小麦EMS诱变群体的构建及关键性状突变体的筛选-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 密级 多文题目：Q 塾曼塑皇堡! i Q n 鱼n 鱼丛巫鱼n ! S 堡! 星曼n i 旦gQ 旦丛S ! 垒亟坠鱼曼鱼 W h e a tM u t a n tL i b r a r y _ 学位申请人：俭抱垄 导师：崔堂登数援 专业：佐物遗佳直社 研究方向：鱼! 麦直叠愿理皇友法 论文提交 日期： 学位授予 日期： IIIII III I II ll ll l l l ll lf Y 17 2 8 5 5 9 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论小麦E M S 诱变群体的构建及关键性状突变 学位 硕士 文题目体筛选 级别 学生 徐艳花 学科导师 姓名专业 作物遗传育种崔党群 姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 研究生签名：糊签主导师签名：仍9 坳 日期：年月衫日 日期：劫哞细，汐日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版 本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开河南 农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业 大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则，承 担相应的法律责任。层譬一 研究生签名：燃导师签名：循磺凋手学院领导签名：芷量兰：毒J i 日期：撕6 月“日日期：加哞Z 月，石日 日期如I 奄年月汨 致谢 本论文是在导师崔党群教授的悉心指导下完成的，从课题的设计、实施，到论文 的撰写，导师都付出了辛勤的劳动和大量心血。老师一直都像对待自己的孩子一样地 关心爱护着我们，研究生阶段的每一天，我始终都是怀着感恩的心度过的! 感谢再次的求学生活，工作四年后又重返校园，求学的艰辛让我更加珍惜来之不 易的学习生涯。研究生的学习试验生活让我体会了无数次“踏破铁鞋给人的打击和 最终“柳岸花明给人的成功喜悦，这些经历给了我莫大的收获，让我学会了如何在 成功时充实自己，如何在失败时接受自己。三年的科研和学习生活，不仅让我在专业 上具备了科研的头脑，更让我在人生观和价值观上的认识得到了升华! 感谢陈锋老师在学业上给予的指导，在实验实旌和论文完成过程中，小麦育种研 究室的许海霞副教授、董中东老师都给予了我无私的指导和帮助，在此向各位老师表 示诚挚的感谢! 感谢河南省农科院的海燕研究员及河南农大许海霞副教授在百忙之中对论文的评 阅。 感谢实验室良好的实验条件与融洽的学术氛围，感谢陈平、马东钦、朱有朋，金 艳、许兰杰，周扬、张福彦、刘华、孙文鑫、左爱辉、徐园园、郭春艳、尚晓利、郭 慧娟等在试验中给予的帮助。三年来同门师兄弟建立的深厚友谊是我一生的财富! 感谢2 0 0 5 级和2 0 0 6 级本科实习生，文中的每一个数据都是我们大家共同心血和 汗水的结晶。 感谢农学院2 0 0 7 级的所有研究生，非常怀念三年来一起度过的愉快时光。 感谢我的爱人任永哲，感谢他在学习、生活上所给予的鼓励、支持、理解和帮助， 多年的聚少离多让我们更加懂得珍惜幸福 感谢我的父母，他们尊重我的选择， 督促我更加努力地奋斗。 最后，再次感谢所有帮助、关心和支 目录 摘要1 1 文献综述3 1 1 反向遗传学技术3 l I1 1R N A 干扰3 1 1 2 插入突变技术4 1 2 植物突变体库的构建方法4 1 2 1 通过外源序列插入构建突变体库4 1 2 1 1 通过T - D N A 插入建立突变库 1 2 1 2 通过A c D s 系统插入建立突变体库 1 2 1 3 通过T o s l 7 建立植物突变体库 1 2 2 通过激活标记插入构建突变体库 1 2 3 通过理化因素诱变构建突变体库 1 2 3 1 E M S 诱变突变体库的原理及应用 1 3 筛选突变的方法 1 3 1 表型筛选 1 3 2T I L L I N G 技术筛选 1 3 2 1T I L L I N G 技术的基本原理 1 3 2 2T I L L I N G 技术在突变体检测和功能基因组学研究中的应 1 3 3S D S - P A G E 方法筛选高分子量麦谷蛋白突变 1 3 3 1 高分子量麦谷蛋白 1 3 3 1 1 命名 1 3 3 1 2 多态性 1 3 3 1 3H M W - G S 与品质问的关系 1 3 3 2S D S - P A G E 方法 2 引言 3 材料和方法 3 1 试验材料 3 2 试验方法 3 2 1 突变材料创建 3 2 2M 2 代的种植与表型性状调查 3 2 3M ：代高分子量麦谷蛋白亚基类型鉴定 3 2 3 1 麦谷蛋白提取 3 2 3 2S D S - P A G E 电泳分析 4 结果与分析1 8 4 1M 。