SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选霉变烟叶特异性标志蛋白.doc

目录摘要2前言2l 材料与方法41.1 样品采集41.2仪器与试剂41.3 试剂的配制41.3.1电泳缓冲液的配制41.3.2样品缓冲液制备41.3.3考马斯亮蓝R-250固定液的配制41.3.4考马斯亮蓝R-250染液的配制41.3.5考马斯亮蓝脱色液的配置41.4烟叶蛋白的提取41.5聚丙烯酰胺凝胶电泳41.6考马斯亮蓝染色52 结果与讨论53 展望6致谢7参考文献7SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选霉变烟叶特异性标志蛋白摘要：为了找出霉变烟叶里的特异性标记，我们采集了75个霉变烟叶样品，以及11个正常烟叶样品作为对照。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以检测和分析出不同的蛋白带型。正常烟叶的特异性标志蛋白已经被鉴定出来（相对分子质量大约为20Da）。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选霉变烟叶里的特异性标志蛋白，找出了霉变烟叶和正常烟叶里的蛋白质指纹差异，为建立快速、精确的烟叶霉变检测方法提供了先决条件。关键词：霉变烟叶；蛋白指纹；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Screen for Specific Biomarker in Molded Flue-Cured Tobacco Leaves by SDS - Polyacrylamide Gel ElectrophoresisAbstract: To screen relatively specifically markers in molded flue-cured tobacco leaves (FCTL), 75 samples of molded FCTL were collected and an additional 11 samples of unmolded FCTL were used as controls. The protein profiles were detected and analyzed by SDS - polyacrylamide gel electrophoresis. A FCTL-specific biomarker (relative molecular weight is 20Da) was identified. The pattern of the marker provides a powerful and reliable diagnostic method for molded FCTL with high sensitivity and specificity.Key words: Molded flue-cured tobacco leaves; Fingerprints; SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis前言烟草是以收获叶片为主的重要经济作物，烟叶的自然醇化或人工发酵是提高烟叶燃吸品质和可用性的重要环节之一。烟叶自然醇化贮藏周期长，由于烟叶吸湿性强，而烟叶中又含有微生物生长所需要的各种营养物质，一旦条件适宜，烟叶在贮藏过程中极易滋生各种微生物而发生霉变。中国烟草仓储面积达700万m2。在烟叶仓储损耗中，烟叶霉变造成的损失十分严重，影响烟叶的外观品质和香味品质，降低烟叶的使用价值，尤其南方烟区烟叶霉变甚至成为影响企业经济效益的重要因素1。除了经济上的需要外，还有另一个重要原因，那就是：烟叶的微生物污染应被控制在最少量4。众所周知，许多真菌毒素对人体有毒性，如黄曲霉素，是目前发现最强的化学致癌物质，同时具有致畸和致突变作用，而这类真菌又往往是诱发烟叶霉变的生物因子。微生物分解利用烟叶中蛋白质时，先分泌蛋白酶到细胞外，将蛋白质水解成为短肽后再透入细胞，细胞内的肽酶进而将肽水解成氨基酸。在霉变烟叶中，会出现烟叶的蛋白质氮减少，而非蛋白质氮增加的现象，在通常情况下，霉变烟叶的总氮不会减少，有时反而会增加 ，这主要是由于微生物大量繁殖所形成的物质转化的结果2。氨基酸除可直接用于微生物自身新蛋白质的合成外，不同的微生物在相应的酶系催化下，也可通过脱氨基作用和脱羧基作用进一步分解，生成很多代谢产物，影响烟叶的品质。如氨、硫化氢、吲哚和类臭素等物质可使霉变的烟叶腐败发臭；由于产生的有机酸的积累，可使烟叶酸度增高；微生物分解氨基酸的另一些产物，如硫醇类等黄色物质，能使烟叶发褐变色，促进褐变反应 ，使烟叶失去原有色泽；二元氨基酸经脱羧后，能生成二元胺，如腐胺、尸胺、精胺以及色胺、酪胺和组胺等，不仅使烟叶发出恶臭，还会使烟叶及其制品带毒，严重影响食用卫生4。在烟叶储藏中，可以根据烟叶霉变的生物化学和微生物学原理，判断烟叶的稳定性，评价烟叶品质，及时设计对策，控制烟叶环境，抑制微生物在粮食上的代谢活动，有效地保护烟叶安全。随着吸烟与健康问题越来越受到人们的重视，防止烟叶霉变将成为卷烟生产上必须解决的重要课题2。经过研究，造成烟叶霉变的原因有很多，有内因，也有外因概括起来主要有以下几点：病原微生物的影响 烟叶含有适宜微生生长物的营养物质 温度与湿度的影响 烟叶成熟度和包装材料的影响14。微生物在烟叶及其制品上活动危害时，并不能直接吸收烟叶中的各种复杂的营养物质，必须依靠其分泌的胞外酶，在细胞外将烟叶中大分子物质(淀粉、纤维素、蛋白质和脂肪等)水解为可溶性的低分子物质 ，才能吸收到细胞内加以利用，这是微生物进行营养的基本特点4。