进样量很小，样品在流动相和固定相之间的浓度关系都呈线性，因此，分析型液相色谱基本上是在线性色谱范畴下工作，色谱峰符合高斯分布函数16-17。而制备型液相色谱基本在非线性色谱范畴下工作，非线性色谱的特点就是色谱峰的峰形不对称，对于Langmiurian型，色谱峰出现拖尾；对于Antilangmiurian型，色谱峰出现伸舌现象。同时，色谱峰的保留时间会随着样品进样量的大小而发生变化。当进样量超过一定数值后，峰宽增加。图1.1 线性色谱 图1.2 色谱峰拖尾 图1.3 色谱峰伸舌图1.4 增大进样量后保留时间提前表1.2 制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱的对比制备型HPLC分析型HPLC目的样品中特定成分的高纯度，大量廉价地获取定性分析：检测的灵敏度定量分析：分离度，再现性馏分收集装备馏分收集器，以自动收集馏分无进样量半制备100 mg制备0.1-100 g 生产规模0.1 g进样量小于5 mg泵泵能承受更大的压力流通池检测器的流通池能承受更大的流速，可达到150mL/min一般分析型流通池允许的最大流速仅为5 mL/min或10 mL/min流速1-150 mL/min0.001-9.999 mL/min色谱柱直径较粗，填料颗粒较大。柱负荷为不影响收集组分纯度时的最大进样量直径较细，填料颗粒较小。柱负荷为不影响柱效时的最大进样量线性非线性色谱线性色谱联系在进行制备型HPLC之前，常需先进行分析型HPLC实验，对分析方法进行优化，放大后再应用到制备型HPLC中。制备型高效液相色谱同分析型高效液相色谱一样，色谱柱是其最核心的部件。传统的制备型高效液相色谱采用的是简单的管状柱，往色谱柱里填充的是大颗粒的无定形填料，从而造成色谱柱的柱效较差，分离效果不稳定，而且重现性不好，同时由于应用等度洗脱技术，需要大量的流动相，导致收集到的馏分中产物的浓度较低，后处理工作量太大，浪费溶剂等缺点。因此在很长一段时间里发展速度较为缓慢。在近代制备型液相色谱中，高效液相色谱发展速度最快，应用范围最广18。现代的制备型高效液相色谱柱具有以下特征：(1) 色谱柱的内径长，柱长短，外形呈圆饼状。(2) 色谱柱填料的颗粒较小，分布范围很窄。(3) 流动相的流速较高，以便于提高馏分中的样品浓度，加快生产周期，降低生产成本。制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱在系统参数的优化上有很大不同。如表1.2所示。1.2高效液相色谱柱选择与使用1.2.1色谱分离模式的选择表1.3 样品选择分离方式的依据样品分子量小于2000溶于有机溶剂溶于正庚烷用硅胶的正相模式用键合相的正相模式溶于甲醇或乙腈或甲醇/水或乙腈/水用键合相的反相模式溶于水溶于四氢呋喃用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱非离子化用键合相的反相模式离子化抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式用硅胶的正相模式离子交换模式样品分子量大于2000溶于有机溶剂凝胶渗透色谱溶于水凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式对于一个未制备过的样品，需要先选择分离模式。一般选择分离模式根据以下基本原则。对于分子量小于2000的样品来说，根据样品是否溶于水还是溶于有机溶剂。假如溶于有机溶剂，例如正庚烷，考虑使用硅胶的正相模式或使用键合相的正相模式进行分离。如果溶于甲醇或溶于乙腈或甲醇/水或乙腈/水等使用键合相反相模式进行分离。如果溶于四氢呋喃，可以使用键合相的反相模式或低分子凝胶渗透色谱进行分离。如果溶于水则一般使用反相色谱进行分离。对于分子量大于2000的样品，如果溶于有机溶剂一般用凝胶渗透色谱19进行分离。如果溶于水，一般使用大孔填料的反相模式或大孔调料的离子交换模式进行分离。表1.3列出了选择分离模式的部分依据。1.2.2制备型高效液相色谱柱现在常用的制备型高效液相色谱柱填料有：(1) Al2O3基质。使用该基质制成的色谱柱对强酸强碱的稳定性都很好，工作时的pH范围是1-14。但是化学修饰较为困难。(2) 聚合物基质。使用该基质制成的色谱柱对强酸强碱的稳定性都很好，工作时的pH范围1-13；可进根据不同色谱的需求进行表面化学。但是该基质孔径结构复杂，孔径分布范围广，导致柱效不够高；另外，使用的有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨或受损。(3) 硅胶基质。该基质是目前使用最广泛的基质材料，使用该基质制成的色谱柱机械强度高。