基于叶绿体DNA基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究-硕士论文

分类号：密级：秘密 华中农业大学硕士学位论文 1 8 39 68 7 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 R e s e a r c ho nt h eP h y l o g e n yo fC u l t i v a t e dC h r y s a n t h e m u m a n dW i l dR e l a t i v e sB a s e do nI n t e r g e n i cS e q u e n c eo f C h l o r o p l a s tD N A 研究生：李世茂 指导教师：王彩云教授 指导小组：刘国锋教授 张俊卫副教授 宁国贵副教授 胡智泉副教授 尹黎燕副研究员 专业：园林植物与观赏园艺研究方向：园林植物栽培与生理 获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2 0 1 0 年0 6 月 华中农业大学园艺林学学院 二O 一0 年六月 f I I I Irll Ir l llr lJiii irill lf | Y 17 9 9 9 6 8 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间0 J l 厂年6 月z 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：爿B 恢残时间：2 秽口年月岁 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 籼槲始搴世戌撇名：弼乏 3 签名日期：己9 口年月岁日签名日期：如lo 年月弓 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 目录 摘要。1 A b s t r a c t 3 l 前言5 1 1 引言5 1 2 菊属植物系统学与菊花起源研究进展6 1 2 1 基于形态学的研究6 1 2 1 1 比较形态学和数量分类研究6 1 2 1 2 种间杂交研究7 1 2 2 基于细胞学的研究8 1 2 3 基于同功酶的研究9 1 2 4 基于限制性酶切和P C R 技术的D N A 分子标记研究9 1 2 4 1R F L P 研究1 0 1 2 4 2R A P D 研究一1 0 1 2 4 3I S S R 研究1 1 1 2 4 4A F L P 研究一11 1 3 基于D N A 序列的分子系统学研究进展1 2 1 3 1 分子钟假说和中性进化理论简介1 2 1 3 2 叶绿体D N A 基因间隔序列在分子系统学中的应用1 4 1 3 2 1t r n L t r n F 间隔序列1 4 1 3 2 2r p l l 6 ，r p s l 6 内含子序列1 4 1 3 3 叶绿体D N A 序列在菊属植物分子系统学研究中的应用1 5 1 4 本研究的内容、目的和意义一1 5 2 材料与方法1 7 2 1 材料的采集1 7 2 2 试验方法2 0 2 2 1 药品及仪器2 0 2 2 1 1 试验所用药品及配方2 0 2 2 1 2 试验所用仪器2 l 2 2 1 3 序列分析软件2 1 2 2 2 基因组总D N A 的提取与质量检测2 2 2 2 2 1 基因组总D N A 的提取2 2 2 2 2 2 所提取基因组总D N A 的质量检测2 2 2 2 3 序列选择与引物设计2 3 2 2 4P C R 扩增2 7 2 2 4 1P C R 扩增反应体系2 7 2 2 4 2P C R 扩增程序2 8 2 2 4 3P C R 扩增产物的检测2 8 2 2 5 目标序列的获取2 8 2 2 5 1P C R 扩增产物测序2 8 2 2 5 2G e n e B a n k 中相关序列信息的获取2 9 一I 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 2 2 6 序列比对分析及系统进化树的构建3 0 2 2 7 神农香菊和野菊形态学对比观察3 0 2 2 8 神农香菊和野菊叶片挥发物质测定3 0 2 2 8 1 气相色谱条件的确定3 0 2 2 8 2 气质联用测定神农香菊和野菊叶片挥发物质3 0 3 结果与分析。3 1 3 1 基因组D N A 提取方法的优化3 1 3 2 序列的筛选。