基于COSII标记的Solanum section Petota野生多倍体马玲薯的系统发育研究-硕士论文

薛万覃娶薪一：S 暂鎏 甄矿踞孺r 一：杪暂鎏 蕊矿而郓r 一：曾鎏 飘矿羽讽旷一：乙百垂 甄矿事骺F 一：I 曾鎏 1 霸虿瑶囵强旷一：剿干号曾鎏挺导 ：SY 回按 ：pY 豳基 ：CY 圆按 ：ZY 豳按 辈拉旦髯骖堂明 薰镑隹鞘哥霉雨蠲琊刃坩u o H 3 a s 埘材”W 晒明甚磐I I S 0 3 士髯 量旧 菅面 瑟扑 薹| 伞搽 粼 隶龆 。孙 - I 、 紧 q 仪 黎 辽 貅 书 避 一一。峰r ，一r “、- - “”。、- ，”i ko t 二 吲洲叫囚叫州斟叫l蹂匝双璐仪秘 刘矧叫斟哥别斟哥划吲矧删蚓酬矧澍捌皿硬仪秘 0 P h y l o g e n e t i cs t u d yo f w i l dp o l y p l o i dp o t a t o ( 勋励咒跖ms e c t i o nP P 砌m ) b a s e do nC o S I I A u t h o r ss i g n a t u r e ： S u p e r V i s o r ss i g n a t u r e ： T h e s i sr e V i e w e r1 ： D o u b l e - b l i n d T h e s i sr e v i e w e r2 ： T h e s i sr e v i e w e r3 ： T h e s i sr e v i e w e r4 T h e s i sr e v i e w e r5 ： C h a i r ： ( C o m m i t t e eo fo r a ld e f e n c e ) C o m m i t t e e m a n1 ： 里! Q 鱼墨墨Q ! h 塑g 丕i 坠里坠 C o m m i t t e e m a n2 ： ! Q 鱼墨墨Q ! Y 丛星Q 廷gL i 垫g C o m m i t t e e m a n3 ： 里Q 鱼墨墨照L 垃i 塾gg h 鲤 C o m m i t t e e m a n 4 ： 里! Q 鱼墨墨Q 兰h Q 旦签h 垒旦鱼垒Q C o m m i t t e e m a J l5 ： 里Q 鱼曼曼盟丑塑g 也至地坌旦g C o m m i t t e e m a n6 ： 里煦鱼墨墨Q ! Y 坠垫巡塑I 曼旦g D a t eo f o r a ld e f e n c e ：2 0 1 0 3 1 2 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位做储虢摩* 袭 签字日期：硼1 年月巧；白 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 吒 蔡丹英l 基于C 0 s I I 标记的勋胁训竹s e c t i o n 户龇野生多倍体马铃薯的系统发育研宄 致谢 转眼间己到了博士毕业时分。许多人和事如同电影一般在我的脑海中浮现， 或许对于他们来说，我只是他们人生中毫不起眼的一抹，而他们对于我却有着不 同寻常的意义。正是他们，帮助我实现理想，指引着我在人生道路上不断地前进。 今借此方寸之地，聊表谢意。 首先感谢我在浙江大学的导师滕元文教授。滕老师为人谦逊和蔼，做事严肃 认真，对待科研严谨踏实，对待学生关怀备至。虽然他工作上较忙，但仍会不时 地关心我的学习和生活，教导我做研究和做人的道理。印象最深的就是滕老师一 直强调“学术诚信”的问题，他让我明白做学问是不能弄虚作假的。正是由于他 在科研上的正确引导和监督，使我不致于在科研道路上迷失自己。感谢滕老师支 持和帮助，使我有机会成为众多国家公派留学生中的一员，去国外学习生活。 感谢我在威斯康星大学麦迪逊校区求学期间的导师D a v i dM S p o o n e r 教授。 他待人友善，学术严谨，为人幽默风趣。两年中，s p o o n e r 教授不断在科研和生 活上给予我帮助，不时地关心我的实验动态，指导我一步步地完善实验结果。每 次和他交谈，我都会有不同的收获，同时我也真正体会到了国外科学研究的严谨 性。正是他的严谨、关爱、友善，使我度过了难忘的两年国外研究生活。这段求 学生涯，注定是我迄今为止的人生中最难忘的一抹，对我今后的人生道路产生了 重要的影响。 感谢S p o o n e r 教授实验室的博士后F l o rR o d r i g u e z ，她是一位难得的良师益 友。在国外两年的求学生涯中，她在实验设计、操作、数据分析、写作等方面给 予我莫大的帮助，她每次都耐心地指导我，开心地分享她的实验心得，热心地帮 助我解决实验中遇到的问题。