比表面积高，在中等pH条件下对强碱物质分离度高，分离速度快，重现性好，可利用不同的表面键合反应来满足正相、反相、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。但是硅胶基质工作的pH范围是3-8，在过低或过高的pH下都容易溶解。而且带酸性的硅羟基和碱性表面易导致强碱物质拖尾20-22。影响C18色谱柱性能的物理因素有：(1) 硅胶纯度。硅胶纯度是指硅胶填料的纯度和硅胶残留的金属离子浓度。硅胶纯度对强极性化合物的分离有较大影响。A型硅胶（硅胶纯度较低）：是由金属硅酸盐制备而成，残留金属含量较高，可用作中性化合物和非离子化合物的分离。但由于带负电荷的残留硅羟基和碱性表面上金属含量高（硅羟基的PKa低，金属离子使硅羟基酸性增强50倍），容易导致分离碱性化合物时色谱峰拖尾。B型硅胶（硅胶纯度高，酸性较弱的硅胶）：通过无金属的工艺制备而成，只含有微量的金属。适合分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。(2) 色谱柱尺寸对色谱分离的影响：短柱(2.1 mm)检测器灵敏度高；宽柱径(3-21.2 mm),载样量高。(3) 当使用黏度较大的流动相，如50：50=MeOH：H2O时，球形颗粒可降低柱压，延长色谱柱寿命。(4) 较小的颗粒柱效高，但会引起柱压过高。3.5 um粒径的常用于分离复杂的多组分样品，而组分单一的样品多采用5 um的粒径。(5) 高表面积对于多组分样品的分离具有较强的保留能力，柱容量和分离度。表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态，对于梯度洗脱尤为重要。(6) 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间，达到充分分离，改善峰形23-26。影响C18色谱柱性能的化学因素有：(1) 键合类型。单键键合-键合相分子与基体单键相连，单齿键合提高传质，加快色谱柱平衡。聚合体键合-键合相分子与基体多点相连，双齿键合，增加色谱柱稳定性，增加色谱柱的载样量。填料稳定性提高了，组分的保留时间重现性就好。(2) 碳含量。即为填料中的含碳量，传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂，然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量。高碳覆盖率能提高分辨率，同时分析时间延长。低碳覆盖率能够缩短运行时间。可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量27。含碳量的增加有利于不易保留化合物的分离。但是不能单独以碳含量来预测色谱行为，它还与硅胶的密度，键合相的密度，填料的表面积等有关系。(3) 封端。封端能减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象，对于极性样品28-32，未封端与经过封端处理的色谱在性能上有明显差异。第2章 样品中杂质的分离与纯化2.1实验仪器美国Agilent 1200 Serise LC/MSD VL高效液相色谱质谱联用仪(分析型)，VWD紫外可变检测器,Agilent 1200自动进样器,Agilent液相色谱工作站日本Shimadzu LC-20A高效液相色谱(制备型)，包括系统控制器,LC-20AP色谱泵，手动进样阀，SPD-20A二极管阵列检测器，Lc-Solution色谱工作站。KQ-250型超声波清洗器(昆山市淀湖区检测仪器厂)，FDU-2110冷冻干燥机(东京理化器械株式会社)，旋转蒸发仪(上海贝凯生物化工设备有限公司)。2.2实验试剂制备纯乙腈(美国SIGMA-ALDRICH公司)；色谱纯三氟乙酸(TFA)(北京百灵威科技有限公司)；分析纯碳酸氢铵(上海润捷化学试剂有限公司)；水为自制重蒸馏水，并经过微孔过滤膜过滤。2.3实验步骤(1) 样品的总质量为48 g，要求制备的纯度达到98%，而且不少于40 mg。其中目标峰的理论产量为（48 g0.22%）105mg。检测样品的分析方法是使用Agilent Zorbax Bonus RP (75 mm* 4.6 mm, 3.5 m)色谱柱，检测波长为220 nm，柱温为30，流动相流速1.5 mL/min，进样量5L。流动相为A组分0.05% TFA in Water (v/v)，B组分0.05% TFA in ACN (v/v)。洗脱梯度设置为B组分的体积浓度在0-30分钟内从10%上升至38%，在30-38分钟内从38%上升至95%，然后停止工作。得到的样品信息如下图2.1，2.2所示。