3 l 3 3 序列比对分析与系统进化树的构建3 2 3 3 1 基于自测叶绿体基因组t r n L t r n F 序列的系统进化树构建3 2 3 3 2 基于叶绿体基因组C h l p l 序列的系统进化树构建3 4 3 3 3 基于叶绿体m a t K - t r n K 序列的系统进化树构建3 6 3 3 4 基于G e n e B a n kt r n L t r n F 序列的系统进化树构建3 8 3 3 5 基于G e n e B a n kI T S 序列的系统进化树构建3 9 3 4 神农香菊与野菊的形态学观察。4 0 3 5 神农香菊与野菊叶片挥发物质的测定。4 2 4 讨论4 4 4 1 关于叶绿体D N A 序列在菊属植物分子系统学中的应用4 4 4 2 关于I T S 序列在菊属植物分子系统学中的应用4 5 4 3 关于栽培菊花起源的探讨。4 6 4 4 关于基于限制性酶切和P C R 的分子标记与基于序列的分子系统学方法对比4 7 4 5 关于神农香菊的分类地位一4 8 4 6 存在的不足4 8 参考文献5 0 j g C 谢5 7 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近 缘种亲缘关系研究 摘要 本研究利用多个前人广泛应用的叶绿体D N A 基因间隔序列，对来自不同地 区的菊花与野生近缘种共5 3 份供试材料的亲缘关系进行了研究，构建了系统发 育树，旨在从叶绿体D N A 序列水平上探索它们的亲缘关系和菊花的栽培起源问 题。本研究还通过对本试验不同结果之间的对比和与前人研究成果的对比，探讨 了基于D N A 序列的分子系统学方法的可靠性问题。 本研究的供试材料包括2 6 个栽培菊花品种共2 7 份种质，1 6 个野生近缘种 共2 6 份种质，主要研究结果如下： 1 、试验结果筛选出了多态性最高，最适合构建菊花与野生近缘种系统发育 树的m a t K - t r n K 序列，并且发现虽然各叶绿体D N A 基因间隔序列的多态性差异 很大，但依据不同序列所构建的系统发育树结构基本一致，证明了短小片断在基 于D N A 序列的分子系统学研究中可以代表整个基因组。 2 、全部供试材料的m a t K - t r n K 序列双向测序拼接结果显示，m a t K - t r n K 序列 有效长度为4 2 7 b p ，有效多态性位点为9 6 个，占2 2 4 8 2 4 。据之构建的系统发 育树表明，所有供试材料明显分为2 个大簇，每个大簇又各分为2 个小簇。亚菊 属植物和大部分来自日本的野生菊属植物位于同一大簇，绝大部分观赏菊花位于 此大簇内的一小簇，与之亲缘关系最近的野生近缘种为来自日本的C o c c i d e n t a l i - j a p o n e s ev a t a s h i z u r i e n s e 和Cs h i m o f o m a i ，显示其极有可能是观赏菊 花的母系祖先种。而大部分药用菊花并没有与观赏菊花位于同一小簇，个别品种 甚至位于另一大簇，显示其与观赏菊花不同的母系起源。 3 、相同物种不同供试材料间的关系表明，菊花野生近缘种的叶绿体基因组 存在广泛的种内多样性，尤其是Cv e s t i t u m 和Ci n d i c u m 。部分亚菊属与菊属植 物的叶绿体基因组亲缘关系非常近，甚至近于菊属植物之间的亲缘关系，因此其 系统学归属还值得讨论。 4 、本试验对部分供试材料核基因组I T S 序列的P C R 扩增产物直接纯化测序 结果表明，菊花及其野生近缘种的I T S 序列存在广泛的致同进化不完全现象，因 此运用核基因组I T S 序列对它们的系统学和栽培菊花起源问题进行研究时情况 变得十分复杂，方法需要重新制订，前人的相关研究结果的准确性也有待进一步 的研究。 一】 基于叶绿体D N A 基因问隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 5 、通过与前人研究成果的对比，发现基于D N A 序列的分子系统学研究结 果与基于基于限制性酶切和P C R 的分子标记研究结果有所差异，而作者支持前 一种方法的结果。 关键词：菊花、野生近缘种、叶绿体D N A 、亲缘关系、分子系统学、起源 2 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 R e s e a r c ho nt h eP h y l o g e n yo fC u l t i v a t e d C h r y s a n t h e m u m a n dW i l dR e l a t i v e sB a s e d o n I n t e r g e n i cS e q u e n c e o fC h l o r o p l a s tD N A A b s t r a c t I nt h i ss t u d y , t h ep h y l o g e n yo f5 3a c c e s s i o n sc o n c e m i n gc h r y