大豆铁蛋白基因的克隆、表达载体的构建及对拟南芥的转化-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 论文题目： 密级 英文题目：! Q 卫i 丛gQ 苎Q Y 坠璺望墅竺! ! i 垒望g 笠望笠：Q 望! 坠! i Q 望Q ! ! 兰錾墨卫宝兰苎i Q 翌 ! 竺! Q 翌望建! 垒坠! Q 堡垒丛Q 堕型i ! b4 苎堡垒i 型翌巳兰丝 论文提交 日期： 学位授予 日期： IIIIII I l lI III Jr lrIIIl Y 17 2 8 7 9 2 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 大豆铁蛋白基因的克隆、 学位 硕士 文题目 表达载体的构建及对拟南芥的转化 级别 学生学科导师 姓名 王淑丽作物遗传育种专业陈新建 专业姓名 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用 过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名盘淑矾：肭导师签名：矽例嫂一 日期：砷年石月侈日日期：力( 。年占月盯日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 ，层舞、：、 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 ，靖 嚣妻7 日期：御年霸月缫日雾日期d D l 睥月匹日日期：办( 年白月锢J 致谢 本文是在导师陈新建教授悉心指导下完成的。从论文的选题、试验设计、 到论文的完成，都倾注了恩师的大量心血和汗水。三年光阴转瞬即过，在此论文 即将完成之际，回想恩师三年来在百忙之中对我的的关怀和帮助，谆谆教诲，殷 殷关切，感激之情，难以言表。恩师严谨的治学态度、渊博的学识、孜孜以求的 敬业精神、忘我的奉献精神，勤奋不息的工作作风，诲人不倦的为师之道，严己 宽人的大家风范以及真诚质朴的待人准则，不仅是我永远学习的榜样，更是激励 我不懈奋斗的动力。师恩深似海，终生永难忘! 衷心感谢农学院陈军营副教授和河南农科院陈占宽研究员在百忙之中对论 文进行审阅，并对论文的修改提出了宝贵的意见。 特别感谢陈军副营副教授、中国农业科学院傅永傅研究员、范成明博士后 等在试验实施过程中所给予的指导和帮助；感谢崔党群教授、詹克慧教授、徐 海霞副教授、程西永老师、董中东老师等的关心与帮助。 三年中，师姐杨艳惠、丁明丽、耿华春、崔琰、林婵娟、李香、刘海霞、 凌新平、师兄沈向磊、同窗好友马平安、马锦华、张清哲、张艳敏、师弟薛正刚、 李明杰、师妹雷晨芳与我同甘共苦，互相帮助与支持，一起度过了这段短暂而宝 贵的时光。往昔时光，历历在目，同门师谊，相伴终生! 衷心感谢室友赵琳、张雷、李娜、谷小霞、赵炎葱三年来的鼓励与帮助! 特别感谢好友曲小飞、陈清雪、王恒元给予我的帮助和支持! 感谢我的家人，是他们的关心、支持、理解和爱护激励我永远向上；特别感 谢我的爱人刘胜波先生，在我最困难的时候给予慷慨无私的帮助，在求学期间为 我付出了太多太多，他的理解、支持、宽容和鼓励，使我勇于面对一切的周难险 阻。 最后向三年来在学习、生活、科研中给予无私帮助而未能一一述及的各位 老师、同学、朋友和亲人表示我最诚挚的谢意! 王淑丽 2 0 1 0 年6 月于郑州 目录 摘要1 第一章综述2 1 1 研究目的和意义2 1 2 植物铁蛋白基因研究现状2 1 2 1 铁蛋白的结构3 1 2 2 铁蛋白的作用途径- 3 1 2 3 铁蛋白在植物中的功能3 1 2 4 铁蛋白基因转植物研究4 1 3R T P C R 技术研究进展。5 1 3 1R T P C R 技术原理：5 1 3 2R T P C R 引物的选择6 1 3 3 R T P C R 的优化6 1 3 3 1 增加R T P C R 灵敏度6 1 3 3 1 1 分离高质量R N A 6 1 3 3 1 2 使用无R N a s e H 活性( R N a s e H ) 的逆转录酶7 1 3 3 2 增加R T P C R 特异性7 1 3 3 3 提高逆转录保温温度8 1 4 农杆菌介导的植物转化研究进展8 1 4 1 农杆菌T i 质粒和鼬质粒的结构和功能8 1 4 2 影响农杆菌转化的因素一9 1 4 2 1 农杆菌菌株对转化的影响9 1 4 2 2 植物外植体及基因型对转化的影响9 1 4 2 3 共培养方式对转化的影响：- 1 0 - 1 4 3 农杆菌在植物上的应用1 0 1 5 本实验技术路线1 0 第二章大豆铁结合蛋白基因的克隆及其推定的蛋白结构分析1 2 1 材料与方法：1 2 1 1 植物材料12 