她认真严谨的科学态度深深地影响着我。她还带我 尽快地融入到国外的生活中，使我在麦迪逊的生活不断地充满惊喜和精彩。 感谢威斯康星大学麦迪逊校区植物系的D a V i dB a u m 教授在软件使用上的教 导：感谢统计系的C 6 c i l eA 耐副教授在数据分析时提供的帮助，使我能尽快地完 成数据分析。她亲切耐心、博学多才给我留下了深刻的印象；感谢在田纳西的汪 旭升师兄在数据分析期间的雪中送炭以及给我人生道路上的指引。 感谢陪我一起走过博士求学期间的众多同门和朋友们：郑小艳、张岚岚、肖 金平、范太伟、张东、鲍露、俞波、姚利华、黄春辉、卢彩玉、韩明丽、刘晶、 陈露露、刘国琴、李国鹏、刘冬峰、钱敏杰、胡春云、计玮玮、杨倩倩、孙萍、 郑鹏华、吴瑞媛、张水明、朱长青、刘小花、金蓉、何风杰、谭金娟、高月、刘 璐璐、李紫芳、陈妙金、李平芳、何佳燕、徐超炯、殷学仁；特别是感谢郑小艳 博士对我实验上的指导和论文写作上的修改，她一针见血地点评，使我茅塞顿开； 感谢张岚岚博士、肖金平博士、张水明博士对我实验上的帮助和指点。 感谢在国外期间关心我的的老师们：翁益群老师及师母宋萍，蒋济明教授， S h e l l e yJ a n s k y 教授，P h i l i p pS i m o n 教授、蔡兴奎老师、李育红老师、李大伟老 师、李育良老师、高晓明老师、张文利老师等。感谢留学期间一起奋斗一起玩耍 的朋友们：王怡、欧晨刚、王海平、周文叶、霍魏、王迪、H o l l yl 沁e s s 、D i e g of a j a r d o 、 C i n t h y aZ o 仃i l l a C i s n e r o s 、P e r c yR - o j a sD o m i n g u e z 、M 撕n aI o v e n e 等。特别感谢 H o l l yR u e s s 和D i e g of a j a r d o 对我实验操作和数据分析上的指点以及生活上的关 心。另外感谢威大园艺系工作人员J u d y 和T r i c i a 对我平日里的照顾。 感谢我的室友张其芳、杨瑞芳、魏群、赵丽娜、许靖逸、牛姗姗、刘晶。 感谢国家留学基金委两年的资助，使我有机会去国外学习研究、开阔视野、 增长见闻，并且能够顺利地在国外完成实验。 感谢家人的理解和支持，感谢徐飞两年的支持! 感谢所有未提及姓名但给过我关心的朋友们。我的博士生涯因有你们的加入 而精彩! 蔡丹英 于华家池畔 2 0 11 年3 月 蔡丹英l 基于C O S I I 标记的勋，矾“小s t i 仰，龇恤野生多倍体马铃薯的系统发育研宄 摘要 马铃薯( 勋肠刀姗zf 动P ，D J 甜聊L ) 属于勋肠聆“所属中的s e c t i o nn 幻幻D u m o r t i e r 。 其中n 幻幻组中3 6 为多倍体。已有学者采用质体D I N A 限制性位点、颗粒结合型 淀粉合成酶( G B S S I ) 、硝酸还原酶( N 认) 、直系同源C O S I I 标记等方法对马铃 薯的二倍体和多倍体进行了系统发育关系研究，但这些研究由于只采用了较少的 基因或标记抑或是较少的多倍体物种，而并没有对多个物种的野生多倍体马铃薯 进行全面的系统发育分析。本研究采用6 对C O S I I 标记对1 1 个野生多倍体物种中的 5 4 个个体以及3 3 个野生二倍体物种中的3 7 个个体进行了P C I 舻增，利用优化的非 对称P C R - S S C P 技术对所得到的等位基因进行测序并进行较全面的野生多倍体马 铃薯的系统发育研究，表明野生多倍体马铃薯中可能存在多起源现象；同时和采 用其它基因得到的结果相比较，结果相似。主要研究结果如下： 1 获得了最优化的非对称P C R - S S C P 方法的条件，确定了不同的C O S I I 标记各 自最佳的非对称P C R - S S C P 条件。和传统的克隆测序方法比较，非对称P C R - S S C P 方法省时，省力，可以避免克隆测序中易发生的P C R 重组以及异源双链核酸分子， 并且其多态性位点的碱基类型和数目均和克隆测序结果一致，在某种程度上可以 替代克隆测序。对于多倍体而言，成本可以降低到原来的1 8 9 3 3 3 。 2 将优化的非对称P C R - S S C P 方法推广到6 对C O S I I 标记以及1 1 个物种的5 4 个野生多倍体和3 3 个物种的3 7 个野生二倍体马铃薯个体中，主要用于研究野生多 倍体马铃薯的系统发育关系。单个C O S I I 的比对长度介于4 6 l ( C 2 - A t l 9 3 2 1 3 0 ) 。