s a n t h e m u mc u l t i v a r sa n d w i l dr e l a t i v e sw e r ei n v e s t i g a t e du s i n gs e v e r a li n t e r g e n i cs e q u e n c eo fc h l o r o p l a s tD N A w h i c h h a d b e e nw i d e l ya p p l i e di n p r e v i o u sr e s e a r c h e s P h y l o g e n i c 臼陀e s w e r e s t r u c t u r e di na na t t e m p tt Os t u d yt h i sp r o b l e ma n dt h eo r i g i no fc u l t i v a r s B o t hr e s u l t s i nt h i s s t u d ya n dp r e v i o u sr e s e a r c h e sw e r ec o m p a r e d T h er e l i a b i l i t yo fm o l e c u l a r p h y l o g e n ym e t h o d sb a s e do nD N As e q u e n c e sw a sa l s ot e s t e d T h ea c c e s s i o n si nt h i st h e s i si n c l u d e d2 7g e r m p l a s m so f2 6c h r y s a n t h e m u mc u l t i v a r s ， a n d2 6g e r m p l a s m so f16w i l dr e l a t i v e s T h em a i nr e s u l t sa r e ： 1 m a t K - t r n Ks e q u e n c eh a dt h eh i g h e s tp o l y m o r p h i s m ，w h i c hm e a n ti tw a st h e m o s ta p p r o p r i a t eo n ef o rc o n s t r u c t i n gt h ep h y l o g e n i ct r e eo fc h r y s a n t h e m u ma n dw i l d r e l a t i v e s T h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，a l t h o u g hp o l y m o r p h i s m so fd i f f e r e n tc h l o r o p l a s t D N A s e q u e n c e sv a r i e dw i d e l y , t h ep h y l o g e n i ct r e e sa c c o r d i n gt oe a c hs e q u e n c ew e r e c o n s i s t e n tw i t hf i n d i n g s S oi tc o u l db ec o n c l u d e dt h a ts h o r tf r a g m e n t sc o u l dr e p r e s e n t t h ew h o l eg e n o m ei nm o l e c u l a rp h y l o g e n yr e s e a r c h 2 T h es t i t c h e db i d i r e c t i o n a ls e q u e n c i n gr e s u l t so fa l la c c e s s i o n s m a t K - t r n K s e q u e n c ed i s p l a y e d9 6p o l y m o r p h i cl o c ii n4 7 6e f f e c t i v eb p s ( 2 2 4 8 2 4 ) T h e p h y l o g e n i ct r e er e v e a l e dt h a t ，a l la c c e s s i o n sw e r ec l a s s i f i e di n t o2m a j o rc l u s t e r s ，a n d e a c hc l u s t e rw a sf u r t h e rd i v i d e di n t o2s u bc l u