代田间调查结果与分析1 8 4 2M 。代田间调查结果与分析1 8 4 2 1 叶片性状突变1 9 4 2 2 茎秆性状突变体2 0 4 2 3 穗部和籽粒性状突变2 1 4 2 4 生理性状突变2 2 4 3 麦谷蛋白基因突变2 3 5 结论与讨论2 4 参考文献2 7 英文摘要3 3 河南农业大学硕士学位论文 摘要 植物功能基因组学是后基因组时代的重要研究内容，其主要任务是研究生物体内各基因的生物学功 能，而构建饱和的基因突变群体是分离、鉴定基因功能最直接、最有效的方法之一。因此，植物突变体 库的构建是研究功能基因组学的重要基础。我国幅员辽阔、地域复杂、小麦生态类型丰富，虽然有些单 位已经创建了适合当地种植的突变体库，但作为我国最大的小麦主产区黄淮麦区仍未见报道，而且普通 小麦倍性高、基因组庞大、重复序列较多，所以目前世界上尤其是我国小麦突变体库还远未达到饱和状 态，因此，选用高产、广适的小麦品种构建新的普通小麦突变体库能够在一定程度上加快我国小麦功能 基因组学的研究，从而为我国小麦改良提供一定信息。本研究利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯( e t h y l m e t h a n es u l f o n a t e ，E M s ) 溶液诱变处理豫农2 0 1 种子，初步构建了豫农2 0 1 的突交体库，并对该群体 各性状的表型进行调查，同时利用S D S P A G E 的方法筛选出一些不同麦谷蛋白亚基缺失的突变体，得出 的主要结果如下： 1 构建了普通小麦E M S 突变体库，获得7 2 2 份叶、茎、穗和生理等性状变异的突变体，变异类型 丰富，可见表型的突变频率为1 1 4 3 。 2 共获得1 3 9 份叶片性状突变，突变频率为2 2 0 。叶片突变的类型包括： ( 1 ) 叶色突变。共有7 种类型：一是黄化突变，共2 株，突变频率为0 0 3 。二是叶斑突变，共 6 5 株，突变频率为1 0 3 ，分为两种；第一种为叶子有小黄斑，不影响结实，共4 3 株，突变频率为O 6 8 ；第二种为大黄斑，共2 2 株，突变频率为0 3 5 。三是基部叶变黄的突变，共1 5 株，突变频率约为 0 2 4 。四是间绿突变，整株叶片有条纹，黄绿相间，共2 0 株，突变频率为0 3 2 。五是黄萎突变，叶 片外缘萎蔫，共1 5 株，突变频率约为0 2 4 。六是全黄突变，叶片外缘不萎蔫，麦穗仍保持绿色，共6 株，突变频率约为O 1 0 。七是旗叶早黄突变，共7 株，突变频率约为0 11 。 ( 2 ) 叶形突变。旗叶萎缩畸形为近球形且不伸展，不能正常抽穗，穗子从侧向抽出且易断，共9 株， 突变频率为0 1 4 。 3 获得2 2 0 份茎秆性状突变、突变频率为3 4 9 。突变类型包括： ( 1 ) 株高突变。第一种突变体为矮秆变异，共5 0 株，平均株高为4 4 1 2 c m ，最低株高仅为3 0 c m ，突 变频率为0 7 9 ；第二种为高秆变异，共11 株，平均株高8 5 9 5 c m ，最高株高可达8 9 c m ，突变频率为0 1 7 。 ( 2 ) 茎秆直径突变。共发现了粗壮的突变1 8 株，突变频率为0 2 9 ；细弱单株7 株，突变频率为0 1l 。 ( 3 ) 分蘖突变。共发现了1 0 3 株分蘖突变，突变频率为1 6 3 。分蘖突变有3 种类型：单蘖、少蘖和 多蘖。突变频率分别为0 2 7 、1 1 l 、0 2 5 。多蘖最多达至1 , 1 3 7 个分蘖，少蘖则仅为2 3 个分蘖。 ( 4 ) 丛生突变。共发现- j 2 2 株，突变频率为0 3 5 。这类突变株高一般在2 2 2 7 c m 之间，进一步可为 两类，一类是植株叶片宽而厚，抽穗，但不结实；另一类是叶片窄而薄，不抽穗) 。 ( 5 ) 茎半匍匐突变。发现了9 个植株成熟期茎为半匍匐状态生长，突变频率为0 1 4 。 4 获得3 8 份穗部和籽粒性状突变、突变频率为0 6 0 。突变类型包括： ( 1 ) 穗部突变。共有3 种变异类型：一是短穗，穗长般在3 5 c m 且小穗较小，共发现3 株，突变频 l 河南农业大学硕士学位论文 率为0 0 5 ；二是密小穗，共发现5 株，突变频率为0 0 8 ；三是弯穗，共发现5 株，突变频率为0 0 8 。 ( 2 ) 芒型突变。小麦豫农2 0 1 为直芒品种，芒长一般为6 c m 。在突变群体中发现9 株弯芒突变，突变 频率为0 1 4 ；1 3 株短芒突变，突变频率为0 2 1 ，芒长在1 3 c m 之间。 ( 3 ) 籽粒突变。获得2 份大粒材料和1 份红粒材料，突变频率分别为0 0 3 和0 0 1 6 。 5 获得3 2 5 份生理性状突变，突变频率为5 1 5 ，共有不育突变、成熟期突变、早衰突变、死亡突 变四种类型。 ( 1 ) 不育突变。在M 2 代观察到的不育变异共有14 2 株，突变频率为2 2 5 。 ( 2 ) 成熟期突变。共发现1 3l 株晚熟突变株，突变频率为2 0 8 。发现1 2 株早熟突变株，突变频率 为0 1 9 。 ( 3 ) 早衰突变。在M 2 代观察到的早衰变异共有3 8 株，突变频率为0 6 0 。 ( 4 ) 死亡突变。在M 2 代观察到有2 株死亡单株，1 株在拔节期，l 株在抽穗期，突变频率为0 0 3 。 6 获得2 1 个缺失不同类型高分子量麦谷蛋白亚基的突变，突交频率为2 2 6 。这些突变单株可分 为四类，分别为1 亚基、5 亚基、7 亚基、1 0 亚基缺失。 关键词：普通小麦；甲基磺酸乙酯；突变体库；形态学鉴定 2 i 1 1 南农业人学硕l j 学位论文 1 文献综述 植物功能基冈组学是后基冈组时代的重要研究内容，其主要任务是研究生物体内各基冈的生物学 功能。过去，植物生物学家儿乎全部依赖丁正向( 经典) 遗传学进行研究，正向遗传学的认知路线为 由表及里，即通过研究生物的表犁、性状米推测其遗传物质组成、分布与传递规律等，从而研究生命 过程的发生与发展规律的。即止向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为，如控制突变性状的基| 灭l 数 目及其在染色体上的位置以及突变性状在后代中的传递规律等。 随着测序技术的发展，人们获得的基冈序列信息也以指数级的增长，这意味着除了传统的正向遗 传学外，我们还可以用反向遗传学方法米研究基冈的功能。反向遗传学是相对丁经典遗传学即正向遗传 学而言的，是另一条由里及表的认知路线，即在获得生物体基冈组序列的基础上，通过改变目的序列 的表达，如定点突变、基冈插入缺失、基冈置换等。进而鉴定所引起的突变体中的表型的方法来分 析基冈或D N A 序列的功能。可以根据插入的已知序列和目的基冈序列设计P C R 反应引物，通过P C R 技术 从突变体库中筛选出目的基冈的插入突变体。 正向遗传学与反向遗传学的关系可用图1 简单表示。 F o r w a r dV SR e v e r s e VVV F b w I ，dg 引怕她 堂皇童生一一一_ “G T 眦A C 曼G T T 一k E A L T _ P h e n o t y p e 一一一 G e n e R e v e r s eg e n e t i c s 图1 正向遗传学与反向遗传学的关系图示 F i g 1F o r w a r dw R e v e r s e 1 1 反向遗传学技术 与反向遗传学操作相关的各种技术统称为反向遗传学技术( r e v e r s eg e n e t i c sa p p r o a c h ) ，目前已经发 展了一些反向遗传学技术来推动这些j ：作的进展，这些反向遗传学方法主要有反义R N A 或R N A 干扰( R N A i n t e r f e r e n c e ，R N A i ) 技术、同源重组、插入突变技术，2 J 等。 1 1 1R N A 干扰 3 河南农业大学硕士学位论文 基因沉默在生物界中普遍存在，可以发生在转录水平( T G S ) 和转录后水平( P T G S ) 。T G S 发生 在D N A 水平，与目的基因启动子区域的甲基化有关。P T G S 发生R N A 水平，由目的基因m R N A 特异 性降解所引起。R N A 沉默是生物研究领域一个常用词汇，在植物学界被称为转录后基因沉默( P T G S ) ； 在动物体中被称为R N A 干扰( R N A i ) 口1 。尽管R N A 沉默现象在不同的生物体中的称谓有所不同，但他 们却具有相似的机制。 目前，R N A 干扰被普遍运用来表述不同生物体中所出现的R N A 沉默现象。早在1 9 8 7 年，人们就 发现在烟草细胞中表达反义R N A 能有效抑制目的基因表达H 1 。1 9 9 8 年F i r e 等以线虫作为研究材料，发 现尽管单链反义R N A 能启动基因沉默，但双链R N A ( d s R N A ) 更加有效1 。经过大量的研究实验，F i r e 等创造性的提出用R N A 干扰( R N A i ) 概念来描述正义R N A 所引起的线虫目的基因沉默现象。他们认 为上述一系列的转基因操作所引起的基因沉默不是发生在D N A 水平，而是由目的基因在m R N A 水平的 特异性降解所引起，被称为R N A 干扰1 。 1 1 2 插入突变技术 在反向遗传学技术当中，随机插入突变技术被广泛用来进行大规模的基因功能分析，因为该技术 不仅适用于基因敲除，还可以用来进行启动子捕获和激活标记。近几年建立的大量插入突变体库将会对 规模化研究基因功能产生巨大的推动作用。目前已经应用T D N A 和一些转座元件例如A C D s 和T o s l 7 来建立大规模的插入突变体库，尤其是在水稻和拟南芥中应用更为广泛。并且有些还带有G S U 或G F P 等报告基因，可以用增强子捕获或基因陷阱的方法鉴定基因。也可以用激活标签的方法来进行突变体库 的筛选并鉴定突变基因。