1 4 7 3 ( C 2A t l 贮0 0 5 0 ) 个位点之间，简约信息位点数介于4 5 一1 3 4 个之间，一致 性指数( C o n s i s t e n c y1 1 1 d e x ，C I ) 介于O 7 3 O 8 6 之间，保留指数( R e t e n t i o nh d e x ， 刚) 介于O 9 4 O 9 7 之间。5 个C O S I I ( 不包含C 2 - A t 5 9 4 7 3 9 0 序列数据) 和6 个C O S I I 联合序列数据中，序列比对总长度分别为4 0 31 和4 7 1 9 个位点，简约信息位点数分 别为6 7 3 和5 5 1 个，一致性指数( C I ) 和保留指数( 对) 均为0 6 3 和0 9 2 。对二倍 体序列的分析结果表明，在2 2 2 个组合( 3 7 个二倍体6 个C O S I I ) 中，1 2 6 含 有多于1 个的等位基因。排除差异较小的等位基因后，只有5 9 的二倍体含有差 异。四倍体用于最终分析时，只有1 8 的个体少于两个等位基因；六倍体亦是如 此，只有1 8 的个体少于三个等位基因。 3 采用最大似然法对不同的序列数据进行系统发育分析。用最大似然法对 I 浙江大学博士学位论文( 2 0 1 1 ) 单个C O S I I 标记的二倍体序列分析表明，虽然这6 个单独的C O S I I 得到的系统树存 在着不一致，但可以很好地解决二倍体物种的系统发育关系。用最大似然法对二 倍体和多倍体的6 个C O S I I 联合序列数据分析得到和前人不一致的研究结果，它将 分枝3 分成两小分枝。但对含有5 个C O S 联合序列文件进行最大似然法分析时，得 到和前人相似的研究结果，包含三个主要的分枝分枝1 + 2 ，分枝3 ，分枝4 。 4 用最大似然法对二倍体和多倍体的5 个C O S I I 联合序列数据分析表明，5 4 个多倍体中有2 9 个多倍体的等位基因在系统树中所在分枝和G B S S I 、N 认所得到 的系统发育结果相符：所研究的多倍体均为为异源多倍体起源；多倍体和亲缘关 系较近的二倍体在同一分枝上。2 5 个多倍体个体中显示出了不同于前人的研究结 果：1 ) 多倍体基因在起源不明的分枝3 p 、4 a p l 和4 p 2 中，该分枝没有包含二倍体 物种的等位基因；2 ) 在原有的三大分枝上发现新的多倍体基因；3 ) 有2 3 个物种 C O S 组合等位基因发生明显的片段丢失，存在某些系统发育上的相关性；4 ) 野 生多倍体马铃薯中存在多起源现象。 关键词：非对称P C R ，C O S I I ，S S C P ，多起源，P C R 重组，多倍体，勋儿m 姗z s e c t i o nJ ) P 幻f 口 蔡丹英：基于C O S I I 标记的勋 铆州s t i o n ，龇恤野生多倍体马铃薯的系统发育研宄 A b S t r a C t & I 肠疗“朋胁6 9 阳s “研三b e l o n g st o 勤胁“朋L s e c t i o n 尸P f D 细D u m o r t i e r ，o f ，h i c h3 6 i ns e c t 尸P 幻幻w e r ep o I ) ，p l o i d M 锄yd i 肫r e n tk i n do fe n z y m e so r m a r k e 娼w e r cu s e df o rt h ep h y l o g e n yo fw i l dd i p I o i d 锄dp o l y p l o i dp o t a t o e s ，e g ， p l a s t i dD N Ar e S t r i c t i o ns i t e ，G r a n u l e - b o u n ds t a r c hs y n t h a s e ( G B S S D ，N i t r a t c R e d u c t a s e ( N 队) ，C o n s e r v e dO r d l o I o gs e tI I ( C O S I D B u t n o ts om u c hw i l dp 0 1 ) ，p l o i d p o t a t o e sw e r eu s e di nt h e s er e s e a r c h e s W eh e r ec o n d u c ta D N A s e q u e n c i n g 咖d y ， u s i n gs i xn u c l e a ro 吡o l o g s ，o f5 4a c c e s s i o n so f1 lp 0 1 ) ，p l o i ds p e c i e s ，锄d3 7d i p l o i d s p e c i