s t e r s A j a n i as p e c i e sa n dam a j o r i t yo f t h eC h r y s a n t h e m u ms p e c i e sf r o mJ a p a no c c u r r e di nt h es a m ec l u s t e r , a n dm o s to f o r n a m e n t a lc h r y s a n t h e m u mc u l t i v a r sa p p e a r e do nas u bc l u s t e ro ft h i sc l u s t e r , a n dC o c c i d e n t a l i - j a p o n e s eV a r a s h i z u r i e n s ea n dCs h i m o f o m a is h o w e dt h ec l o s e s tg e n e t i c r e l a t i o n s h i pw i t ht h e m ，i n d i c a t i n gt h e s et w os p e c i e sw e r em o s tl i k e l yt h e i rm a t e r n a l a n c e s t o r H o w e v e rm o s to ft h em e d i c i n a lc h r y s a n t h e m u mc u l t i v a r sw e r e n tt o g e t h e r w i t ht h e m ，a n do n em e d i c i n a lc u l t i v a rw a se v e ni na n o t h e rm a j o rc l u s t e r , r e v e a l i n g t h a tm e d i c i n a lc u l t i v a r sh a dd i f f e r e n tm a t e m a la n c e s t o rw i t ho m a m e n t a lo n e s 一3 一 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 3 R e l a t i o n s h i p sb e t w e e n a c c e s s i o n so ft h es a m es p e c i e ss u g g e s t e dt h a t ， i n t r a s p e c i f i cd i v e r s i t y o fc h l o r o p l a s t g e n o m e e x i s t e di naw i d e r a n g eo f c h r y s a n t h e m u mc u l t i v a r sa n dw i l dr e l a t i v e s ，e s p e c i a l l yCv e s t i t u ma n dCi n d i c u m F o rs o m eA j a n i aa n dC h r y s a n t h e m u ms p e c i e s ，t h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i p so fc h l o r o p l a s t g e n o m e sb e t w e e nt h e mw e r ev e r yc l o s e ，e v e nc l o s e rt h a nb e t w e e nC h r y s a n t h e m u m s p e c i e s S ot h e i rp h y l o g e n yw a sw o r t h yo fi n v e s t i g a t i n g 。 4 I n c o m p l e t e c o n c e r t e de v o l u t i o nW a sf o u n di nI T S s e q u e n c e s o f c h r y s a n t h e m u mc u l t i v a r sa n dw i l dr e l a t i v e sb yp u r i f y i n ga n ds e q u e n c i n gt h eP C R p r o d u c t so fs o m ea c c e s s i o n s ，S Os t u d y i n gp h y l o g e n yo ft h e ma n