山羊BMP4基因多态性及其与生产性状关联性的研究-硕士论文

! 星! 星Y 垒旦Q 曼型i 也g ! = Q 坚盘h ! 鱼i ! 墨Q fg Q 堑墨 导师：陵墓堑副数援 专 论文提交 日 学位授予 日 I I II I II I II II III I IIIII Y 17 2 8 8 7 2 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论山羊B M P 4 基因多态性及其与生产性状 文题目相关性的研究 学位 农学硕士 级别 学生 张驰 学科动物遗传育种与导师 姓名专业繁殖姓名 陈其新 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：和次乡导师签名：7 皴! 刎 日期：冰铜衣日日期：年月日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的E O 届, J 本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。R ：，1 研究生签名：务状避一导师签名：( 眇矗易欹学院领导签名量三j J1 、f j1 日期： 庳，二月肛日 日期：年月 日 1 日期： 年月 日 致谢 本论文从选题、试验设计、试验实施到论文写作，都是在导师陈其新副教授 的悉心指导下完成的。导师渊博的学识、严谨求实的治学态度、开拓、诚信的风 范、敏锐的创新思维、忘我的工作精神和无私奉献的崇高品质将使我终生受益。 三年的学习生涯，导师在学习、科研工作和生活方面都给予了精心的指导和无微 不至的关心。在此，谨向恩师致以最崇高的敬意和最由衷的感谢。 在课题实施过程中，尤其感谢李明老师，对我各方面的莫大帮助，师恩难忘， 除了心中深深地感激，无以为报，唯有继续努力! 同时，感谢盛建华老师、刘忠 虎老师、孙桂荣老师、商艳红老师等在论文的选题、实验技术以及生活照顾等方 面中给予了我悉心的指导和帮助。 感谢冯富彦、王润之、张立恒、王同勋、李娜、张艳芳、党晓伟、冯军基等 同学与我一起度过了三年的研究生学习生活。 感谢师弟周建设、武强、刘相波、师妹秦楠、洪雪莹、和本科实习生陈伟南 等，在试验和论文写作过程中都给予我许多无私的帮助和支持，从各方面都给予 我很大的帮助，并且共同创造一个良好的实验气氛，令人难忘。 本论文研究的样品采自宁夏中卫山羊保种场、安徽黄淮山羊保种场、河南波 尔山羊保种场，在采样的过程中得到了各位同行的和工作人员的大力支持和帮 助，在此表示衷心感谢! 最后，我要感谢我的家人多年来对我的莫大鼓励与支持，特别是我的父母、 兄弟，我的每一个进步都凝聚着他们的辛劳与希冀，他们的理解与支持是我坚持 不懈的动力。 张驰 2 0 1 0 年6 月 目录 中文摘要 l 文献综述1 1 1 山羊品种资源概况l 1 1 1 黄淮山羊品种资源概况1 1 1 2 中卫山羊的品种概况2 1 1 3 波尔山羊的品种概况2 1 2B M P 4 基因的结构和功能研究2 1 2 1 骨形态发生蛋白4 ( B M P 4 ) 的基因结构3 1 2 2 骨形态发生蛋白4 ( B I V I P 4 ) 基因的生物学功能4 1 2 3B M P 4 基因多态性及其与动物生产性能的研究4 1 2 4 B M P 4 与哺乳动物卵泡发育的关系5 1 2 4B M P 4 基因的信号调控机制6 1 2 4 1B M P 4 受体种类及结构6 1 2 4 2B M P s 受体的生物学特性7 1 2 4 3S m a d s 蛋白的结构及分类7 1 2 4 4S m a d s 介导的信号传导7 1 3 生物多态性分子标记技术的研究，8 1 3 1 单链构象多态性( S i n g l e - S t r a n dC o n f o r m a t i o nP o l y m o r p h i s mS S C P ) 9 1 3 1 1 单链构象多态性技术( P C R S S C P ) 原理9 1 3 1 2 单链构象多态性技术( P C R S S C P ) 特点一1 0 1 3 1 - 3 单链构象多态性技术( P C R S S C P ) 的应用1 0 1 3 1 4 单链构象多态性技术( P C R S S C P ) 的影响因素1 0 1 3 2 限制性片段长度多态性( R F L P ) 1 1 1 3 2 1 限制性片段长度多态性原理。