目标峰已经被标出，MS显示样品的相对分子质量为413。图2.1 样品A的液相色谱图图2.2 样品A的质谱图（2） 取少量样品于分析瓶中，添加适量乙腈和水溶解成大约1mL,用LC-MS分析检测。分析条件为使用分析型Xbriage C18(1504.6 mm I.D 5um)反相色谱柱，流动相为A组分0.05% TFA in Water (v/v)，B组分为0.05% TFA in ACN (v/v)。洗脱梯度设置为在0-15min内，B组分体积浓度从10%上升至80%。进样量为3 uL。流动相流速为1 mL/min。检测波长为220 nm。温度为20。分析得到的色谱图如图2.3，2.4所示。根据MS显示的分子量判断保留时间为8.608的峰即为目标峰，其含量为0.22%。根据洗脱的梯度计算，样品大约是在流动相中乙腈的浓度为40%的时候出峰。根据分析型反相色谱柱和制备型反相色谱柱的柱效的差别，以及制备型高效液相色谱和分析型液相色谱的不同，大致确定了样品的制备条件。图2.3 样品A的高效液相色谱图图2.4 样品A的质谱图(3) 准确称取2.0 g样品，精确到0.01 g。放置于100 mL圆底烧瓶中，加入约40 mL水和乙腈(体积比例为2：3）的混合溶液溶解。混和均匀后发现含有少量不溶的杂质，用超声波清洗器超声5min后，杂质溶解，混合均匀后静置。(4) 根据检测样品得到的分析结果，采用含有NH4HCO3的碱性体系，使用使用Synergi C18反相色谱柱(10 um，25050mm I.D)。流动相为A组分0.1% NH4HCO3 in Water (v/v)，B组分为乙腈。为梯度洗脱程序设置为在50min内B组分体积浓度从50%上升至100%。流动相流速为100mL/min。检测器检测范围为全波长，检测波长为220 nm，254 nm，温度为20。在开始工作之前先使用100%的乙腈冲洗柱子20 min，以保证色谱柱内残留的样品等杂质影响制备效果。制备得色谱图如图2.5所示。 (5) 经LC-MS检测，样品对碱性体系不稳定，拟使用含有TFA的酸性体系。优化后的制备条件为使用Synergi C18反相色谱柱(10 um，25050mm I.D)。流动相为A组分0.1% TFA in Water (v/v)，B组分为乙腈。为梯度洗脱程序设置为在50min内B组分体积浓度从50%上升至100%。流动相流速为100 mL/min。检测器检测范围为全波长，检测波长为220 nm，254 nm，温度为20。在开始工作之前先使用100%的乙腈冲洗柱子20 min，以保证色谱柱内残留的样品等杂质影响制备效果。然后加载预设的液相色谱条件。让柱子达到平衡状态，等色谱柱的压力稳定后即开始进样，第一次的进样量为0.2 g。制备得色谱图如图2.6所示。由于样品的杂质较多，而目标峰的含量仅有0.22%，只能多收集几个疑似的目标峰，然后再对收集的馏分用LC-MS进行分析。根据MS显示的分子量确定2号目标峰(收集的色谱馏分从0号开始计数)为所需要的目标峰。但是由于3号目标峰的影响导致2号的纯度不高，需要调整梯度洗脱程序。图2.5 碱性体系下得到的样品液相色谱图图2.6 酸性体系下得到的样品液相色谱图图2.7 优化制备条件得到的样品液相色谱图图2.8 样品多次制备的液相色谱图(6) 将制备型高效液相色谱的梯度洗脱程序设置为在50 min内B组分体积浓度从45%上升至95%。其它制备条件保持不变。制备得到的色谱图如下图2.7所示。一次制备完成后，再用100%的乙腈洗脱色谱柱20 min，使残余在色谱柱上的样品能够完全冲洗下来，然后再用比例为45%的乙腈使色谱柱完全平衡，以形成一个完整的色谱过程。(7) 经过优化色谱条件后，根据优化的制备条件，即可进行大批量制备。同时，为提高效率，减少生产成本。采用非线性进样方式，在满足样品的分离度的前提下，逐渐增大样品的进样量。最终的进样量为0.4 g。此时，样品的进样量已经无法增加。但是，在连续制备过程中，由于未知原因导致Synergi C18反相色谱柱的柱效变差。即使将洗脱梯度降低为在50 min内乙腈的体积浓度从0%增加到30%依然无法分离样品。导致无法再进行制备分离。制备得到的色谱图如图2.8。可能是由于样品吸附在柱子，导致此种现象的发生。 (8) 由于Synergi C18反相色谱柱无法分离，改使用Luna C18反相色谱柱（10 um，25050mm I.D）。流动相为A组分0.1% TFA in Water (v/v)，B组分为乙腈。为梯度洗脱程序设置为在50min内B组分体积浓度从45%上升至95%。流动相流速为100 mL/min。检测器检测范围为全波长，检测波长为220 nm，254 nm，温度为20。