do r i g i no fc u l t i v a t e d c h r y s a n t h e m u ma d o p t i n gI T Ss e q u e n c eo fn u c l e a rg e n o m ew a sq u i t ec o m p l i c a t e da n d t h em e t h o dn e e d e dt ob ev a l i d a t e d T h u st h er e l i a b i l i t yo ft h ep r e v i o u sr e s u l t sh a dy e t t ob ev e r i f i e d 5 B yc o m p a r i n gt h er e s u l t sw i t hp r e v i o u ss t u d i e s ，d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h er e s u l U o fm o l e c u l a rp h y l o g e n yb a s e do nD N A s e q u e n c ea n do fm o l e c u l a rm a r k e r sb a s e do n P C R b a s e dr e s t r i c t i o ne n z y m ew e r ef o u n d ，a n dt h ea u t h o rs t a n d e db yt h ef o r m e r K e y w o r d s ：C u l t i v a t e dc h r y s a n t h e m u m ，W i l dr e l a t i v e s ，C h l o r o p l a s tg e n o m e ， G e n e t i cr e l a t i o n s h i p ，M o l e c u l a rp h y l o g e n y , O r i g i n 4 一 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 1 I 引言 1 前言 菊花( C h r y s a n t h e m u m m o r i f o r l i u mR a m a t ) 隶属于菊科菊属，是中国的十 大传统名花之一。先秦时期，菊写作鞠。宋代陆佃埤雅云：“菊，本作鞠。 蕲从鞠，鞠穷也。月令九月，菊有黄华，华事至此而穷尽，故谓之鞠。”最早关 于菊花的文字记载见于春秋时期，尔雅中就记有“鞠，治蔷”。礼记月令 中，有“季秋之月，鞠有黄华”( 黄华即黄花) 的记载。山海经亦说：“女儿 之山，在今河南宜阳，其草多菊。”战国时，爱国诗人屈原的楚辞离骚中， 有“春兰兮秋菊，长无绝兮终古”、“朝饮木兰之坠露兮，夕餐秋菊之落英 之名 句。这都充分说明了我们的先民早在几千年前就注意到了菊，并以之做为物候的 一个标志。不过，那时所指的菊还是开黄色小花的菊属野生种，如野菊( C i n d i c u m ) 等。 菊花被引入人工栽培的最初目的在于食用和药用。汉代神农本草经就有 记载：“菊花久服利血气、轻身、耐老延年”。西京杂记中也写到“菊花舒时， 并采茎叶，杂黍米酿之，至来年九月九日始熟，就饮焉，故谓之菊花酒。“蜀人 多种菊，以南可入莱，花可入药，园圃悉植之，郊野火采野菊供药肆。”由此可 见那时的人们就已经在大规模地种植菊花了。此后药菊不断发展，形成了很多地 方品种，产河南者称怀菊，产安徽者称滁菊或亳菊，产浙江者称杭菊，产四川者 称川菊。药菊秋季花开时采收，烘干或蒸、晒干用；亦可用鲜品。 随着人们对菊花喜爱的加深，菊花又以其顽强的生命力和耐寒傲霜，不与群 芳争艳的节气引起了文人的注意，被引入观赏( 毛静等，2 0 0 6 ) 。晋朝陶渊明( 3 5 5 - 4 1 7 年) 爱菊成癖，曾广为流传，他所欣赏之“九华菊 恐怕是有据可考的最早 观赏菊了。他写过不少咏菊诗句，如“采菊东篱下，悠然见南山 ；“秋菊有佳色， 更露摄其英 等名旬，至今仍脍炙人口。当时上大夫慕其高风亮节，亦多种菊自 赏，并夸赞菊花是“芳熏百草，色艳群英”。 到了唐宋时期，观赏菊花已经很普遍，并且出现了白色和紫色的品种，如李 商隐诗：“暗暗淡淡紫，融融冶治黄”；自居易诗：“满园花菊郁金黄，中有孤丛 色似霜”等就是明证。这一时期还出现了最早记载观赏菊花的专著刘蒙的菊 谱( 1 1 0 4 年) 。也是在这一时期，中国的菊花向东经朝鲜传入日本( P e g u g ，1 9 6 6 ； R a n d a l l ，1 9 8 3 ，汤忠皓，1 9 8 6 ；陈俊愉，1 9 9 0 ；S p a a r g a r e n ，2 0 0 2 ) 。 