e sr e p r e s e n t i n gp o s s i b l ep r o g e n i t o r St 0 a d d r e s sq u e s t i o n ss p e c i e sa I l dg e n o m e o r i 舀n so ft h ep o l y p l o i d s ，p o s s i b l em u l t i p l eo r i g i n s ，a n dc o n c o r d 锄c eo fd i f f c r e n t m o l e c u l a rm a r k e r sf r o md i f r e r e n tr e g i o n so ft h eg e n o m e T h em a i nr c s u l t Sw e r ea s f o l l o w s ： T h ep r o t o c o l so fa s y m m e t r i cP C R S S C Pw e r e0 p t i m i z e db yd i f f e r e n tk i n do f t e s t s ，l a t e rt h eo p t i m i z e dp r o t o c o l sf o re a c hi n d i V i d u a lC O S l l w e r es e tu p C o m p a r e d t 0t h et r a d i t i o n a lc l o n i n g ，t h eo p t i m a la s y m m e t r i cP C R - 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C O S I Ic o n c a t e n a t e dd a t a s e to f d i p I o i d ， s i x C O S I Ic o n c a t e n a t e dd a t a s e to f d i p l o i d + p o l y p l o i d ， f i V e C O S I I c o n c a t e n a t e dd a C a s e to f d i p l o i d a n df i v e - C O S c o n c a t e n a t e dd a t a s e to f d i p l o i d + p o l y p l o i d ) T h er e s u l t so fs i xi n d i V i d u a IC O Sd a t a s e t so fa l ld i p l o i da n d p 0 1 ) ，p l o i di n d i c a t e d1 1 1 0 u 曲v a r i o u sd e 铲e e so fi n c o n g r u e n c ew e r ef o u n di na I ls i x i n d i V i d u a lC O S I Ip h y l o g e n e t i ct r e e s ，t h ed i p l o i dp h y l o g e n yw a sw e l ls o l V e d T h e 6 C O Sc o n c a t e n a t e dd a t a s e to f d i p l o i d + p o l y p l o i dr e s u l td i f r e r sf - r o mp r i o rp h y l o g e n i e s ， i ns e p a r a t i n gs p e c i e s 疳o mc l a d e3i n t ot 、o c l a d e s H o w e V e r ，r e m o V i n gd a t af 硒m C O S I IC 2 A t 5 9 4 7 3 9 0f r o mt h ed a t a s e t ( r e t a i n i n gd a t a 舶mt h er e m a i n i n gf i V eC O S I I ) r e c o V e r e dat h r e e c l a d et o p o l o g y 懿d i da l lt I l r e ep r i o rr e s u l t S T h ef i V e - C O S I Ic o n c a t e n a t e dd a t a s c to f d i p I o i d + p o l y p l o i dr e s u I t Sc o n c u r r e d w i m t h ec l a d i s t i cr e l a t j o n s h i p so f p o t a t 0a l l o p o I y p l o i d su s i n gG B S S I 锄dN L i n2 9o f t h e 5 4c a S e se x 姗i n e d ：a l lp o I y p l o i d sw e r ca I l o p o p I y p l o i do r i g i n s ；p o l y p I o i d sa I l dm o r e 陀l a t e dd i p I o i d sw e r ei nt h es 锄ec l a d e sn er e m a i n i n g2 5o f5 4a c c e s s i o n ss h o w t h r e ec l a s s e so fd i s c o r d a n c en o ts e e ni np r i o rr e s u l t S ：1 ) p o l y p l o i da n e l e si nc l a d e so f u n k n o w no r i g i n sn o tr e c o V e r c db e f o r e ( 3 p ，4 a pl ，4 p 2 ) ，w i t h o u td i p l o i da l l e l e si nt h e s e n e wc I a d e s ；2 ) n e wp o I y p I o i da I I e I e si nt h ep r e x i s t i n gt 1 1 r e em a i nc l a d e s ，r e I a t i V et ot h e s t u d i e so f ( 、B S S Ia n dN I A ；3 ) 2 3a c c e s s i o l l C O S c o m b i n a t i o n s ，a l l e l e sw e r e a p p a r e n t I yl o s ta n dp h y l o g e n e t i ca s s o c i a t i o n ss t a n do u t ，a n d4 ) m u l t i p l eo r i g i n sw e r e f o u n di nw i l dp 0 1 ) r p l o i dp o t a t o e s K e y w o r d s ： a s y 眦n e t r i cP C R ， C O S I I ，S S C P ，m u l t i p l eo r i g i n s ， P C R r e c o m b i n a t i o n ，p o l y p l o i d y ，I 肠”甜所s e c t i o n 尸P f D 幻 蔡丹英：基于C O S I I 标记的勋细胁s e c t i o n ，锄咖野生多倍体马铃薯的系统发育研究 A F L P b p C I C O S C O S I I o C d c l H 2 0 E B N G B S S I G I S H h L R ，r S I T S M B M D E M E S m g m l n m L m M M C M C M L M 咿 n g N L p P A G E 缩略词表 A b b r e v i a t a i o n s 锄p l i f i e d 触g m e n tl e n 萨hp o l y m o r p h i s m 扩增片段长度多态性 b a s e p a i r 碱基对 c o n s i s t e n c yi n d e x 一致性指数 c o n s e n r e do n h o l o gs e t直系同源保守序列 c o n s e r v e do n h o l o gs e tI I直系同源保守序列I I d e g r e eC e l s i u s 摄氏度 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r双蒸水 e n d o s p e 衄b a l a n c en u m b e r 胚乳平衡数 伊a 1 1 u l e - b o u n ds 协r c hs y n t h a s e 颗粒结合型淀粉合成酶 g e n o m i c i ns nh y b r i d i