1 l 1 3 2 2 限制性片段长度多态性技术特点1 1 1 3 2 3 限制性片段长度多态性技术应用l l l - 3 2 4 限制性片段长度多态性技术影响因素1 1 1 3 3 随机扩增多态性D N A ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cD N A ，缩写R A P D ) ：1 2 1 3 3 1 随机扩增多态性D N A 技术原理1 2 1 3 3 2 随机扩增多态性D N A 技术特点1 2 1 3 3 3 随机扩增多态性D N A 优越性和不足1 2 1 3 4 2 微卫星D N A ( M i c r o s a t e U i t eD N A ) 标记l2 1 3 4 1 微卫星分析原理l2 1 3 4 2 微卫星标记特点1 3 1 3 4 3 微卫星技术的应用l3 1 4 本研究的目的和意义。1 3 3 山羊B M P 4 基冈部分序列的克隆与分析1 6 3 1 材料方法1 6 3 1 1 试验动物1 6 3 1 2 主要仪器设备与试剂1 6 3 1 2 1 药品和试剂1 6 3 1 2 2 主要仪器设备1 6 3 1 2 3 溶液试剂配制1 7 3 2 P C R 反应一：! ( ) 3 2 1 5 U T R 部分序列的P C R 扩增反应体系2 0 3 2 2 内含子1 部分序列的P C R 扩增反应体系。2 0 3 2 33 U T R 部分序列的P C R 扩增反应体系2 l 3 2 4P C R 产物的回收和纯化2 l 3 2 5P C R 产物的连接2 2 3 2 6 连接产物的转化2 2 3 2 7 重组体的鉴定2 2 3 2 7 1B 半乳糖苷基因插入失活筛选2 2 3 2 7 2 重组质粒的P C R 鉴定2 2 3 2 7 - 3 重组质粒的测序2 3 3 3 结果与分析2 3 3 3 1 山羊血液基因组D N A 的提取2 3 3 3 2 山羊B M P 4 基因非编码序列的扩增与分析2 3 3 3 2 1 山羊启动子部分序列的P C R 扩增及重组质粒P C R 鉴定2 3 3 3 2 2 山羊分内含子1 部分序列的P C R 扩增2 4 3 - 3 2 3 山羊3 U T R 序列区的P C R 扩增一2 5 3 3 2 4 山羊B M P 4 基因克隆序列的测序2 5 3 3 3 克隆序列的比较分析2 5 3 3 3 1 B M P 4 启动子部分序列的测定及分析2 5 3 3 3 2B M P 4 基因启动子区域的转录调控元件分析2 7 3 3 3 3 山羊B M P 4 基因启动子序列同源性分析2 8 3 3 3 4 山羊B M P 4 内含子l 序列的分析2 8 3 3 3 5 山羊B M P 43 U T R 序列的测定及分析2 9 3 3 3 6 山羊B M P 4 基因3 U T R 序列同源性分析3 0 3 4 讨论3 0 3 4 1 血液基因组D N A 的提取3 0 3 4 2 基因组D N A 序列的克隆3 0 3 4 3B M P 4 基因启动子的结构研究31 3 4 3 1 B M P 4 启动子区域转录调控元件分析3 l 3 4 3 2 启动子序列进化研究分析3l 3 4 4 内含子的生物学功能、进化分析3 1 3 4 53 U T R 区域的调控功能3 2 3 5 结论3 3 4 山羊B M P 4 基冈的P C R - S S C P 3 4 4 1 实验目的3 4 4 2 材料方法3 4 4 2 1 药品和酶3 4 4 2 2 主要仪器设备3 4 4 2 3 分析T 具软件与网站3 4 4 2 4 溶液试剂配制3 4 4 2 5D N A 池的构建3 4 4 2 6P C R 反应条件3 5 4 2 6 1 引物设计3 5 4 2 6 2P C R 扩增3 5 4 2 7S S C P 凝胶制备及染色方法3 5 4 2 7 1 聚丙烯酰胺凝胶( 2 9 ：1 ，l2 ) 制备。3 5 4 2 7 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳“3 6 4 2 7 3 银染3 6 4 2 8R F L P 方法说明。3 6 4 2 9 基因型判定方法。