明清时期，观赏菊花十分繁荣，出现了越来越多的菊花专著，如陆延灿艺 一S 一 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 菊志、闽延楷养菊法、徐京艺菊简易等等，并且菊花还随着东西方文化 的交流传播到欧美等广大地区( 陈俊愉，2 0 0 5 ) 。至此，菊花广布世界各地，深 受各族人民的喜爱( A n d e r s o n , 2 0 0 6 ) 。在不同的地区，当地人民不断对菊花进行 选育和杂交，新的种质不断涌现，又随着世界经济文化大交流互相渗透，形成了 极其丰富的品种资源，成为令人赞叹的园艺史奇观( 王彩云，2 0 0 5 ) 。菊花目前 已成为世界四大切花之一，具有很高的经济和观赏价值，在日本、荷兰和美国等 国家的花卉产业中占有重要地位( A n d e r s o n ，2 0 0 4 ，2 0 0 6 ) 。 但这里留下了一个历史疑问：栽培菊花到底何时以何种方式起源? 从其拉丁 学名C h r y s a n t h e m u m m o r i f o r l i u m 上看，菊花是一个完全由人工培育创造出来的 物种，因为没有一个已知野生种的拉丁学名与之相同，并且栽培菊花的表型性状 又和菊属其他野生种之间差异巨大。虽然可以肯定栽培菊花是由人工培育创造， 但历代古籍中对此并没有留下完整的记载，同时又没有化石证据可以参考，因此 栽培菊花的起源显得神秘莫测，成为一个值得科学家研究物种起源进化的特殊材 料( 周杰，2 0 0 9 ) 。同时随着研究的深入，与栽培菊花相关的其他野生近缘种的 亲缘关系和进化关系也越来越受到人们的关注。栽培菊花的同属近缘物种有4 0 余种，主要分布在中国、日本、朝鲜和俄罗斯，其中中国有1 7 种( 林镕等，1 9 8 3 ) ， 是菊属种质资源的分布中心( 戴思兰，2 0 0 4 1 李辛雷等，2 0 0 4 b ) 。有学者通过对 许多研究资料的分析，提出菊属植物的系统进化式样是高度网状结构的，而栽培 菊花的起源问题在这样的复杂系统进化背景下也愈发显得扑朔迷离( 戴思兰， 2 0 0 2 ) 。 1 2 菊属植物系统学与菊花起源研究进展 自上世纪五十年代起，中外学者便陆续采用各种方法对菊属植物的亲缘关 系、栽培菊花的亲本、起源地、形成方式等做了很多研究，至今在某些方面已经 达成了共识，但由于菊属植物间的亲缘关系非常复杂，不同的方法常常不能取得 完全一致的结果，栽培菊花的起源问题也尚未有定论，主要争论存在于单种起源 说与杂种起源说之间，以及参与起源的亲本等( F u k a i ，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 基于形态学的研究 1 2 1 1 比较形态学和数量分类研究 长期以来，植物系统学的分类标准都是以形态学特征为最终标准的，特别是 花和果实这种相对保守的特征，形态学标记的方法也是系统学研究的最基本方 一6 基于叶绿体D N A 摹冈间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 法，这是因为形态学性状( 表型) 是最容易观察和测定的性状，而且通常具有适 应意义和进化意义( 戴思兰，2 0 0 2 ) 。 戴思兰( 1 9 9 4 ) 对中国境内的各种野生菊属植物和一些人工杂种及栽培菊花 品种的表型进行了比较，详细研究了其形态演化趋势，并运用数量分类学方法对 其中2 8 个分类单位的系统进化与亲缘关系进行了研究，结果表明菊属植物的性 状之间相关性不强，性状分布比较分散，说明菊属植物形态学性状的变异在相当 程度上是独立的。其Q 型聚类结果表明：毛华菊( Cv e s t i t u m ) 与栽培菊花亲缘 关系最近，野菊( Ci n d i c u m ) 次之，紫花野菊( Cz a w a d s k i i ) 和小红菊( C c h a n e t i i ) 则与栽培菊花亲缘关系较远。戴思兰和陈俊愉( 1 9 9 7 ) 运用分支分类 方法的研究也支持上述结论，并揭示出毛华菊( Cv e s t i t u m ) 和栽培菊花的进化 程度较高，还发现了不同性状在品种中平行进化的现象。 于丽杰等( 1 9 9 5 ) 利用光镜和扫描电镜对中国东北地区的菊属9 个种和变种， 包括野菊( Ci n d i c u m ) 、葫芦岛野菊( Ci n d i c u mv a r h u l u d o e n s & ) 、小红菊( C c h a n e H i ) 、楔叶菊( Cn a k t o n g e n s e ) 、甘菊( Cl a v a n d u l i f o l i u m ) 、甘野菊( C l a v a n d u l i f o l i u mv a r s e t & u s p e ) 、紫花野菊( Cz a w a d s k i i ) 、小山菊( Co r e a s t r u m ) 和细叶菊( Cm a x i m o w i c z i i ) 的叶表面特征进行了观察研究，发现这些类群的表 皮细胞、气孔复合体和毛状体等方面存在着一些差异，并依据这些特征讨论了一 些类群的亲缘关系，尝试性地编制了类群检索表。 