随着基因组序列测定技术的日渐成熟、多种模式生物的基因组计划的完成和生 物信息学的高速发展，反向遗传学技术的应用将越来越广泛。现在人们已经拥有了多种生物大量的基因 组序列，因而反向遗传学方法正变得越来越重要。 1 2 植物突变体库的构建方法 植物功能基因组学是后基因组时代的重要研究内容，其主要任务是研究生物体内各基因的生物学功 能。而构建饱和的基因突变群体是分离、鉴定基因功能最直接、最有效的方法之一，我们对植物生长发 育、细胞生物学以及生物代谢的深入研究和理解都离不开突变体分析，人为的创造突变体已经成为近8 0 年来遗传学研究的主要驱动力暗1 。因此，植物突变体库的构建是研究功能基因组学的重要基础。突变体 库就是由某种方法产生的、包含各种不同基因突变的群体。饱和突变体库是指理论上该突变体库中存在 基因组的每个基因都发生了突变的突变体库。拟南芥、水稻的基因组较小，如水稻只有4 6 6 M b 或 4 2 0 M b 【6 ，7 | 。人为产生突变体的方法主要有物理和化学诱变、同源重组、基因沉默以及插入突变等。 1 2 1 通过外源序列插入构建突变体库 1 2 1 1 通过T - D N A 插入建立突变库 利用T D N A 插入突变，在拟南芥中已经建立了接近饱和的插入突变体库，该突变体库包含超过 2 2 5 0 0 0 个独立的T D N A 插入株系，在预测的2 9 4 5 4 个基因中有2 1 7 0 0 个基因发生了插入突变。此外，还发 现T D N A 在其基因组中的插入位点有一定的偏向性，偏向于发生在基因密度较高的区域、基因的非翻译 区及启动子区。但是，T D N A 插入对特定的基因类别没有明显的偏向性| 8 1 。 4 河南农业大学硕士学位论文 自1 9 9 4 年H i e i 等阳1 首次报道用农杆菌介导法对水稻成功地实现遗传转化以来，该方法在水稻遗传 转化中得到广泛应用并不断完善，这使建立水稻T D N A 插入突变体库成为可能。与拟南芥插入突变体 库的构建相比，水稻的一个困难是需要做大量繁琐的组织培养工作。拟南芥是在开花时用农杆菌菌液浸 泡或喷洒等方法实现遗传转化的，不经过组培过程而获得转化植株。水稻中已建立了具有一定规模的突 变体库，但远没有达到饱和的程度。在建立突变体库时，用了g e n et r a p 和激活标签载体，通过T a i l - P C R 分析，得到了许多T D N A 插人株系的侧翼序列，建立了侧翼序列数据库。 1 2 1 2 通过A c D s 系统插入建立突变体库 A c D s 系统是玉米中的一个转座子家族。该家族的自主元件是A c ，它包含和转座相关的酶，能使A c 、 D s 元件发生转座。而D s 是一种非自主元件，它单独不能发生转座，可以利用A c 的转座酶发生转座。A c D s 系统的转座是通过剪切、粘贴的机制进行的。在后代中，由于A c D s 元件的重新转座，A c D s 元 件在原插入位点发生切除，原插入失活基因恢复原来的功能，产生回复突变。A c D s 还可以在一个遗传 位点附近发生多次插入，产生位点特异性突变。这样，当插入发生在基因间区域时，可以得到原插入位 点附近基因的插入突变，还可以得到一个基因的多个突变的等位基因。其它的植物中研究得如此清楚的 转座子家族还很少。目前，把A c D s 系统已成功地转到拟南芥、水稻、番茄、胡萝b 等其它植物中，构 建插入突变体库并进行基因功能的研究“0 。 1 2 1 3 通过T o s l 7 建立植物突变体库 逆转录转座子在真核生物中是广泛存在的一种可转移元件。在植物中它们常以高拷贝数出现，构成 植物基因组的大部分。不过，在正常条件下它们是失活的。T o s l 7 是水稻中的一种逆转录转座子，它属于 长末端重复逆转录转座子里的c o p i a 类型。在正常生长条件下是不转座的，拷贝数很低，在不同的水稻品 种中有卜5 个拷贝。在组织培养的条件下，可以发生转座，但其后代在正常条件下种植时，T o s l 7 又重新 失活。它的转座是通过复制、粘贴的机制进行，会使其拷贝数增加，但不会发生回复突变。T o s l 7 的拷贝 数随着组培时间的增加而增大，可以通过对组培时间的调节来控制它的拷贝数。A k i o M i y a o 等| 1 引报道他 们已经用粳稻品种日本晴建立了一个包含4 7 1 9 6 个株系的T o s l 7 插入突变体库。据估计平均每个株系大约 有1 0 个插入位点，这样该群体总共有约5 0 0 0 0 0 个插入位点。同时获得了4 3 1 6 个株系的4 2 0 0 0 个插入位点的 侧翼序列，建立了侧翼序列数据库。通过对侧翼序列分析发现T o s l 7 的插入位点明显偏向于基因密度较高 的区域，有T o s i 7 插入的热点和冷点。此外，T o s l 7 对特定的基因类别有偏向性。比如，蛋白激酶基因和 抗病基因中发现的插入突变明显偏高。 