3 6 4 2 9 1P C R S S C P 分型3 6 4 2 9 2 限制性酶切( R F L P ) 分型一3 7 4 2 9 3 微卫星分型3 7 4 2 9 4 克隆测序3 7 4 2 1 0 遗传多态性的统计分析3 7 4 2 1 0 1 群体基冈频率和基冈型频率。3 7 4 2 1 0 2 遗传多态性分析3 7 4 2 1 0 3 基因型与山羊生产性状的相关分析3 8 4 3 结果与分析3 9 4 3 1 山羊P C R S S C P 引物的扩增结果。3 9 4 3 1 1 引物1 的P C R 结果3 9 4 3 1 2 引物2 的P C R 结果3 9 4 3 1 3 引物3 的P C R 结果3 9 4 3 1 4 引物4 的P C R 结果4 0 4 3 2 山羊B M P 4 基冈S S C P 检测及序列分析4 0 4 3 2 1S S C P 检测分析4 0 4 3 3 不同基冈型测序结果4 2 4 3 4 基冈的遗传特征分析4 2 4 3 4 1B M P 4 内含子3S N P 基因型频率分析4 2 4 3 4 2B M P 4 基冈的遗传纯合度、杂合度、多态信息含量的分析4 4 4 3 4 1 3B M P 4 基因不同基因型山羊生产性状的比较分析4 5 4 3 4 4B M P 4 基因3 U T R 区微卫星序列基因型频率分析4 6 4 3 4 5 微卫星座位基因型与山羊体尺性状关系4 6 4 4 讨论4 7 4 4 1 血液样品保存及D N A 的提取。4 7 4 4 2 山羊血液D N A 池( D N A p 0 0 1 ) 的构建4 7 4 4 3P C R 反应影响冈素分析4 8 4 4 4P C R S S C P 影响因素分析。4 8 4 4 4 5 微卫星影响因素分析4 8 4 4 5B M P 4 基冈多态性分析4 9 4 4 5 1B M P 4 基因不同位点等位基因的分布4 9 4 4 5 2B M P 4 基因不同位点等位基因对生产性状的影响4 9 5 0 5 l 5 2 5 7 5 9 中文摘要 骨形态发生蛋白4 ( B M P 4 ) 属于转化生长因子超家族( T G 卜p ) 的重要成员之一，B M P 4 基因是机体生长发育过程中的必须因子，尤其在诱导骨骼的形成及生长方面具有重要的调控 作用。鉴于B M P 4 基因有如此重要的功能，故本实验以B M P 4 基因作为影响山羊生产性状的候 选基因，在分子克隆基础上，检测了山羊B M P 4 基因的多态性，并进行了不同基因型与生产 性状的关联分析，以期筛选出影响山羊生产性能的主效基因。 首先，提取血液基因组D N A ，并依据已知B M P 4 部分基因组序列为基础，设计3 对引物， 分别扩增山羊B M P 4 基因的启动子、第1 内含子以及3 U T R 序列。通过生物信息学分析方法， 确定了山羊B M P 4 的核心启动子序列以及3 U T R 的转录因子调控原件。结果分析表明，山羊 B M P 4 核心启动子无典型的T A T A - b o x 结构、和C A A T 框、G c 含量丰富，在- 2 5 0 一l O b p 范围 的核心启动子区域内发现了S P l ( s t i m u l a t i n gp r o t e i n1 ) 、T F I I - I 、h P - 2 a l p h a A ( a c t i v a t i n g e n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i n2a l p h a ) 、c E t s 一1 ( E 2 6t r a n s f o r m a t i o n s p e c i f i c ) 等转录 因子结合位点。同源性分析表明山羊、牛、猪、人和小鼠的B M P 4 启动子区域序列结构高度 保守，各物种间序列同源性分别为9 6 4 5 、9 0 7 9 、8 9 5 6 、8 2 2 6 。在3 U T R 区发现了 一个从T A 从多聚信号元件、2 个启动m R N A 快速降解的A T T T A 序列元件和一个C A 微卫星重 复序列。这些转录元件可能在调控m R N A 的稳定性方面具有重要的生物学功能。 在D N A 提取和山羊B M P 4 非编码基因组序列克隆的基础之上，通过P C R - S S C P 和P C R R L F P 技 术检测了山羊B M P 4 基因的分子变异。