但用形态学标记去推测具有不同基因型的分类群之间的系统进化关系，这样 的方法缺陷也很明显。最主要的问题有两个：一是在不同的环境条件下，即使相 同的基因型也可能会表现出不同的形态学性状( 环境饰变) ；二是形态学性状的 差异并不能全面地反映出基因型的差异( 戴思兰，2 0 0 2 ) 。这些问题令这种方法 的说服力显得有所不足。 1 2 1 2 种问杂交研究 菊属植物是一个种间隔离机制不十分完全的类群( 张莉俊，2 0 0 9 ) ，在自然 界中即存在着广泛的天然种间杂交现象( S o r e n g ，1 9 9 1 ) ，这也成为栽培菊花杂 交起源说的理论基础。为了验证这一假说，陈俊愉带领研究团队做了大量的工作， 尝试以人工杂交的方法在短时间内再现历史上栽培菊花起源和进化的过程。 陈俊愉团队的研究始于1 9 6 1 年，最早用尖叶野菊( Ci n d i c u mv a t a c u t u m ) 与扎菊( 小红菊，Cc h a n 鲥i i ) 人工杂交，首次获得了三株能够正常开花的植株， 形态上与栽培品种滁菊和五九菊非常相似，出现了白色、大花、复瓣等 明显的栽培菊花性状，同陶渊明笔下的九华菊也相当接近，后来经植物学家 认证被命名为新品种北京菊。8 0 年代初，陈俊愉等又用野菊( Ci n d i c u m ) 和紫花野菊( Cz a w a d s k i i ) 杂交，获得的杂种苗具有中间性状，其花、叶等性 7 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 状与北京菊相似( C h e nJ u n y u ，1 9 8 5 ) 。吉庆萍( 1 9 8 7 ) 用毛华菊( Cv e s t i t u m ) 、 野菊( C i n d i c u m ) 和紫花野菊( Cz a w a d s k i i ) 作为亲本杂交也获得了一些种间 杂种，其中一些植株的形态，尤其是叶的质地非常接近栽培菊花。戴思兰( 1 9 9 6 ) 对在引种地花期重叠的7 种野生菊属植物进行了杂交实验，并采用了正交设计。 其结果显示：染色体数目相同或相近的材料之间杂交成功率较高，而随着倍性差 异的增大，杂交难度加大。后人的研究也得出了相同的结论( 李辛雷，2 0 0 4 a ) 。 该研究还发现在杂种F l 代中的性状变异是多方向的，尤其以毛华菊( Cv e s t i t u m ) 为亲本的子代变异最为明显，其次是野菊( Ci n d i c u m ) 而紫花野菊( Cz a w a d s k i i ) 和甘野菊( Cl a v a n d u l i f o l i u mv a r s e t i c u s p e ) 的子代变异较少，因此得出结论， 说明上述前3 个种在栽培菊花的杂交起源中起重要作用，同时其它近缘种有可能 也参与了这个过程。值得注意的是，在众多的杂种后代中出现了匙形舌片、中盘 花舌状化、重瓣化等花部的形态变异，而这些都是非常典型的栽培菊花性状。这 些种间杂交的结果大大增强了人们重现栽培菊花起源进化过程的信心。 但基于形态学性状的种间杂交方法同比较形态学方法一样，也面临着形态学 研究所无法避免的问题，并且由于菊属植物天然杂交的可能性很大，栽培菊花的 一些性状种质可能早已渗入野生种，现代的野生种质已经不再纯净，因此野生种 杂交出现的性状分离也不能简单地认为就是历史重现。这也是种间杂交方法未能 解决争议的原因。 1 2 2 基于细胞学的研究 细胞学标记主要是指对生物细胞内染色体形态和数目进行分析( 张传军等， 2 0 0 6 ) 。染色体是遗传物质的载体。作为基因的携带者，染色体变异是生物进化 的重要途径，主要包括染色体数目变异( 整倍性和非整倍性) 和染色体结构变异 ( 倒位、缺失、重复和易位等) 。因此，通过观察和比较生物细胞的染色体核型 特征，可以分析出物种间的系统进化关系和亲缘关系。 许多学者的细胞学研究表明，多倍体物种占菊属植物的大多数( F e d o r o f ， 1 9 7 4 ) ，野生种染色体数多为以9 为基数的2 n = 2 x = 1 8 、2 n = 4 x = 3 6 和2 n = 6 x = 5 4 ( 李 懋学等，1 9 8 3 ；汪劲武等，1 9 9 1 ；陈发棣等，1 9 9 6 ，1 9 9 8 ；周树军等，1 9 9 7 ) ， 证实了多倍体化在菊属植物系统进化中所起的重要作用( F e d o r o v ，1 9 6 9 ) 。