1 2 主要试剂12 1 3 方法12 1 3 1 引物获得1 2 1 3 2 总R N A 的提取与e D N A 的获得一1 2 R N A 纯化1 3 R N A 的反转录c D N A 第一链的合成：1 4 1 3 3 目的基因P C R 扩增1 4 1 3 4 推定的铁结合蛋白生物信息学分析一1 4 2 结果与分析1 4 2 1 大豆铁蛋白基因的克隆1 4 2 1 1 铁蛋白基因片段的扩增1 4 2 1 2 铁蛋白基因阳性克隆的筛选、鉴定与测序1 4 2 2 铁蛋白生物信息分析15 2 2 1 推定的大豆铁蛋白基因的氨基酸基本理化性质1 5 2 2 2 推定的大豆铁蛋白功能区域分析1 6 2 2 3 推定的大豆铁蛋白结构预测1 7 2 2 4 不同生物体铁蛋白基因氨基酸序列的同源性及聚类分析1 8 3 讨论21 第三章大豆铁结合蛋白基因植物表达载体的构建2 2 l 材料和方法2 2 1 1 材料2 2 1 1 1 菌株2 2 1 1 2 载体一2 2 1 1 3 目的基因2 2 1 1 4 所用引物2 2 1 1 5 试剂及试剂盒2 2 1 1 6 主要试剂的配制2 2 1 2 试验方法2 2 1 2 1 大肠杆菌感受态细胞的制各2 2 1 2 2 目的片段与载体片段的连接及大肠杆菌的转化2 3 I l 1 2 6 目的基因表达载体转化大肠杆菌2 5 1 2 7 目的基因表达载体的培养及鉴定2 5 2 结果与分析2 5 2 1 大豆f e r r i t i n 基因p G w cA I - J 克隆载体的获得2 5 2 2 大豆f e r r i t i n 基因植物表达载体的获得2 6 3 讨论一2 7 载体图谱2 8 第四章农杆菌介导的大豆铁蛋白f e r r i t i n 基因转化拟南芥2 9 l 材料和方法2 9 1J 材料2 9 1 1 1 菌株2 9 1 1 2 载体2 9 1 1 3 目的基因2 9 1 1 4 试剂及试剂盒2 9 1 1 5 主要试剂的配制2 9 1 2 试验方法2 9 1 2 1 D N A 提取2 9 1 2 2 农杆菌感受态细胞的制备。3 0 1 2 3 拟南芥种植培养3 0 1 2 4 农杆菌转化3 0 1 2 5 农杆菌克隆的鉴定3 0 1 2 6 拟南芥的转化3 0 1 2 7 B a s t a 筛选31 1 2 8B a s r a 筛选阳性植株的分子鉴定3l 2 结果与分析3l 2 1 植物表达载体转化农杆菌：31 2 2 目的基因转化拟南芥3 2 I 2 3 转化植株的筛选和分子鉴定3 3 3 讨论3 4 结论3 5 参考文献3 6 A b s t r a c t ：4 2 I V 河南农业大学硕士学位论文 摘要 铁缺乏是世界范围内人类面临的严重营养问题。在禾谷类作物中表达豆类铁蛋白，以 增加食物中的铁摄入量，是改良食品中铁含量的一个理想途径。本实验以n e b i 数据库获 得已知豆类铁蛋白序列为模板，借助软件P r i m e 5 。0 进行引物设计，通过反转录方法从豫 豆8 号中克隆到e D N A 片段，测序结果表明该基因e D N A 全长7 5 2 b p ；利用D N A M A N 软 件进行序列比对分析发现该序列与大豆( M 6 4 3 3 7 ) 铁蛋白同源性高达9 8 以上，编码2 5 0 氨基酸。运用生物信息学软件及相关网站对其功能位点、结构功能域分析，结果显示该基 因具有1 个F E R R I T I N L I K E 功能域，2 个铁蛋白基因家族铁结合区域的信号序列，6 个 磷酸化位点等重要功能位点。 本研究表达载体采用G a t e w a y 重组克隆技术构建，目标基因连入p G W C 后即为入门 克隆( E n t r yC l o n e ) ，通过与表达载体做L R 反应构建目标基因的表达载体。通过抗性筛 选、P C R 检测证实大豆铁蛋白f e r r i t i n 基因植物表达载体构建成功。通过农杆菌电击转化 的方法将表达载体P L E E L A 转入农杆菌p M P 9 0 R K 中。 利用农杆菌介导的花粉管通道法将大豆铁蛋白f e r r i t i n 基因导入拟南芥植株，获得抗 除草剂抗性的植株，提取抗性植株叶片D N A 对其进行P C R 检测，鉴定结果是四株为阳性， 初步证实大豆铁蛋白基因已经整合进拟南芥基因组中。 本研究对大豆铁蛋白基因的克隆、植物表达载体的构建及对拟南芥的转化，为进一 步研究大豆铁蛋白f e r r i t i n 基因的功能和利用该基因进行禾谷类作物的营养品质的分子改 良奠定基础。 关键词：大豆，铁蛋白基因；克隆；载体构建；转基因；拟南芥 河南农业大学硕士学位论文 第一章综述 1 1 研究目的和意义 铁缺乏已成为影响世界人口的严重营养问题，全世界大约2 亿多的妇女和儿童患缺铁性 贫血。