结果：在山羊B M P 4 内含子3 处检测到了两处突变；G 2 2 0 3 A 和G 2 2 1 4 C ，在3 U T R 区域的微卫星序列检测到了3 个等位基因，具有A A 、髓、c C 、A B 、 A C 和B c 等6 种不同的基因型。其中B B 等位基因为该微卫星序列的优势等位基因。群体遗传 学分析表明：2 2 0 3 和2 2 1 4 多态位点均为低度多态性( P P I C O 5 ) 。这意味着该多态性位点尚有较大的选育空间，我 们可以将该基因做为候选基因，进一步研究其与生长性状的相关性关系。 通过多重比较分析基因型对山羊体重、体高、体长等生长性状指标相关性关系。结果 表明：2 2 0 3 位点处，各基因型间，体长和管围的最 b - 乘均值均差异不显著( p 0 0 5 ) ，而 体重、体高等性状之间存在显著的差异性( p O 0 5 ) ；2 2 0 3 和2 2 1 4 位点合并基因型分析结果 与2 2 0 3 单位点分析结果一致； 3 U T R 区的微卫星多态性表明：B B 型个体体重指标与其他基 因型的个体之间存在显著的差异性( p O 0 5 ) ，而其他性状间差异不显著，该结果表明3 U T R 区的微卫星序列，可能与两个S N P 位点之间存在连锁关系。 故可以初步推断B M P 4 基因可能是影响山羊生产性状的一个主效基因或是与之存在紧密 遗传连锁的个分子标记。 关键词：山羊；B M P 4 ；S S C P ； l 文献综述 山羊具有耐粗饲、生长快、生产力强、疾病少等特点。自古以来我国就具有悠久的山羊 养殖历史，我国地域辽阔，环境条件不一，随着生产力的发展和地区民族间文化交流的加深， 人们开始对所饲养的山羊进行有目的地选择培育，逐渐形成了具有本身品种特征的地方品 种。据联合国粮农组织( F A O ) 统计，2 0 0 4 年世界山羊存栏量大约7 6 1 2 亿只，而我国存栏 量为1 8 3 3 6 亿只，约占世界总量1 4 ，居世界首位，是名副其实的世界第一养羊大国。因 此，大力发展山羊养殖业，选育优质高产山羊品种，对促进国民经济发展，提高人们生活水 平具有重要意义。 1 1 山羊品种资源概况 1 1 1 黄淮山羊品种资源概况 黄淮山羊是一个历史悠久的优良山羊品种。分布在暖温带半湿润季风气候的黄淮平原， 是我国苏、鲁、豫、皖四省边界地区的一个著名的地方优良品种。1 9 8 0 年全国绵山羊调查组 将河南南部的槐山羊，安徽北部的阜阳山羊和江苏北部的徐淮山羊，统一命名为黄淮山羊。 其主要分布于河南的周口、驻马店、许昌、信阳、等地；安徽的阜阳、宿县、以及合肥、蚌 埠、等市郊；江苏的徐州、淮阴两地区，沿黄河故道及丘陵地区各县市1 1 】。 黄淮山羊体质结实，结构均称，骨骼较细，性情温顺、活泼，行动敏捷，素有“猴羊” 之称【2 1 。具有耐粗饲，抗病力强，对严寒和酷暑均具有良好适应性。公羊胸深大，前躯发达、 背腰平直，有雄姿1 3 1 。明弘治( 公元1 4 8 8 1 5 0 6 ) 年间安徽宿洲志，正德( 公元1 5 0 6 - - 1 5 2 2 年间颖洲志中均有养殖山羊的记载。清乾隆( 公元1 7 3 6 - - 1 7 9 6 ) 年间的安徽洲志中对 其皮毛做了评价：“猾子皮毛直色自之细小贵口货不及也。”黄淮山羊具有性成熟早、生成发 育快、四季发情、繁殖率高的特性。其早期生长发育快，周岁体重达成年体重的8 0 以上。 成年母羊平均体重2 5 6 7 公斤，屠宰率在5 0 左右。板皮质量好、肉质鲜嫩、膻味小，深受当 地人民喜爱。其缺点是个体较小，但通过与肉用山羊杂交，加强饲养管理，可提高黄淮山羊 的产肉性能。经普查统计，黄淮山羊各项体尺的变异系数在6 - 8 之间，遗传性状稳定。 黄淮山羊分布区域农业较发达，饲草饲料比较丰富，当地群众素有养羊习惯，产区存栏 约2 0 0 0 万只，是国内山羊最大群体之一。因此，对黄淮山羊生产性状和遗传多样性进行研究， 在开发利用我国地方有良品种资源以及保护山羊物种多样性方面都具有一定意义，还可以加 速改变我国养羊业周转慢、效率底、效益差的局面，为山羊的养殖产业提供更科学合理的养 殖措施。 国内学者管峰等以绵羊F e c B 、G D F - 9 和B M P l 5 为候选基因，同时选择绵羊6 号染色体与 F e c B 基因紧密连锁的6 个微卫星标记，分析其在黄淮山羊中的多态性及其与产羔数的关系。 