z a t i o n基因组原位杂交技术 h i e r a r c h i c a l l i k e I i h o o dr a t i ot e s t s阶层式似然率检验 i n t e m a lt r a I l s c r i b e ss p a c e r内转录间隔区 m r b a V e s贝叶斯法 m u t a t i o nd e t e c t i o n3 n h a n c e m e n t 变异检测增强型凝胶 2 【N M o 印h o l i n o 】e t h a n e s u l f o n i ca c i d 2 - N 一吗啉代乙磺酸 m i l l i g r a m 毫克 m i n u t e ( s ) 分钟 m i l l i l i t e r毫升 m i l l j m o l e毫摩尔 m a r k o vc h a i nm o n t ec a r l o马尔科夫蒙特卡罗模型 m a x i m u ml i k e l i h o o d最大似然法 m a x i m u mp a r s i m o n y最大简约法 n a l l o g 舢 纳克 n i t m t er e d u c t a s e硝酸还原酶 p o l ”o m y 无分枝结构的 p o l y a c r ) ，l a m i d eg e l 聚丙烯酰胺凝胶 V 浙江大学博士学位论文( 2 0 1 1 ) P C R P E G P D E S p p m P T I S P V Y I U S S N P S S C P s s D N A S S R T B E T B R p o l y m e r a S ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n e g l y c o l 聚乙二醇 1 ，4 p i p e r a z i n e d i e t I l a n e s u l f o n i ca c i d 1 ，4 哌嗪二乙磺酸 p a n p e r m i l l i o n 百万分之 p o t a t oi n 仃0 d u c t i o ns t a t i o n马铃薯引种中心 p o t a t ov i r u sY 马铃薯Y 病毒 r e t e m i o ni n d c x 保留指数 s e c o n d ( s ) 秒 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o 印h i s m 单核苷酸多态性 s i n g l es t r a n dc o n f o n n a t i o np o l y m o 印h i s m单链构象多态性 s i n g l es t m d D N A 单链D N A s i n g l es e q u e n c er 印e a t 简单序列重复 t r i s - b o r a t e E D l A T r i s - 硼酸- 乙二胺四乙酸 t r e eb i s e c t i o nr e c o n n e c t i o n 邢M Et r i s M 匣S E D T A T P E L 肛L 洲 W t r i s P 口E S E D T A l i t r e m i c r o l i t r e m i c r o m o l e W a 岫 二等分再连接分支交换算 法 T H s 2 N 吗啉代乙磺酸乙 二胺四乙酸 确s 1 ，4 哌嗪二乙磺酸乙 二胺四乙酸 升 微升 微摩尔 瓦特 1 1 4勋肠刀z 删s e c t 尸P 幻细中野生多倍体的系统发育研究4 1 1 5 勋，c 矾t 册s e c t 心幻细中野生多倍体的基因组组成6 C O S I I 标记的研究进展。6 1 2 1 直系同源基因和旁系同源基因7 1 2 2C O S I I 标记的开发8 1 2 3C O S I I 标记的应用8 非对称P C R S S C P 技术9 1 3 1S S C P 技术9 1 3 2 等位基因的协同移动以及单链D N A 的稳定构象。l O 1 3 3S S C P 等位基因数目1 0 1 3 4 非对称P C R 1 0 1 3 5 P C R 过程中引起的序列重组1 1 1 3 6异源双链核酸分子1 l 研究目的和意义1 l 非对称P C R - s s c P 技术体系的建立及应用1 3 前言1 3 材料和方法13 2 2 1 植物材料和D N A 的提取。