我国缺铁性贫血高发的原因，主要是因为我国人民膳食以植物性食物为主，人体摄取 铁8 5 以上来自植物性食物，而植物性食物中的铁为非血红素铁，吸收率通常非常低。同 时植物性食物中含有许多铁吸收的抑制因子，如草酸等成分，可以明显抑制铁的生物吸收和 利用。再加上随着生活水平的提高，近年来人们的饮食越来越精细，从而也加剧了缺铁性贫 血的发生。 据调查，目前我国人均每日铁摄入量为2 3 4 毫克，是我国每日膳食铁推荐摄入量的 1 7 6 5 。可见，从总体上说，我国居民的铁摄入量并不低。但是铁吸收率只有3 5 ， 因此，实际上真正进入人体的铁就只有0 7 1 2 毫克人日。这个数量不能满足人体健康 的需要。因此，提高铁绝对含量及增加其生物有效性以培育富铁的粮食作物品种，是解决全 球性缺铁性营养危机的有效办法。 尽管通过食品添加剂和临床上口服含铁化合物如硫酸亚铁、葡萄酸亚铁、右旋糖酐铁等 可有效控制铁的缺乏，但相关的费用过高，难以在发展中国家实施。鉴于缺铁所导致的一系 列问题日益严重，国际食物政策研究中- I l , ( I F P R I ) 于1 9 9 5 和1 9 9 8 年分别制定了“矿物质强化 谷物研究开发计划”，要求重点研究培育铁、锌及其他矿质微量元素含量显著高于普通谷物 的特种营养谷物品种。 当前，人体内铁元素的重要来源之一是通过饮食从植物的铁蛋白中获取，因此，提高食 物中铁的绝对含量和生物有效利用率，对满足人体对铁的需求，预防铁缺乏引起的各种疾病 具有重要意义。近年来，随着基因工程技术的发展，出现了许多克隆、转化基因的新方法、 新手段，因此，通过转基因技术提高植物种子中铁结合蛋白的含量来解决人体铁元素缺乏， 是一条行之有效的途径。 铁结合蛋白是动植物体内广泛存在的一类贮存铁的蛋白，自1 9 6 3 年H y d e 等第一次报道 铁结合蛋白以来，关于铁蛋白的研究越来越受到研究者的关注，这归因于铁蛋白高强的贮铁 能力及其以生物可利用的形式存在。铁蛋白既可以储存大量的可被植物利用的铁，又能抵抗 环境胁迫。利用铁蛋白的转基因研究不仅可以缓解由于铁缺乏而引起的一系列疾病，而且能 提高植物对环境的耐受性，在提高植物本身对细菌、真菌感染和病毒引起的细胞氧化性损伤 的抗性具有重要意义。 本课题通过对大豆铁蛋白基因的克隆与转化拟南芥研究，从而为植物的遗传改良提供理 论依据，为进一步利用该基因进行其他粮食作物的营养品质改良奠定了基础。 1 2 植物铁蛋白基因研究现状 铁是人体不可缺少的微量元素。缺铁已成为影响世界上3 0 人口的严重营养问题，尤其 多见于发展中国家。当前，人体内铁元素的重要来源之一是通过饮食从植物的铁蛋白中获取， 2 河南农业大学硕士学位论文 因此，提高食物中铁的绝对含量和生物有效利用率，对满足人体对铁的需求，预防铁缺乏引 起的各种疾病具有重要意义。 自1 9 6 3 年H y d e 等第一次报道铁结合蛋白以来川，关于铁蛋白的研究越来越受到研究者 的关注，这归因于铁蛋白高强的贮铁能力和其以生物可利用的形式存在 2 , 3 1 。目前，已证实 利用高铁结合蛋白大豆治疗鼠的饮食性铁缺乏症效果明显【4 t 5 】，同时，用转铁蛋白基因的水 稻饲养小鼠与用F e S 0 4 喂养在防治贫血方面具有相同的功效血【6 】。近年来，随着基因工程技 术的发展，出现了许多克隆、转化基因的新方法、新手段，因此，通过转基因技术提高植物 种子中铁结合蛋白的含量来解决人体铁元素缺乏，是一条行之有效的途径。 1 2 1 铁蛋白的结构 铁蛋白是高铁含量化合物，呈球形，由蛋白壳和无机铁核两部分组成。蛋白壳直径约为 l l 1 3 n m ，厚度约为3 5 n m ，由2 4 个同源或异源亚基组成，每两个亚基为一对，每对中的 亚基相互平行，首尾相对，构成菱形十二面体的一个面，这个十二面体有6 个四重轴和8 个三 重轴，最终构成4 3 2 点对称的蛋白壳，形成球形空腔结构，共有6 条通道供铁离子出入；铁核 位于蛋白壳中心，直径约为7 - 一8 n m ，由数千个氢氧化铁分子和数百个磷酸盐分子组成【7 1 0 】。 植物铁蛋白与动物铁蛋白具有氨基酸和高级结构上的同源性和相似性。植物铁蛋白是由 2 4 个亚基单位构成的分子量为4 5 0 K D 的生物大分子，最多可以贮藏4 5 0 0 个铁元素，通过对铁 元素的结合与释放来调节细胞的铁含量。动物铁蛋白亚基则主要有H 和L 两类。J e a n M i c h e l P e t i t 等对拟南芥铁结合蛋白的研究发现，植物铁蛋白呈E 一螺旋状结构，且具有亲水性，由一个 小的基因家族编码合成1 1 1 - 1 3 1 。