结果表明：在黄淮山羊中均未发现F e c B 、G D F - 9 基因和B M P l 5 基冈突变H 1 。这说明上述基因可 能不是影响黄淮山羊繁殖性能的主效基因。 1 1 2 中卫山羊的品种概况 中卫山羊又名沙毛山羊是我国独特的裘皮用山羊品种，同样也是世界上唯一生产白色裘 皮的山羊品种。中卫山羊主要分布于宁夏的中卫、中宁、同心，甘肃中部的皋兰、会宁等县 及内蒙古阿拉善左旗等地。中卫山羊相比其他山羊品种而言，具有耐租饲、耐湿热、对恶劣 环境条件适应性好、抗病力强、耐饥渴等特点晦1 。 中卫山羊初生羔羊体躯宽深，四肢端正且结实。皮毛品质均佳，其被毛多弯曲且具丝质 光泽，有“中国马海毛”的美誉。中卫山羊裘皮花案清晰，花穗美观，轻暖如玉，不毡结。 成年羊头部清秀，面部平直，额丛生长毛一束，颏部具颏须，公母羊多有角，无角者少。中 卫山羊公羔初生重约2 5 k g ，母羔初生重约2 4 k g 。成年公羊体重2 5 3 0 k g ，母羊2 0 一- - 2 4 k g 。 中卫山羊肉质细嫩，味道鲜美，膻味小，是肉品中之佳品，深受广大人民群众喜爱，但是其 繁殖率相对较低，多为单胎砸1 。 1 - 1 3 波尔山羊的品种概况 波尔山羊( B o e rG o a t ) 是一个世界公认的肉用山羊品种。该品种原产于南非，作为种 用，已被非洲许多国家以及新西兰、澳大利亚、德国、美国、加拿大等国引进，最近几年引 入我国。波尔山羊被称为世界“肉用山羊之王”，是世界上著名的生产高品质瘦肉的山羊 品种。 波尔山羊具有体型大，生长快、屠宰率高、产肉多、肉质细嫩、适口性好、耐粗饲、 适应性强、抗病力强和遗传性稳定等特点。另外，波尔山羊的板皮品质极佳，属上乘皮革原 料。 波尔山羊属非季节性繁殖家畜，国外一年四季都能发情配种产羔，但一般5 - 8 月份发 情比例极少。母羊一般6 月龄成熟，由于在秋季性激素水平较高，秋季为性活动高峰期，而 春夏季性活动较少。一只公羊在放牧的情况下可平均配种1 5 头母羊；9 月龄以上平均可配 种3 0 头母羊。但因孕的季节性限制了它很难做到一年二胎，因而产羔率提高则意味着提高 了每头母羊和单位面积肉产量。 1 2B M P 4 基因的结构和功能研究 骨形态发生蛋白( B o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ，B M P s ) 属于转化生长因子家族 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rB ，T G F B ) 的一种多功能调节蛋白，B M P s 最早是从脱矿物质 的骨细胞外基质提纯出来的，后来将其植入动物的非骨形成位点，发现其能诱导软骨及骨组 织的形成，因此得名骨形态发生蛋白哺1 。目前已确认的B M P s 成员有3 0 多种，如B M P 2 、B M P 4 、 B M P 6 、B M P 7 、B M P l 5 等。随着深入的研究表明，B M P s 不仅能诱导异位骨的形成，而且能分泌 多种多肽信号转导因子，对多种细胞的增殖、凋亡、分化及器官的发育形成起着重要的调控 作用。 2 1 2 1 骨形态发生蛋白4 ( B M P 4 ) 的基因结构 B M P 4 是B M P s 家族中的一员，其基因序列首先由W o z n e y 等克隆获得，初称B M P - 2 b ， C e l e s t e 鉴于B 肝s 成员不断扩大，因此按其发现顺序命名，改称为B M P 4 饽1 。人B M P 4 基冈定 位于1 4 号染色体上，包括4 个外显子和3 个内含子，全基因跨越9 0 3 k b 的基因组区域”0 。 人B M P 4 基因c D N A 在转录过程中，不同组织、不同时期，由于选择性的剪切加工，而产生了 3 种不同的转录产物，其转录产物的差异只是外显子1 和内含子l 剪接位点不同，其编码序 列均相同。其中，转录本1 和2 由同一启动子( 启动子1 ) 转录，它们的第1 外显子和第1 内含子长度不同( 转录本1 2 8 6 b p 和3 1 5 0 b p ：转录本2 7 6 b p 和3 5 4 8 b p ) ，原因是由于不同的 剪辑位点造成的。转录本3 则由启动子2 转录，该启动子位于启动子1 的下游。因此，转录 本3 的第1 外显子和第1 内含子都比较短，长度分别为1 3 0 b p 、1 0 2 2 b p 。