1 3 2 2 2P C R 扩增，S S C P 操作步骤，再次扩增，克隆和测序1 4 2 2 3 用于和S S C P 比较的直接克隆测序1 6 2 2 4 S S C P 条带的克隆。1 7 2 2 5 优化体系时采用的其它操作方法1 7 2 2 6S S C P 最佳条件的检测1 7 2 2 7 优化的S S C P 方法在多倍体物种中的检测1 8 结果1 9 2 3 1 S S C P 最佳方法条件的确立1 9 I X 2 3 4 J 2 3 比 2 勉 浙江大学博士学位论文( 2 0 1 1 ) 2 3 2 优化的S S C P 方法在多倍体物种中的检测结果2 0 2 4 讨论2 1 2 4 1纯化的和非纯化的P C R 产物比较2 2 2 4 2 不同上样缓冲液和稀释比例的比较2 2 2 4 3 对称P C R 和非对称P C R 的比较一2 2 2 4 4 M D E 胶上的S S C P 电泳条件2 2 2 4 5 P A G E 胶上的S S C P 电泳条件2 2 2 4 6 S S C P 方法中缓冲液的确定2 3 2 4 7 1 6 个马铃薯多倍体物种中S S C P 体系的建立2 3 2 4 8 成本比较2 3 3 基于c o s I I 标记的野生多倍体马铃薯的系统发育关系3 0 3 1 材料和方法3 0 3 1 1 植物材料的准备3 0 3 1 2D N A 的提取、扩增、S S C P 测序和克隆3 7 3 1 3序列编辑和联配以及模型的选择3 7 3 1 4 最大简约法、最大似然法和贝叶斯法的系统发育分析3 7 3 1 5 等位基因的选择3 8 3 1 6联合数据分析3 8 3 2 结果3 8 3 2 1序列比对以及多样性3 8 3 2 2模型选择3 9 3 2 3 系统发育分析方法的选择3 9 3 2 4 单个基因的系统发育分析3 9 3 2 5二倍体物种的系统发育分析4 2 3 2 6 所有物种( 二倍体和多倍体) 的系统发育结果4 3 3 3 讨论4 8 3 3 1多起源：4 8 3 3 2 等位基因丢失4 8 3 3 3多倍体等位基因在起源不明的新分枝中4 9 3 3 4 二倍体和多倍体的亲缘关系研究4 9 3 3 5勋，口刀z 册s e c t 尸P f D 纽在分类学上的应用5 0 4 小结与展望“6 0 参考文献。6 2 X 蔡丹英l 基于C O S I I 标记的勋，珊埘s e c t i o n ，口缸野生多倍体马铃薯的系统发育研宄 5 附录 7 2 作者在学期间所取得的科研成果7 4 蔡丹英：基于0 0 S I I 标记的勋，口，l 埘小s e c t i o n ，龇，f 口野生多倍体马铃薯的系统发育研究 1 文献综述 勋儿淅姗L s e c t i o nn 幻肠D u m o n i e r ( n 幻矧组) 包括了马铃薯( 勋，口，l 姗l 胁6 P 加s 删L ) 及其野生近缘种。其中约有3 6 为野生多倍体马铃薯。目前，已经 采用各种分子手段对尸P 幻幻组的系统发育或基因组组成进行研究，如形态学、 c p D N A 、颗粒结合型淀粉合成酶( G 啪u l e - B o u n dS t a r c hS y n t h a s e ，G B S S I ) 、硝 酸还原酶( N i t r a t eR e d u c t a s e ，N 认) 、基因组原位杂交技术( G e n o m i ch lS h H v b r i d i z a t i o n ，G I S H ) 等。虽然这些研究使人们对凡幻幻组中野生多倍体马铃薯 的系统发育或是基因组组成有了初步的了解，但是仍不够系统全面。本章探讨了 以往对于凡幻胁组的系统发育研究进展，n 幻幻组中野生多倍体的系统发育研究 进展，以及介绍了在本研究中所采用的C O S I I 标记和不同于以往的测序手段非对 称P C R S S C P 技术。 1 1 肋肠刀朋ls e c t i o nn 幻缸的系统发育研究进展 1 1 1勋，口甩“小j P 髓忍纫细的组成和分类 茄科( S o I a n a c e a e ) 有约8 5 个属3 0 0 0 多个物种，包括茄属( 勋肠珂“mL ) ， 辣椒属( C 口筇缸姗L ) ，烟草属( M c D r f 册口L ) ，枸杞属( 砂c f “研L ) 等属。 代表物种有番茄( 勋肠刀“朋咖叩P 邶f c 册L ) 、马铃薯( f “6 P 加J 姗L ) 、茄子 ( 聊P z D 哗 口L ) 、枸杞( 印c 胁聊幽f ”P 刀J PM ) 等常见的园艺作物和药用植物 ( M u e l l e r 等，2 0 0 5 ) 。勋，口 甜聊属是茄科中比较重要的一个属，它包括勋肠甩姗 s e c t i o nn 幻幻D u m o r t i e r 、勋肠玎姗s e