F o b i s L o i s y 经过进一步研究后认为，编码玉米铁结合蛋白的 Z m F e r l 和Z m F e r 2 基因是N 8 个外显子和7 个内含子组成，二者在启动子区域有明显差异，植物 铁蛋白与动物铁蛋白的H 类相似【l4 1 。 1 2 2 铁蛋白的作用途径 一般铁蛋白通过两种方式固定亚铁离子：( 1 ) 0 2 进攻结合到铁蛋白中通道附近位点上的亚 铁离子，并将其氧化，产生F e ”沉淀于空洞之中；( 2 ) 其他分子催化直接结合到空洞中心表 面亚铁离子，随即沉积于氧化部位。铁蛋白所结合的铁也通过两种方式释放：( 1 ) 蛋白质降 解使其结合的铁释放；( 2 ) 铁螯合剂遇到适当还原剂。 1 2 - 3 铁蛋白在植物中的功能 植物中铁蛋白主要存在于细胞质体中，其主要作用是：( 1 ) 将铁隔离在蛋白外壳内，使 之成为无害形式；( 2 ) 作为胁迫蛋白对抗自由基毒害机体和调节植物机体铁平衡【l5 ，1 6 J ；( 3 ) 参与调节细胞R N A 代谢I ln 。 植物可利用的铁主要是F e 2 + 形式，但游离的F e 2 + 对植物有害。植物生长发育因子调节 铁蛋白的转录水平，环境胁迫和生理胁迫都能诱导植物铁蛋白的表达。铁蛋白在植物氧化应 激、预防植物组织衰老中具有重要作用【1 8 1 。铁蛋白基因缺失导致植株营养生长受阻，植物 生殖能力下降【l9 1 。在烟草植株中转入大豆铁蛋白基因，可提高叶片光合速率，增加光合产 3 河南农业大学硕士学位论文 物积累1 2 。 铁蛋白还能提高植株的抗病原菌侵染能力。D e l l a g i 利用细菌侵染易感宿主拟南芥2 4 小 时后，植株机体内A t F e r l 基因表达增加【2 1 】。B o u g h a m m o u r a 将引起植物软腐病的菊欧文菌 病原体导入拟南芥，发现铁蛋白在储藏铁和抗氧化损伤方面具有重要作用，从而提高了植物 抗菌能力【2 2 l 。D e a k 将苜蓿铁蛋白c D N A 转入烟草可提高植株对病毒引起的坏死和真菌感染 的抗性1 23 | 。 1 2 4 铁蛋白基因转植物研究 铁蛋白广泛存在于植物体内。铁结合蛋白作为植物细胞质体中一种专门贮存铁的蛋白 质，已经在多种植物中得到了克隆，如大豆【2 4 I 、豌豆【2 5 】、菜豆【2 6 】、豇豆【2 7 1 、玉米【2 8 】、小麦 【2 9 1 、大麦3 0 1 等。为了提高粮食作物的铁含量，改善人类铁营养的缺乏，豆类等高效铁蛋白 基因成为人们利用基因工程导入作物、提高铁蛋白含量的首选材料。 将高效铁蛋白基因( F e r ) 导入水稻品种以提高稻米铁含量的研究已取得了一定突破。G o t o 等在水稻储存蛋白谷蛋白启动予G I u B 一1 控制下，利用农杆菌介导的方法，将大豆铁蛋白基因 序列成功转入到水稻，同时利用P C R 和免疫组织印迹法对转基因植物进行检测，发现转基因 植株自交一代的铁含量比对照提高了3 倍【3 1 1 。Q u l e 等人在水稻储存蛋白谷蛋白启动G l u B 1 和 储存蛋白球蛋白启动G l b 1 控制下，把大豆铁蛋白基因导入水稻，发现转基因植物胚乳中的 铁含量是对照的1 3 倍，种子铁含量是对照的4 倍1 3 2 1 。徐晓晖等在组成型C a M V 3 5 S 启动子控制 下，将豌豆铁蛋白转化到水稻中获得转豌豆铁蛋白基因( F e r ) 水稻转化体，通过连续7 代自 交纯化并结合G U S 标记辅助选择，得到两份富铁转基因种质，其精米全铁含量为野生型亲本 秀水l1 的4 8 2 倍和3 4 6 倍 3 3 , 3 4 1 。董阔等采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的 谷蛋白基因启动子G I u B 1 驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2 个优良早稻品种“早稻2 9 7 ”和 “早稻2 7 7 ”，利用P C R 、S o u t h e r n 杂交分析方法验证转化，发现多数转基因植株T o T 3 代种 子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2 倍以上1 3 引。 将高效铁蛋白基l 玉t ( F e r ) 转入到小麦的研究进展较为缓慢，直到2 0 0 0 年，G e o r g i a 等才利 用基因枪法将大豆铁蛋白序列导入到小麦中，利用玉米组成型启动子泛素1 表达，经I C A P 光谱法分析，转基因小麦营养组织中的铁蛋白含量比对照显著增加，但种子中的铁蛋白含量 没有明显变化【3 6 1 。 ：在高表达铁蛋白基因植物中，种子铁含量的提高不仅依赖外源铁基因的高表达j 同时也 依赖于植株对铁的利用和转化【”】，而植物体内植酸水平的高低正是影响植株对铁利用转化 的重要限制因素。