1 2 2 通过激活标记插入构建突变体库 对于突变体库的利用，传统的方法是通过功能缺失突变体来分离基因并研究其功能，但是，对于存 在着基因功能冗余现象的基因家族或者对于那些植物生存所必需的基因，功能缺失突变往往很难进行研 究。此外，对于由数量性状位点控制的性状，无法用单基因的缺失来获得突变体，在这种情况下，功能 获得突变就显得至关重要了。激活标技术因其特有的优势在功能获得突变体的研究中独树一帜，与其它 方法相比，激活标记技术有以下优点：( 1 ) 含有增强子的T D N A 可引起插入位点上游或下游基因的超表 达，从而得到功能获得突变体；( 2 ) 由于这种突变体是显性遗传的，所以在T 代就可以通过表型变化筛选 河南农业大学硕士学位论文 到；( 3 ) 利用质粒拯救或T A I L P C R 的方法可以很方便地克隆到相应基因；( 4 ) 在强启动子控制下将该基 因在野生型中表达可以在下一代重现该突变体的表型；( 5 ) 基因家族中某个基因超表达所引起的突变不 影响该家族中其它基因的功能。到目前为止，已有许多成功的报告。此外，在其它植物如矮牵牛( P e t u n i a h y b f i d a ) 、杨树( P o p u l u s ) 和番茄( L y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 的基因功能研究中，该技术也取得了重要进展。 因此，激活标记技术是构建功能获得突变体库的有效方法，具有独特的优势引。 1 2 3 通过理化因素诱变构建突变体库 利用物理因素比如辐射、空间搭载等方法，可使植物发生突变，并建立突变体库。化学诱变突变体 库的构建是用化学试剂对植物种子或组织进行诱变处理。主要包括两类化学诱变剂。烷化剂：指具有烷 化功能的化合物，带有一个或多个活性烷基，该烷基转移到一个电子密度较高的分子上，可置换碱基中 的氧原子，碱基被烷化后，D N A 在复制时会导致配对错误，产生突变。叠氮化钠：一种动植物的呼吸抑 制剂，可使复制中的D N A 的碱基发生替换，从而导致突变的发生，是目前诱变率高而安全的一种诱变剂。 常用的化学诱变剂的种类如烷化剂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟胺、吖啶等。 这种化学诱变方法一般应用于基因组较大，并且遗传转化较难的物种，比如小麦突变体库的建立，主要 是基于甲基磺酸乙酯( E t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e ，E M S ) 的诱变来产生突变体的，E M S 是烷化剂的一种，能 对碱基进行修饰，最终在D N A 复制的过程中因错配而引入突变“1 5 1 。尽管遗传学家非常依赖于高效的化 学诱变，但由于传统的对突变体的遗传学筛选主要是针对表型来选择，这样的结果致使他们只能鉴定出 很少一部分，并不能很容易地鉴定出那些没有明显可见表型变化的突变体。同时以P C R 为基础的检测方 法只能检测到插入缺失突变体，对于那些点突变却无能为力，也耳P E M S 诱变的突变体突变位点较难鉴定， 另外突变基因的克隆的更是困难，一般要通过图位克隆的方法来获得目的基因，但是由于小麦是异源六 倍体，基因组很大，通过正向遗传学来研究小麦难度很大。因此小麦突变体库的建立目前还处于研究的 初步的阶段。令人可喜的是，几年前发展起来了定向诱导基因组局部突变技术( T a r g e t i n gI n d u c e dL o c a l L e s i o n sI NG e n o m e s ，T I L L I N G ) ，该技术能够检测到单个碱基的突变和变异，因此，突变体库的建立和应 用，是功能基因组学研究的一种新思路，对小麦等复杂作物的研究会有很多助益的。 油菜中利用理化诱变的方法已经获得了生育期、丰产、花形态、抗除草剂、抗病、叶片黄化等不同 类型的变异种质资源，丰富了基因库，并已应用于品种选育之中。 1 2 3 1E M S 诱变突变体库的原理及应用 选用E M S 诱变六倍体小麦，这主要是因为E M S 诱变主要为点突变，对染色体造成的机械损伤较小， 这虽然会减少表型突变发生的机率，但是可以减少对后代突变表型的筛选和鉴定工作，比较轻松的得到 一些由基因微小变化引起表型变化的突变体。 E M S 是一种烷化剂，E M S 的烷化作用主要发生在D N A 上的鸟嘌呤N 7 位置上，E M S 诱变的主要结果 有两种：一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，代替胞嘧啶，发生转换型的突变，造成G C 碱基对变为A T 碱基对，E M S 诱变有9 9 的机率是这种情况引。二是由于鸟嘌呤的N 一7 烷基活化，糖苷键断裂造成脱嘌 呤，脱去鸟嘌呤的D N A 分子，在进一步复制时，原来的鸟嘌呤的位置成了一个空位，其互补位置上的碱 基就不受严格的配对限制，4 种碱基都有机会进入，从而造成置换或颠换现象，但这种现象发生的机率 6 河南农业人学硕 ：学位论文 较小l ( 图2 ) 。 