3 种转录本的其余 外显子和内含子结构一致，外显子2 、内含子2 、外显子3 、内含子和外显子4 的长度依次 为1 2 5b p 、1 0 4 8 b p 、3 7 3b p 、9 6 7 、1 1 5 2 b p 。3 种B M P 4 的编码序列相同，都是由第3 外显 子的后半部分和第4 外显子的前半部分组成的。人和小鼠的c D N A 全长1 2 2 7 b p ，编码4 0 8 个 氨基酸。而山羊的c D N A 全长1 2 3 0 b p ，编码4 0 9 个氨基酸，其中，与人和小鼠的B M P 4 相比， 山羊B M P 4 编码序列多三个碱基，故多编码一个氨基酸。山羊与绵羊、猪、人、小鼠、牛的 相应序列同源性分别为：9 9 4 3 、9 6 1 0 、9 4 9 6 、9 1 7 9 、9 9 1 9 ；这表明此基因在各物 种间具有高度的结构保守性。山羊与绵羊、牛相应序列的同源性达到了9 9 以上，证实了 山羊和绵羊、牛亲缘关系较其他物种更近。山羊B M P 4 基因全编码序列编码4 0 9 个氨基酸， 其前1 9 个氨基酸为信号肽，后1 1 6 个氨基酸为成熟肽，中间的2 7 4 个氨基酸为前肽，蛋白 的理论分子量为4 6 6 3 k D a 。氨基酸成熟蛋白区具有B M P s 家族的典型特征：七个半胱氨酸残 基。与绵羊、猪、人、小鼠和牛的同源性分别为：9 9 5 1 、9 8 5 3 、9 7 8 0 、9 8 0 4 、9 9 5 1 ， 因此更加证实了B M P 4 基冈是一种在进化上结构高度保守的基因。 9 3 4 8 05 ：珥8 85 3 4 9 0 5 3 4 9 2 图1 人B M P 4 基因3 种转录本形式 F i g1H u m a nb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n4t h r e et r a n s c r i p t s 3 1 2 2 骨形态发生蛋白4 ( B M P 4 ) 基因的生物学功能 B M P 4 具有多种生物学功能，可以促进软骨和骨组织形成，对骨组织，脑组织和脊髓组织 的生长、发育和分化有重要的凋节作用，同时也具有细胞凋亡和细胞信号传导的调节功能。 此外，B M P 4 与动物的生殖机能密切相关，研究者发现在早期胚胎发育过程中，B M P 4 与细胞的 凋亡和增殖密切相关，对细胞分化和器官发生、发育具有重要的意义，是胚胎发育中必不可 少的信号分子，从胚胎初始到组织器官的形成均有着重要的作用。研究发现小鼠胚胎早期就 可检测到B M P 4 的表达，早在6 5 日龄的胚胎组织中就可检测到，N 7 5 日龄时已广泛表达于胚 胎各组织中，贯穿于整个发育过程，对神经系统、泌尿生殖系统、心脏的形成以及上皮细胞 间的互作都起着重要的信号转导作用，另外B M P 4 在促进原始卵泡的发育及向初级卵泡的转化 过程中也起着重要的作用u 。 众多研究表明：B M P s 的表达都具有组织特异性规律。在许多物种如( 鸡、牛、猪、羊、 鼠等) 卵巢中均检测到了编码B M P 2 、3 、3 B 、4 、6 、7 和1 5 的m R N A 表达“引。在鸡的F 1 、F 2 和F 3 卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞中检测到B M P 2 、4 、6 和7 的表达，并发现在卵泡发育过程中， 所有B M P s 的m R N A 在颗粒细胞中均显著增加，同样在卵泡膜细胞中B M P 2 、4 和6 的m R N A 表达量在 各级卵泡中基本相似。F a t e h i 等对牛卵泡所做的免疫染色研究实验表明：B M P 2 和B M P 4 蛋白仅 存在于卵泡膜内侧和有腔卵泡大约2 5 的卵母细胞中1 1 3 o 正常生理浓度的B M P 4 和B M P 7 可以诱 导大鼠颗粒细胞的分化，促进F S H 诱导雌激素( 雌二醇) 的合成，抑制孕酮的合成和分泌1 。 对绵羊颗粒细胞进行体外研究表明，B M P 7 和B M P 4 不仅可以抑制孕酮的基础分泌，而且可以抑 制孕酮在F S H 束I J 激下的分泌n5 1 。 在小鼠中，B M P 4 、7 和1 5 调节颗粒细胞的类固醇合成，而B M P 6 和1 5 贝1 J 可以诱导细胞的增 殖。