在低植酸含量的玉米植株中转入大豆铁蛋白基因可提高玉米胚乳铁含量和 铁的生物利用率【3 8 】。李梅等采用低植酸突变系和铁蛋I 兰t ( F e r ) 转基因富铁系稻米进行杂交， 从而得到了低植酸富铁转基因优良新种剧3 9 】。B r i c h - P e d e rs o n 等以b a r 基因作为选择系统，以 玉米泛激素1 ( u b i q u i t i n 1 ) 为启动子，采用微注射法轰击未成熟胚获得了转黑曲霉 ( A s p e r - g i l l u sn i g e r ) 植酸酶基因( p h y A ) 小麦植株，这为育成铁生物有效性高的小麦品种提供 4 河南农业大学硕士学位论文 了材料4 0 1 。 随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们对食物的营养品质也越来越重视。当前， 食品发展的国际化趋势促进了作物功能型品种的开发和培育，生产出营养富集、益于健康的 粮食来满足人类营养与健康的需要，已成为当今国际作物科学研究的一个新领域【4 。 1 3I 盯P C R 技术研究进展 近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图位克隆 技术、转座子标签技术、m R N A 差异显示技术、c D N A 文库筛选技术等。但上述方法大都具 有实验周期长、技术步骤繁琐且工作量大等特点，特别是基因的5 末端，若用R N a s e 保护、 S 1 核酸酶谱和引物延伸等方法来保证。P C R 技术自1 9 8 5 年建立以来，发展之迅速、应用之广 泛，表明其具有强大的生命力。近些年来，基于P C R 的基本原理，许多学者充分发挥创造性 思维，对P C R 技术进行研究和改进，使P C R 技术得到了进上步地完善，并在此基础上派生出 了许多新的用途。而R T P C R 技术克服了以上缺点，己逐渐成为克隆新基因的有效手段之一 4 2 1 。 1 3 1 R T P C R 技术原理 R T P C R 是将R N A 的反转录( R T ) 和c D N A 的聚合酶链式扩增( P C R ) 相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从R N A 合成c D N A ，再以c D N A 为模板，扩增合成目的片段。R T P C R 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中R N A 病毒的含量和直接 克隆特定基因的c D N A 序列。作为模板的R N A 可以是总R N A 、m R N A 或体外转录的R N A 产 物。R T P C R 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达 差异或不必构建c D N A 文库克隆c D N A 。R T P C R 比其他包括N o r t h e m 印迹、R N a s e 保护分析、 原位杂交及s 1 核酸酶分析在内的R N A 分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使 用逆转录酶，以随机引物、o l i g o ( d T ) 或基因特异性的引物( G S P ) 起始。R T P C R 可以一步 法或两步法的形式进行。在两步法R T P C R 中，每一步都在最佳条件下进行。c D N A 的合成 首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1 1 0 的反应产物进行P C R 。在一步法R T P C R 中，逆 转录和P C R 在同时为逆转录和P C R 优化的条件下，在一只管中顺次进行m J 。 5 C 一玎I i j 啦 翳戮翟篡黧糊 ，一、_ 一一、 椭矗 她 ，一- + 、赫 黼抵 ，- ，”、 蝴精嗍g = E 譬匠墨一E Z 茁盈E 墨墨墨盘 厂一 脚鼢A 瓤 f 景铲精黼雠扩”一G 卵 “”一” 、一 M 羁j 2 。厂乒鬻篇如 掣 _ P ：) M 黼溉 彬一”一、1 i l 乒暑? 燃魁 毹 正赢磊潍； - ) A M M M n d s 船，5 ，” 务了忑删懒 1 3 2 R T P C R 引物的选择 适用于长的或具有发卡结构的R N A 。适用于r R N A 、m R N A 、t R N A 等所 随机引物 有R N A 的反转录反应。主要用于单一模板的R T P C R 反应。 适用于具有P o l y A 尾巴的R N A 。