种子经E M S 处理后，幼胚的一些细胞的染色体D N A 分子发生点突变，这种变异保留在M 植株的体 细胞中，如果精子和卵细胞是由同一个体细胞分化而来，那么生成的种子含纯合型突变；如果精子和卵 细胞是由两个含有突变的体细胞( 或一个含有突变，一个没有) 分化产生那么生成的种子含杂合犁突变 “引。G r e e n e 等对E M S 诱变后M 2 代基冈型进行了分析，检测了1 9 0 0 棵E M S 处理的拟南芥M 2 代的1 9 2 个基冈 位点。检测出含有杂台型突变位点的数营是纯台型的二倍，然而对丁无义突变检测出杂合体的数量是纯 合体的3 6 倍，这说明纯合的无义突变是有毒害的，部分含有纯合的无义突变个体在M 2 代种子萌发时就 已经夕E 亡了。同时还发现植物的修复机制可以发生作用“6 | 。 经E M S 化学诱变的小麦种子，由于种子的胚细胞受剑诱变剂的破坏，在M l 代群体中会表现出较明显 的畸形，这可以用来判断诱变剂是否有效。经M 。代植株的生长，M 2 代种子会消除诱变剂机械损伤带来 的表型变化，同时由于个别M 2 代种子的基冈组D N A 发生变化，冈此在M 2 代群体会表现出有些植株生长 较对照无明显差异，而有些表型发生变化。冈此，M 2 代群体表型变异是进行突变体库评价的最重要的指 标。经M 2 代筛选的突变体，基冈型需要根据M 3 株系的分离情况进行初步判断。 日 a I I ( y I a 石伽 图2E M S 化学诱变遗传模式 F i g 2M u t a g e n i z i n gs e e d sr e s u l t si nc h i m e r i cp l a n t s 7 One IU_ll!ldm H 河南农业大学硕士学位论文 目前，已经在拟南芥n9 1 、玉米、番茄口、大麦瞳2 1 、小麦瞳3 1 等植物中利用E M S 诱变技术构建了突变 体库，井在功能基因组学研究中发挥了重要作用。孙加焱等瞳引利用Y 射线与甲基磺酸乙酯( E M S ) 溶液诱 变技术复合处理甘蓝型油菜高油6 0 5 的成熟种子。经田间M 2 筛选和M 3 验证，共筛选N 1 5 2 个叶色、叶形、 株高、分枝数、分枝角度、茎径、茎色、花色、花瓣数、花瓣大小、花蕊形态、雄性不育、死蕾及开花 期等性状发生变异的突变体，占M 2 诱变群体总数的1 2 6 7 。利用水培法进行M 3 和M 4 株系的子叶和根系 变异性状筛选和验证，发现子叶和根系变异频率分别为1 2 7 8 和7 0 7 。现已构建了包括叶片、株型、 花器、子叶、根系及部分生理性状变异类型的突变体库，可为今后油菜遗传改良和功能基因组学研究提 供更多的种质资源。C h i u 等利用E M S 构建的拟南芥突变体库，筛选到加R M D 叩基因的不同变异类型， 确定了该基因在花的心皮发育中起到的重要作用口5 1 。G a b r i e l s o n 等人利用E M S 构建的拟南芥突变体库， 结合基因克隆技术成功的获得口从，基因并验证了它在抗铝害中发挥的重要功能【2 。K u r a p a r t h y 等人利用 二倍体小麦构建的E M S 突变体库，筛选到单蘖突变体并成功的定位了控制分蘖的t i n 3 基因在染色体的位 置，开辟了提高谷类作物产量的新方向【2 ”。 1 3 突变体筛选的方法 1 3 1 利用表型鉴定筛选突变体库 以野生型植株作为对照，对突变体库的单株各个性状在不同时期进行表型鉴定，发现与野生型有明 显可遗传的表型变异即为表型突变，这类突变体鉴定起来较为容易，但需要大量的田间调查工作。 1 3 。2 利用T I L L I N G 技术筛选突变体库 定向诱导基因组局部突变技术( T a r g e t i n gI n d u c e dL o c a lL e s i o n s I N G e n o m e s ) ，最P T I L L I N G 技术，首先 f l j M c l a l l u m 首先提出 2 8 1 随后由于C E LJ 核酸内切酶的应用得到了进一步的发展和完善心引。 1 3 2 1T I L L I N G 技术的基本原理 首先利用化学诱变剂对研究材料进行处理，诱发产生一系列的点突变而获得突变群体。提取其自交 后代的基因组D N A ，把多个待测样品D N A 等量混合，建立D N A 池。然后以此D N A 池为模板，利用特异 性引物对特定D N A 区段进行P C R 扩增，通过变性和复性过程得到扩增片段的异源双链分子。如果有突变 发生，那么形成的异源双链中将含有错配碱基。利用特异性的核酸内切酶识别错配碱基的异源双链并在 错配处切开双链，最后红外双色荧光电泳或琼酯糖凝胶电泳检测。如果发现阳性结果，则再在混合的样 品中逐一检测，最后确定阳性样本，并从对应的突变体中筛选出有突变的表型。