在开始工作之前先使用100%的乙腈冲洗柱子20 min，以保证色谱柱内残留的样品等杂质影响制备效果。然后加载预设的液相色谱条件。让柱子达到平衡状态，等色谱柱的压力稳定后即开始进样，第一次的进样量为0.2 g。制备得到的色谱图如图2.9所示。同时，在满足样品的分离度的前提下，逐渐增大样品的进样量。最终的进样量为0.4 g。(9) 最终，通过多次分离纯化，对样品的目标峰进行了大量的收集。然后再将收集到的馏分通过旋转蒸发仪在40的条件下减压蒸馏除去馏分中的有机溶剂，再用冷冻干燥机除去馏分中的水。最后得到的样品为76 mg。取少量用LC-MS对冻干样品的纯度进行分析检测，得到的分析结果如图2.10，2.11，2.12 。经检测，样品的纯度仅有89.733%，尚未达到要求的98%的纯度，需要对样品进行第二次制备提纯。图2.9 Luna色谱柱制备得到的样品色谱图(10) 将冻干的样品全部转移到50 mL圆底烧瓶里，使用乙腈和水的混合溶液(乙腈：水=3：2)溶解成约20 mL溶液。采用的制备型高效液相色谱制备条件为为使用Luna C18反相色谱柱(10 um，25050mm I.D)。流动相为A组分0.1% TFA in Water (v/v)，B组分为乙腈。为梯度洗脱程序设置为在50min内B组分体积浓度从40%上升至90%。流动相流速为100 mL/min。检测器检测范围为全波长，检测波长为220 nm，254 nm，温度为20。进样量为20 mg。制备得到的色谱分离图如图2.13。通过对样品的目标峰进行大量的收集，对样品进行二次制备。然后再将收集到的馏分通过旋转蒸发仪在40的条件下减压蒸馏除去馏分中的有机溶剂，再用冷冻干燥机除去馏分中的水。最后得到的样品质量为63 mg。取少量样品用LC-MS进行分析检测，确认第二次制备得到的样品纯度为100%。图2.10 第一次制备得到的样品液相色谱图图2.11 第一次制备得到的样品质谱图图2.12 第一次制备得到的样品质谱图图2.13 第二次制备得到的样品色谱图第3章 结果与讨论本论文是使用制备型高效液相色谱对样品进行分离和纯化，样品的理论含量是105 mg，实验的要求是得到40 mg样品，并且要求样品的纯度不少于98%。最终共制备获得了63 mg的样品，纯度为100%。可以说已经圆满完成了任务。但同时，在制备过程中也遇到了很多困难。本次实验使用的流动相是乙腈/水，在水中添加了0.1%的缓冲盐（TFA/NH3HCO3）以调节pH。就是因为不同的pH环境下，色谱柱对样品的分离效果和色谱峰的峰形不同。例如本次实验，在碱性环境下，目标峰并没有显现出来，在酸性环境下，就能分离出来。且分离效果很好。在制备过程中由于添加的缓冲溶液使蛋白质或多肽等样品的空间构型会发生变化，或成盐，但一般去除这些因素后都能恢复，且添加缓冲盐后，峰形会很好。传统的制备液相色谱使用的是等度洗脱，在洗脱样品的过程，流动相的组成保持不变。存在洗脱时间长，分离效果差，馏分中样品的浓度较低等。应用梯度洗脱技术，选择合适的梯度就可以改善分离度，缩短分析时间，能够分离复杂的样品，色谱的峰形也比较好。理论上Synergi C18反相色谱柱的柱效好，柱压高，分离效果大于Luna C18反相色谱柱。在这次样品制备中，Synergi C18反相色谱柱的分离度很差，推测是因为少量样品吸附在色谱柱上，导致分离度变差。在停止制备后使用100%乙腈对Synergi C18反相色谱柱长时间冲洗后，检测器检测到有吸收，基本确定色谱柱柱效差的原因。在制备过程中，由于不够熟练，在收集样品以及转移样品过程中，损失部分样品，导致收率仅有60%。因此，我仍需要严格要求自己，提高技术水平，以更好的应对今后的工作。结 论本实验使用Shimadzu LC-20A制备型高效液相色谱对样品A进行分离纯化。在进行制备前，先使用Agilent 1200 Serise分析型高效液相色谱对样品进行检测，根据分析的结果选择使用Synergi 色谱柱，流动相里添加0.1%碳酸氢铵的碱性体系，制备结果发现样品对碱不稳定。将流动相改为添加0.1%TFA的酸性体系进行制备，在持续制备过程中，发现部分样品吸附在色谱柱上，导致色谱柱柱效变差。在更换为Luna色谱柱后，仍采用含有0.1%TFA的酸性体系流动相，对样品进行了第一次制备。经LC-MS检测，制备得到的样品纯度达到了89.733%。对制备条件进行优化后，进行了第二次制备分离，最终的纯度达到了100%。本次制备开发的方法操作简单，方便，安全性强，污染性小，检测限低。参考文献1 白泉, 葛小娟, 耿信笃. 反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备J. 分析化学, 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