( 原核生物的R N A 、真核生物的O l i g o d T r R N A 和t R N A 不具有P o l y A 尾巴。) 由于O l i g od T 要结合至l J P o l y A 尾巴上，所 O l i g od T 以对R N A 样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长c D N A 合成量大 大减少。 基因特异性 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时性引物代 引物 公司的S u p e r S c r i p tO n e S t e pS y s t e m 特别适合于与基因特异性引物连用。 1 3 3R T P C R 的优化 1 3 3 1 增) f l R T P C R 灵敏度 1 3 3 1 1 分离高质量R N A 成功的c D N A 合成来自高质量的R N A 。高质量的R N A 至少应保证全长并且不含逆转录酶 的抑制剂，如E D T A 或S D S 。R N A 的质量决定了你能够转录到c D N A 上的序列信息量的最大 值。一般的R N A 纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。T r i z o l 试剂法将一步法加以 提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解R N A 。T r i z o l 试剂法可以从最少1 0 0 个细 胞或l m g 组织中提取R N A 。一般不必使用o l i g o ( d T ) 选择性分离p o l y ( A ) + R N A 。不管起始模板 是总R N A J 丕是p o l y ( A ) + R N A ，都可以检测到扩增结果。另外，分离p o l y ( A ) + R N A 会导致样 6 河南农业大学硕士学位论文 品间m R N A 丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有m R N A 时，p o l y ( A ) + R N A 会增加检测的灵敏度。为了防止痕量R N a s e 的污染，从富含R N a s e 的样品 ( 如胰脏) 中分离到的R N A 需要贮存在甲醛中以保存高质量的R N A ，对于长期贮存更是如 此。从大鼠肝脏中提取的R N A ，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取 的R N A ，在水中保存3 年仍保持稳定。另外，长度大于4 k b 的转录本对于痕量R N a s e 的降解比 小转录本更敏感。为了增加贮存R N A 样品的稳定性，可以将R N A 溶解在去离子的甲酰胺中， 存于7 0 。用于保存R N A 的甲酰胺一定不能含有降解R N A 的杂物。来源于胰脏的R N A 至少 可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用R N A 时，可以使用下列方法沉淀R N A ：加入N a C l 至 0 2 M 及4 倍体积的乙醇，室温放置3 5 分钟，10 ，0 0 0 x g 离心5 分钟。 在逆转录反应中经常加入R N a s e 抑制剂以增加c D N A 合成的长度和产量。R N a s e 抑制剂要 在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂( 如D T T ) 存在的条件下加入，因为c D N A 合成前 的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解R N A 的R N a s e 。蛋白R N a s e 抑制剂仅防止 R N a s eA ，B ，C 对R N A 的降解，并不能防止皮肤上的R N a s e ，因此尽管使用了这些抑制剂， 也要小心不要从手指上引入R N a s e 。 1 3 3 1 2 使用无R N a s e H 活性( R N a s e H ) 的逆转录酶 逆转录酶催化R N A 转化成c D N A 。不管是M M L V 还是A M V ，在本身的聚合酶活性之外， 都具有内源R N a s e H 活性。R N a s e H 活性同聚合酶活性相互竞争R N A 模板与D N A ：J I 物或c D N A 延伸链间形成的杂合链，并降解R N A ：D N A 复合物中的R N A 链。被R N a s e H 活性所降解的R N A 模板不能再作为合成c D N A 的有效底物，降低了c D N A 合成的产量和长度。