如图3 所示： 8 河南农业大学硕士学位论文 e 9 # 准田魁理程序分析电蟓田从a 倍岸中镇定史变簟糖 图3T i | Iin g 技术原理 F i g 3H i g h - t h r o u g h p u tT i l l i n g 1 3 2 2T l L L I N G 技术在突变体检测和功能基因组学研究中的应用 T I L L I N G 技术有效结合了化学诱变方法的高频率点突变和现代分析技术，与其他反向遗传学手段 相比，T I L L I N G 技术可获得点突变的系列等位基因，对可能涉及到亚致死基因的表型分析具有独特的优 势，另外由于它可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因只需要较小的突变群体，就可以对基因组特 定目标区域内多个突变位点进行鉴定n0 | 。这些突变有可能构成一个等位基因系列，产生一系列由弱到强 的表型效应，有利于进行结构与功能的研究。因此，T I L L I N G 技术在小麦和其它基因组大、倍性高、不 易转化的作物的功能基因组研究和分子改良实践中具有重要和光明的应用前景。T I L L I N G 技术自从2 0 0 0 年在模式植物拟南芥中创立以来，已被用于水稻| 3 1 | 、玉米【3 2 1 、小麦旧0 3 引、大麦旧4 1 、百脉根| 3 引、大豆、 番茄0 | 、甘蓝旧6 | 、莴苣1 30 | 、花生3 引、蓖麻1 等植物和果蝇阳引、斑马鱼m 3 引、老鼠州等动物的功能基因 组学研究中。短短的几年时间，T I L L I N G 作为一种全新的反向遗传学研究方法已经应用于多种生物中。 另外，该技术还可用于检测自然群体变异，分析与评价遗传资源，检测和标记开发S N P ，拓宽遗 传资源和作物品种改良等。 1 3 3 利用S D S - P A G E 方法筛选高分子量麦谷蛋白突变体 1 3 3 1 高分子量麦谷蛋白 小麦籽粒是含有一个种子的颖果，根据溶解特性将谷物籽粒蛋白分为溶于水的清蛋白、溶于盐的球 蛋白、溶于乙醇的醇溶蛋白和溶于酸或碱的麦谷蛋白，清蛋白和球蛋白统称代谢蛋白( 图4 ) 1 4 1 1 。 小爱种子蛋臼凄 贮藏蛋白质爿 贮藏器白质 r 1r 1 1 囊备骚臼 醇熔蟹臼爱豆障虽自球攫自肼镝置白墒畿白 广 广了1 ( z z - s s r d ) ) ( 1 o K D J “5 删( 2 埘如) 加胛盛瑚曹描日，I Y 1 9 p 如Il i 扣昀。Il 铷柏K D 0 0 - , 憎m ) 盯5 x D ) 图4 小麦籽粒蛋白分类说明图 9 河南农业大学硕士学位论文 C h e n 和B u s h u k ( 1 9 7 0 ) t 4 2 】又将蛋白分成两个组分，一组是溶于稀乙酸，一组不溶于稀乙酸。麦谷蛋 白和醇溶蛋白统称贮藏蛋白，由1 4 个位点( 图5 ) 近3 0 0 个等位基因控制【4 3 1 。据十二烷基硫酸钠聚丙 烯酰胺凝胶电泳( S D S P A G E ) 迁移率，麦谷蛋白分为A 、B 和C3 个区 4 4 1 ，A 区为高分子量麦谷蛋白 亚基，简称H M W G S ，分子量为8 0 ，0 0 0 - 1 2 0 ，0 0 0 D a ；B 和c 区为低分子量麦谷蛋白亚基，简称L M W G S ， 分子量为3 0 ，0 0 0 - 5 1 ，0 0 0 D a ，其与Y 和a 醇溶蛋白相距较远【4 5 1 1 4 6 1 ；最后是D 组亚基，也属于L M W G s ， 与醇溶蛋白相距较近( 图6 ) 4 7 - 4 9 。 G h D 2 6 B S 口= 】一 G h _ B 2 G h A 2 1 D S z ，= 】，一 o h D 1G 1 1 】D 3G l u D 1 l B S C 【，【= ，口一 G h - B 1G l u B 3G h B 3G l u B 1 G h - A 1O h l - A 3G h A 3G h l - A 1 6 D L 6 B L 6 A L l D L 1 B 乙 - - J L - - - - - - - - - - J l - - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - - J I - - - - - - - J L - - - - - - - J L - - - - 一C M 8 06 0加2 002 0 y - 礁董藏 图5 小麦贮藏蛋白基因位点图 图6S D S - P A G E 电泳下，麦谷蛋白亚基分区示意图 注：根据G j a r t - b e | Ii ( 2 0 0 1 ) 修改绘制A ：x 一和y 一高分子量麦谷蛋白亚基B 一c - 大量研究证实，H M W G S 对小麦品质有重要影响5 卯。高分子量麦谷蛋白亚基( H M W G S ) 在决 定谷蛋白弹性方面起着关键作用，特别是某些H M W G S 的存在与缺乏对品质的影响尤为明显【5 6 】【5 7 1 。小 麦品种H M W G S 受遗传控制，不受环境影响，具有品种的特性【5 8 1 。 