而在 栽培菊花中，还存在着大量以六倍体为基础的非整倍体变异，染色体数基本处于 2 n = 5 4 至2 n = 9 0 之间( 李懋学等，1 9 8 3 ；戴思兰，1 9 9 4 ) 。 染色体原位杂交技术( G I S H ) 的兴起为细胞学研究提供了极大的便利。王 文奎( 2 0 0 0 ) 根据运用此技术的研究结果提出栽培菊花的起源是一个异源多倍化 8 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 的过程，毛华菊( Cv e s t i t u m ) 在栽培菊花的起源过程中贡献最大，其次是野菊 ( Ci n d i c u m ) 、菊花脑( Cn a n k i n g e n s e ) 和甘野菊( Cl a v a n d u l i f o l i u mv a t s e t i c u s p e ) ，而紫花野菊( Cz a w a d s k i i ) 不大可能参与栽培菊花的起源，应该是 较晚的时候才参与到栽培菊花品种演化过程中的。并且该研究还发现了菊属植物 间存在广泛的种质渗透现象，不同物种基因组间的同源性很高。E 1 T w a b 等( 2 0 0 1 ) 在进行G I S H 分析时，无法将Cb o r e a l e 、Cc h a n e t i i 、Ci n d i e u m 、Cj a p o n f c u m 、 CI a v a n d u l i f o l i u m 、Cj a p o n e n s e 、Cy o s h i n a g a n t h u m 和Cz a w a s k i f 的基因组区分 开，也证实了这一结果。这或许也是菊属植物存在广泛天然种间杂交现象的细胞 学基础。 但基于细胞学标记的研究也存在很大的局限性。其最大的问题就在于标记数 量太少，如上文所述，在研究亲缘关系很近的复杂进化关系时便力不从心。 1 2 3 基于同功酶的研究 同工酶是一系列由同一基因位点不同等位基因编码的，催化同一底物生化反 应的蛋白质分子，属单显性基因控制，在植物器官中普遍存在。不同物种的同工 酶虽然功能相同，但具有不同的结构，2 0 世纪6 0 年代开始被作为遗传标记分析 物种亲缘关系和进化关系( 陈家宽，1 9 9 4 ；王中仁，1 9 9 6 ) 。同工酶标记所需材 料少，呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律，在物种遗传多样性和起源进化等领 域有着广泛的应用( T a n k s i e y ，1 9 8 3 ) 。有学者对菊属野生种和栽培菊花品种群的 同工酶进行了分析后发现，在同工酶水平上菊属野生种和栽培菊花品种群的酶谱 谱带变异十分广泛，以之为依据的许多聚类结果也与形态学标记所得到的结果一 致( 陈云志等，1 9 8 9 ；赵燕等1 9 9 6 ) 。 同工酶标记的主要缺点在于能利用的酶种类有限，只能覆盖基因组很小一部 分，并且无法检测到不影响蛋白质结构的同义突变，因此会低估遗传变异。这些 缺陷限制了同工酶标记的使用( 沈法富等，1 9 9 7 ) 。 1 2 4 基于限制性酶切和P C R 技术的D N A 分子标记研究 随着分子生物学的发展，在系统学研究中，人们得以对生物的遗传物质 _ D N A 进行直接的检测。以D N A 为基础的遗传多态性检测可以直接比较核苷 酸的变异，是物种亲缘关系和遗传多样性研究强有力的工具。和前文所述的遗传 标记方法相比，D N A 分子标记优越性非常明显：( 1 ) 直接以D N A 的形式表现， 不受植物组织和发育时期的影响，更不受季节和环境的限制；( 2 ) 数量极多，并 一9 基于叶绿体D N A 基因间隔序列的菊花与近缘种亲缘关系研究 且遍布整个基因组，可以对全基因组进行检测；( 3 ) 多态性高，有的方法甚至可 以分析品种间的微小差异；( 4 ) 与基因表达无关，表现为遗传“中性 ；( 5 ) 遗 传特性为共显性，某些情况下可以辨别物种的纯合状态和杂合状态( 贾继增， 1 9 9 6 ) 。限制性酶切技术和P C R 技术兴起后，人们据此发展出了多种D N A 分子 标记方法，并且利用它获得了大量物种的遗传信息，栽培菊花也不例外，本文拟 简要介绍如下： 1 2 4 1R F L P 研究 限制性内切酶酶切片段长度多态性( R e s t r i c t i o nF r a g m e n tL e n g t h P o l y m o r p h i s m ，简称R F L P ) 诞生于2 0 世纪8 0 年代，是以D N A 序列变异为基 础，研究物种间基因组差异的一项分子标记技术( E v o l a 等，1 9 8 6 ) 。K i s h i m o t o 等( 1 9 9 9 ) 运用以该技术为基础的P