因此消除或大大 降低逆转录酶的R N a s e H 活性将会大有裨益。S u p e r S c r i p tI I 逆转录酶，R N a s e H 的M M L V 逆 转录酶及T h e r m o S c r i p t 逆转录酶，R N a s e H 的A M V ，比M M L V 和A M V 得到更多量和更多全 长的c D N A 。R T P C R 灵敏度会受c D N A 合成量的影响。T h e r m o S c r i p t l 七A M V 的灵敏性强得多。 R T P C R 产物的大小受限于逆转录酶合成c D N A 的能力，尤其是克隆较大的c D N A 时。同 M M L V 相比，S u p e r S c r i p I I 显著提高了长R T P C R 产物的产量。R N a s e H 的逆转录酶同时增 加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的3 7 - 4 2 的温度下进行。 1 3 3 2 增加R T P C R 特异性 第一链c D N A 合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所 合成c D N A 的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个 位点退火，产生短的，部分长度的c D N A 。这种方法经常用于获取5 末端序列及从带有二级 结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的R N A 模板获得c D N A 。为了获得最长的 c D N A ，需要按经验确定每个R N A 样品中引物与R N A 的比例。随机引物的起始浓度范围为5 0 至U 2 5 0 n g 每2 0 p l 反应体系。因为使用随机引物从总R N A 合成的c D N A 主要是核糖体R N A ，所 以模板一般选用p o l y ( A ) + R N A 。O l i g o ( d T ) 起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞 m R N A3 端所发现的p o l y ( A ) 尾杂交。因为p o l y ( A ) + R N A 大概占总R N A 的l 到2 ，所以与使 7 用随机引物相比，c D N A 的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，o l i g o ( d T ) - - 般不 需要对R N A 和引物的比例及p o l y ( A ) + 选择进行优化。建议每2 0 I _ t l 反应体系使用0 5 t g o l i g o ( d T ) 。o l i g o ( d T ) 1 2 - 1 8 适用于多数R T - P C R 。 1 3 3 3 提高逆转录保温温度 T h e r m o S c r i p tR T P C RS y s t e m 提供To l i g o ( d T ) 2 0 ，因为其热稳定性较好，适用于较高的 保温温度基因特异性引物( G S P ) 对于逆转录步骤是特异性最好的引物。G S P 是反义寡聚核 苷，可以特异性地同R N A 目的序列杂交，而不象随机引物或o l i g o ( d T ) 那样同所有R N A J I 萎火。 用于设计P C R 弓 物的规则同样适用于逆转录反应G S P 的设计。G S P 可以同与m R N A 3 最末端 退火的扩增引物序列相同，或G S P 可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对 象，为了成功进行R T P C R ，需要设计多于一个反义引物，因为目的R N A 的二级结构可能会 阻止引物结合。建议在2 0 I t l 的第一链合成反应体系中使用I p m o l 反义G S P 。 为了充分利用G S P 特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆 转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个G S P 退火温度为5 5 ，那么 如果使用A M V 或M M L V 在低严谨性的3 7 进行逆转录，G S P 所带有的特异性就没有完全利 用。然而S u p e r S c r i pI I 和T h e r m o S c r i p t 可以在5 0 ( 2 或更高进行反应，这就会消除较低温度时产 生的非特异性产物。