1 3 3 1 1 命名 目前，“字母一数字”命名法引用最广，是F l q P a y n e 等( 1 9 8 0 ，1 9 8 1 ) 4 4 , 5 9 1 根据H M W G S 的S D S P A G E 图谱提出的，其中亚基为“数字命名”系统，等位基因为“字母命名”系统唧】。起初，在S D S P A G E 1 0 河南农业大学硕士学位论文 电泳图谱中，按照亚基谱带的迁移率，用阿拉伯数字对其进行编码，小的数字表示低迁移率。当新亚基 被鉴定时，则不再遵循这个数字顺序，如亚基2 l ，其迁移率很低，但它的命名编码数字很大。为使用方 便，P a y n e 等( 1 9 8 4 ) 【6 1 1 根据分析结果以及对面包品质的影响大小，绘制了G l u A 1 ，G l u B 1 j f g I G l u D l 位 点不同亚基等位变异形式及其对面包品质的影响大小示意图，如图7 所示。 图7H M w - G S 三个基因位点的等位变异形式及其与面包烘焙品质的关系 注：资料来源：P a y n e 等，19 8 4 ：图中左侧为对照中国春( C hin e s e $ p rin g ) ：小写字母代表对应的等位基因 除了P a y n e 等提出的命名系统外，也有人提出了不同的数字命名系统或字母命名系统，但研究者普 遍使用的是P a y n e 等提出的“字母数字”命名法。 1 3 3 1 2 多态性 P a y n e 和L a w r e n c e ( 1 9 8 3 ) 6 0 l 总结了大约3 0 0 种面包小麦的等位基因顺序和G l u 1 位点亚基的变异类 型，G l u A I 位点有三种变异形式( 1 、2 和N u l l ) ；G I u B l 位点有十一种变异形式( 7 、7 + 8 、7 + 9 、6 + 8 、2 0 、 1 3 + 1 6 、1 3 + 1 9 、1 4 + 1 5 、1 7 + 1 8 、2 1 和2 2 等) ，编码1 4 种不同的多肽：6 、7 、8 、9 、1 3 、1 4 、1 5 、1 6 、1 7 、 1 8 、1 9 、2 0 、2 l 、2 2 ；G I u D l 位点有六种变异形式( 2 + 1 2 、3 + 1 2 、4 + 1 2 、5 + 1 0 、2 + 1 0 和2 2 + 1 2 等) ，编 码7 种不同的多肽：2 、2 2 、3 、4 、5 、1 0 、1 2 等。但自从这种分类公布之后，M c i n t o s h 等( 1 9 9 4 ) 1 6 2 1 报 道了更多的亚基，这表明H M W G S 具有较高程度的多态性。 各位点存在着大量的变异，其中以1 B 的最大，而1 A 的最小。此外还不断发现了一些新的等位基因 形式，如G l u B I 位点的2 1 木+ 2 l 幸y 和G l u D l 位点的重组类型5 + 1 2 等。H M W G S 的广泛多态性为品质育种 中优质亚基的聚合奠定了基础，提供了丰富的遗传变异，有利于小麦面筋强度的遗传改良研究，赋予了 H M W G S 广阔的研究空间。 1 3 3 1 5H M W G S 与品质问的关系 尽管H M W G S 的含量只占总蛋白含量的4 0 左右，但其却是面筋弹性的主要决定因子，并在一定 河南农业大学硕士学位论文 程度上促进了谷蛋白大聚合体的形成，对面包的加工品质具有非常重要的影响【6 3 】 6 1 1 1 6 4 1 6 5 1 。P a y n e 等 ( 1 9 8 1 ) 4 4 】通过研究普通小麦杂交后代的沉降值与亚基组成之间的关系，表明不同的亚基对品质的影响是 不尽相同的。在G l u D 1 位点，拥有5 + 1 0 亚基的通常也具有好的品质，而2 + 1 2 亚基则与差的品质相关。 这个结果，也被其他研究者所证明。例如，B r a n l a r d 和D a r d e v e t ( 1 9 8 5 ) t 删研究表明，面筋强度，韧性 和Z e l e n y 沉降值与7 + 9 和5 + 1 0 亚基成正相关，与2 + 1 2 亚基呈负相关，1 亚基与面筋强度呈正相关，亚 基2 木与1 7 + 1 8 则与韧性呈正相关。 H M W G S 组合在育种过程中已经成为品质育种的一个重要指标【6 7 】【6 8 】。5 + 1 0 亚基与面筋强度的正相 关，2 + 1 2 与面筋强度的负相关已经被广泛证明。对其他等位基因上不同亚基组合研究表明：G l u B 1 位 点上，1 7 + 18 和面筋强度成正相关，相对应的亚基2 0 x + 2 0 y 则呈负相关。 面筋强度上所存在的这些差异，是由于谷蛋白聚合体分子量差异引起的蛋白溶解性不同而造成的 【6 9 】。而等位基因间的差异，目前还没有清楚的解释。不过，对比5 + 1 0 和2 + 1 2 这两个亚基组合，猜测 D x 5 亚基中多出的一个半胱氨酸残基可能是导致对品质影响产生差异的原因【70 1 。 1 3 3 2S D S P A G E 方法 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s