用B M P 4 处理过的卵巢与没有处理过的对照组比较，发育中的初级卵泡比例非常高，原始 卵泡的比例较少。再者，用B M P 4 抗体处理过的卵巢明显比未处理过的对照组小，这表明B M P 4 可以促进原始卵泡的发育及其向初级卵泡的转化”引。 在颗粒细胞体外培养液中添加重组的G D F 一5 和B M P 4 ，发现B M P R I B 突变减少了小型有腔卵 泡的分化活性，B M P 4 对野生型绵羊颗粒细胞的分化作用比对突变型有所增加；在含有F S H 的 培养液中二者都可抑制孕酮的分泌，但剂量依赖性差异明显( P 7 8 ) ，T r i s 碱，S D S 及其它试剂为进口或国产分析纯 3 1 2 2 主要仪器设备 P C R 仪器：M a s t e r c y c l e r ，P C R5 3 3 3 型( 德国E p p e n d o r f 公司) 1 0 虬，2 0 儿，1 0 0 儿，2 0 0 儿，1 0 0 0 虬移液器( 大龙) Z D X 一3 5 B 型不锈钢座式消毒器( 江苏太仓) 电热鼓风干燥箱( 上海博讯) 1 6 T S 一1 型转移脱色摇床( 江苏太仓) F X 一3 2 0 型电子天平( 上海) Q L - 9 0 1 旋涡混合器( 江苏太仓) W p 7 0 0 L 1 7 型微波炉 超净台( 苏州净化设备厂) T H Z C 型恒温振荡器( 江苏太仓) 恒温培养箱( 上海博讯) 电泳仪及电泳槽：J Y 6 0 0 + 稳压电泳仪和J Y - 2 4 A 型电泳槽( 北京君意) 高速冷冻离心机( 德国E p p e n d o r f 公司) 凝胶成像系统( 美国A l p h a 公司) 电泳仪，琼脂糖凝胶电泳槽等。 3 1 2 3 溶液试剂配制 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合G B T6 6 8 2 的双蒸水( 二级) ；高压灭菌 条件为1 0 3 4 1 0 5P a 压力，蒸汽灭菌2 0m i n 。 ( 1 ) 抗凝剂A C D ：在7 0 0m l 水中溶解柠檬酸4 8g 、柠檬酸钠1 3 2g 、葡萄糖1 4 7g ， 加水定容至1L ，高压灭菌。 ( 2 ) T r i s C 1 ( 1m o l L ) ：在8 0 0m l 水中溶解T r i s 碱1 2 1 1g ，用浓t t C l 调节p H 值 至8 0 ，加水定容至lL ，分装后高压灭菌。 ( 3 ) E D T A ( p H8 0 ) ，0 5m o l L ：在7 0m l 水中加入乙二胺四乙酸二纳( E D T A - N a 2 2 H 2 0 ) 1 8 6g ，加热剧烈搅拌，用N a O H 调节溶液的p H 值至8 0 ( 约需要2gN a O t D ，加水定容至 1 0 0m l ，高压灭菌。 ( 4 ) 血液D N A 抽提液：取lm o l LT r i s C 12 5m l 、0 5m o l LE D T A ( p H8 0 ) 5 0m l 、 1 0 S D S1 2 5m l 加水定容至2 5 0m l ，高压灭菌，室温保存。 ( 5 ) 蛋白酶K ( 2 0m g m 1 ) ：取蛋向酶K2 0m g 溶于1m l 灭菌双蒸水，- 2 0 C 冻存 ( 6 ) T E 缓冲液( p H8 0 ) ：取1m o l LT r i s C 1 ( p H8 O ) 1 0m l 、0 5m o l LE D T A ( p n 8 O ) 2m 1 加水定容至1L ，高压灭菌，室温保存。 ( 7 ) 磷酸缓冲盐溶液( P B S ) ：在7 0 0m l 水中溶解N a C l8 0g 、K C l0 2g 、N a 2 H P 0 41 - 4 4 g 、K H 2 P 0 40 2 4g ，用H C l 调：常p H 值至7 4 ，加水定容至1L ，高压灭菌，室温保存。 ( 8 ) T r i s 饱和酚( p i t8 0 ) ：新蒸苯酚，加入8 一羟基喹啉至终浓度0 1 ，加入等体积 O 5m o l LT r i s C 1 ( p i t8 0 ) 混合搅拌1 5m i n ，两相分开后移去上层，用等体积O 1m o l i T r i s C 1 ( p H8 0 ) 重复抽提至酚相p H 值大于7 8 ，加入0 1 体积含有0 2 1 3 一巯基乙醇的 O 1m o l LT r i s C 1 ( p H8 O ) ，保存于4 棕色瓶中并处于1 0m m o l LT r i s C 1 ( p n8 0 ) 覆盖之下。 ( 9 ) 氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) ：氯仿和异戊醇按照体积比2 4 ：1 混合，室温封口贮存。 ( 1 0 ) 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ：酚、氯仿和异戊醇按照体积比2 5 ：2 4 ：l 混合，保存 1 7 于4 C 棕色瓶中并处于0 1m o l LT r i s C I ( p H8 0 ) 覆盖之下。 ( 1 1 ) 冰乙醇( 7 0 ) ：取7 0m 1 无水乙醇加水定容至1 0 0m l ，一2 0 保存。 ( 1 2 ) T B E 缓冲液( 1 0 X ) ：在7 0 0m l 水中溶解T r i s 碱1 0 8g 、硼酸5 5g ，加入0 5m o l L E D T A4 0m l ，加水定容至1L 。 ( 1 3 ) T B E 缓冲液( 1X ) ：取I O T B E 缓冲液1 0 0m l ，加水定容至1L 。 ( 1 4 ) T B E 缓冲液( 0 5 ) ：取1 0 X T B E 缓冲液5 0m 1 ，加水定容至1L 。 ( 1 5 ) 溴化乙锭( 1 0m g m 1 ) ：在1 0m l 水中溶解溴化乙锭1 0 0m g ，按每1m 1 分装，4 保存。溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时应戴上手套，称量 时应戴口罩。 ( 1 6 ) 聚丙烯酰胺凝胶( 4 0 9 6 ，丙烯酰胺：N ，N 一甲叉双丙烯酰胺= 3 9 ：1 ) ：在8 0 0m l 水中 加入丙烯酰胺3 9 0g 、N ，N 乞甲叉双丙烯酰胺l Og ，定容至1L 。丙烯酰胺有毒性，配置和 使用丙烯酰胺溶液时应戴上手套，称量丙烯酰胺固体时应戴口罩。 ( 1 7 ) 聚丙烯酰胺凝胶( 3 0 ，丙烯酰胺：N ，N7 一甲叉双丙烯酰胺= 2 9 ：1 ) ：在8 0 0m l 水 中加入丙烯酰胺2 9 0g 、N ，N 一甲叉双丙烯酰胺1 0g ，定容至lL 。 ( 1 8 ) 过硫酸铵( 1 0 ) ：在8 0m l 水中溶解过硫酸铵1 0g ，定容至1 0 0m l 。 ( 1 9 ) 变性缓冲液：在9 8m 1 去离子甲酰胺溶液中加入溴酚兰2 5m g 、二甲苯氰F F2 5 m g 、甘油2 0 0 乩，0 0 1m o l LE D T A2 0 0 虬，混匀分装，4 C 保存。 ( 2 0 ) 乙醇( 2 0 ) ：取2 0m l 无水乙醇加水定容至1 0 0m l 。 ( 2 1 ) H N 0 3 ( 1 ) ：取lm lH N Q 3 加水定容至1 0 0m l 。 ( 2 2 ) A g N 0 3 ( 0 1 ) ：取0 1gA g N 0 3 加水定容至1 0 0m l 。 ( 2 3 ) 显色液：3 0 0m l 水中加入无水碳酸钠6g 、2 4 0 虬甲醛，混匀，用时现配。 ( 2 4 ) 乙酸( 4 ) ：取4m 1 乙酸加水定容至1 0 0m l 。 ( 2 5 ) L B 液体培养基配制：蛋白胨lg ，酵母粉0 5g ，N a C l1g ，溶于8 0m 1 水中， 调p H 值至7 0 ，定容至1 0 0m l ，高压灭菌。 ( 2 6 ) L B 同体培养基配制：蛋白胨lg ，酵母粉0 5g ，N a C ll g ，溶于8 0 m l 水中，加 琼脂糖1 5g ，调p H 值至7 O ，定容至1 0 0m l ，高压灭菌。 3 1 3 分析软件工具 ( 1 ) P C R 引物设计软件：O l i g o6 0 用于引物设计 ( 2 ) 同源性序列分析：D N A M A N 6 0 用于D N A 序列处理 【3 ) 转录起始位点和启动子区段预测：h t t p ：w w w c b r c j p r e s e a r c h d b T t ：S E A R C H h t m l h t t p ：a l g g e n 1 s i u p c e s r e c e r c a f r a