为获得最大的特异性，可以将R N A 弓 物混合物直接从6 5 C 变性温度转 移到逆转录保温温度，并加入预热的2 反应混合液( c D N A 合成热启动) 。这有助于防止低 温时分子间碱基配对。使用P C R 仪可以简化R T P C R 所需的多种温度转换 1 4 农杆菌介导的植物转化研究进展 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染 大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌分为根瘤农杆菌和发 根农杆菌。根癌农杆菌( Agr o b a c t e r i u mt u me fa c i e n s ) 和发根农杆菌( Agr o b a c t e r i u mr hi zo g e n e s ) 是两种寄主非常广泛的土壤细菌，在自然状态下它们能通过伤口侵染植物，分别导致 冠瘿瘤和毛状根的发生。1 9 7 4 年Z a e n e n 等在根癌农杆菌体内发现并分离了一种与肿瘤 诱导有关的质粒，称为T i 质粒；早在1 9 0 7 年S m i t h 和T o w n s e n d 发现发根农杆菌 ( A g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 能诱导植物形成毛状根( h a i r y r o o t ) ，19 3 4 年H i l d e b r a n d 在对苹果 树的研究中再次阐述了该现象。毛状根是由发根农杆菌含有R i ( r o o ti n d u c i n g ) 质粒引起的。 农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T D N A 区，借 助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再 生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植 物( 尤其是水稻) 中也得到了广泛应用。 1 4 1 农杆菌T i 质粒j f l R i 质粒的结构和功能 T i 质粒是根瘤农杆菌染色体以外的遗传物质，为双股共价闭合的环状D N A 分子，分子 8 河南农业大学硕士学位论文 量为9 5 1 5 6 x1 0 6 D ，约1 5 0 - 2 0 0 K b 长，根据其诱导的冠瘿碱种类不同，T i 质粒可分为三类：章 鱼碱( o c t o p i n e ) ：P t i A c h 5 、P t i A 6 N C 、P t i B 6 5 3 、P t i A 9 1 6 2 ；胭脂碱型( n o p a l i n e ) ：P t i T 3 7 、P t i T 3 8 、 P t i C 5 8 ；农杆碱型( a g r o p i n e ) 和农杆碱素型( a g r o c i n o p i n e ) 或琥珀碱型( s u c c i a m o p i n e ) 根瘤农 杆菌T i 质粒可以分为四个区：( 1 ) T - D N A ( t r a n s f e r r d D N Ar e g i o n s ) ：是农杆菌侵染植物细胞时，从 T i 质粒上切割下来的转移到植物细胞的一段D N A 。该D N A 片段上的基因与肿瘤的形成有关。 ( 2 ) V i r 区( V i r u l e n c er e g i o n ) ：该区段上的基因能激活T D N A 转移，使农杆菌表现出毒性，故称 之为毒性区。T D N A 区和V i r 区在质粒上彼此相邻，合起来约占T i 质粒D N A 的1 3 。( 3 ) C o n 区 ( r e g i o no f r e p l i c a t i o n ) ：质粒结合转移位点编码区，该区段上存在着与细菌间接合转移的有关 基因( t r a ) ，调控T i 质粒在农杆菌和细菌之间的转移。冠瘿碱能激活仃a 基因，诱导T i 质粒转 移，因此，称之为接合转移编码区。( 4 ) O r i 区( o r i g i no f r e p l i c a t i o n ) ：该区段基因调控T i 质粒的自我复制，称之为复制起始区。 R i 质粒是发根农杆菌中位于染色体D N A 之外的独立基因组，为双链共价闭合环状 D N A ，其大小在18 0 2 5 0 k b 之间。根据R i 质粒转化植物后产生的毛状根合成冠瘿碱( o p i n e ) 的类型不同，将R i 质粒分为3 种类型：( 1 ) 甘露碱型( m a l l n o p i n et y