所以，烟叶霉变过程，就是微生物分解和利用烟叶中有机物质的生物化学过程，实质上就是微生物以烟叶为营养基质 ，进行消化、吸收和利用的营养过程 ，这个过程包括了微生物进行物质代谢和能量代谢的生物化学反应3。微生物的物质代谢，包括分解代谢和合成代谢两个方面。前者是微生物将烟叶中复杂的有机物质，先在细胞外分解为低分子化合物，然后吸收，再在细胞内氧化分解 ，获得营养、转化和释放能量的过程；后者则是微生物利用储存能量，以低分子的中间代谢物质为原料，合成新的细胞物质的过程。因此，微生物在烟叶上的代谢活动，保证了微生物自身的生长、发育和大量繁殖，其结果反映在烟叶上，便是霉变的发生和发展。由此可见，烟叶霉变的生物学基础是微生物与环境所进行的物质交换和能量转化10。生物功能的主要体现者是蛋白质，复杂的基因间和蛋白质的相互作用，细胞内的活动和黄静影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译后加工8。蛋白质作为一个空间和时间上动态的整体，各个蛋白质之间的相互作用，机密而有序地连接在一起，形成多个子系统，实现特定的生理功能5。从基因水平到蛋白质水平的深化，已成为生命科学研究的迫切需要和新的任务。利用电泳技术检测植物蛋白质的异质性 ,并以此作为分类、进化和遗传研究的依据 ,早已得到广泛的应用7，15。蛋白质作为基因的直接稳定产物 ,能反映生物组成上的差异。因此我们想到通过筛选霉变烟叶异性标志蛋白，可以为建立烟叶霉变检测方法奠定基础9。本文利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法来筛选霉变烟叶异性标志蛋白。l 材料与方法1.1 样品采集 仓储霉变烟叶75个和正常烟叶11个由昆明卷烟厂提供。1.2仪器与试剂 DYY-10型电泳仪，SIGMA13高速离心机，奥豪斯2140电子天平，脱色摇床，琼脂糖，40%丙烯酰胺，甘油， Tris-Cl，SDS，过硫酸铵，TEMED，正丁醇，溴芬兰，考马斯亮蓝R-250，冰醋酸，甲醇，亚甲双丙烯酰胺，蒸馏水. 1.3 试剂的配制1.3.1电泳缓冲液的配制：Tris碱3g，甘氨酸14.4g，SDS1g，加蒸馏水至1L，pH8.3，冰箱里备用.1.3.2样品缓冲液制备：1mol/L Tris-HCl 0.6ml，加入50%甘油5ml，10%SDS2ml，2巯基-乙醇0.5ml，1%溴芬兰1ml，蒸馏水0.9ml，4冰箱中存放备用.1.3.3考马斯亮蓝R-250固定液的配制：取400ml乙醇、100ml冰醋酸、500ml水.1.3.4考马斯亮蓝R-250染液的配制：取0.04g考马斯亮蓝R-250，甲醇18ml，蒸馏水18ml，冰醋酸4ml.1.3.5考马斯亮蓝脱色液的配置： 取400ml甲醇、100ml冰醋酸、500ml水.1.4烟叶蛋白的提取 将混合后的正常烟叶和霉变烟用液氮充分研磨，各称取 50 mg ，加入200ul样品缓冲液后置于 Eppendoff 管中，沸水浴中保温 10min,10000 r/min 离心 10 min，所得上清即是样品蛋白，- 20 冰箱贮存备用。1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.5.1将电泳槽玻璃板洗净烘干，然后放于胶条凹槽中，后固定到电泳槽夹板中，将低的玻璃板面向黑色负极，按对角线上紧螺丝。将通电泳缓冲液的孔用乳胶塞塞上，取冷却未凝的0.8%琼脂糖液70ml倒于玻板和电泳槽的两个电缓槽中，靠近负极的的一侧加40ml左右，室温冷凝，保证将玻板封严而不漏胶。1.5.2取40%丙烯酰胺 5.00ml，pH8.8的4XTriscl/SDS5.00ml, H2O 10.0ml，10%过硫酸铵70l，TEMED15l浓度的分离胶。1.5.3用注射器将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入玻璃板夹层中，至离低玻板3cm处。用另一注射器顺着玻璃顶部缓慢加入正丁醇2cm高。室温聚合3060min。1.5.4倾去正丁醇，并以1XTriscl/SDS,pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面。用滤纸吸干表面水分。1.4.5按顺序配积层胶（4%浓度）：混匀0.65ml30%丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙烯酰胺溶液，1.25mlpH6.8的4Xtris-Cl/SDS缓冲液和3.05ml水，真空下脱气1015min，加入25 l10%过硫酸铵和5l TEMED,摇匀，立即使用，注射器加到离顶部5mm处将厚度与夹层厚度一致的梳子插入其中，补充剩余空隙，室温凝3045min。1.5.5在1.5ml离心管中处理蛋白质，处理MarK方法：100沸水5分钟，冰浴5分钟，13000rpm离心两分钟。其他蛋白处理方法：100沸水20分钟，其他同上。1.5.6待胶凝后，向电泳槽中倒1XSDS电泳缓冲液，一边没过低玻璃斑上沿，一边没过泳槽一半的金属丝，浸泡几分钟后小心拔出梳子，用注射器吹洗胶孔几次，通低电压几分钟后断电。1.5.7、用枪加入样品蛋白5l，恒压电泳，积层胶用85V，当溴芬兰指示剂过了分离胶界面时电压调为150V。耗时34.5h。1.5.8将冷凝管接好通水保持胶的稳定，当溴芬兰至胶低0.5cm处关电源，撤导线和水管，弃去电泳缓冲液，将电泳夹层取出。标记凝胶，用刀片将凝胶与玻璃边沿处划一两次，保护胶的脱离。1.6考马斯亮蓝染色1.6.1凝胶的固定液中轻微摇荡1小时1.6.2凝胶在染色液中摇荡过夜.1.6.3胶在脱色液中摇荡过夜消除背景.1.6.3用洗脱液洗脱至背景无色后,用扫描仪采集电泳图.2 结果与讨论微生物在烟叶及其制品上活动危害时，并不能直接吸收烟叶中的各种复杂的营养物质，必须依靠其分泌的胞外酶，在细胞外将烟叶中大分子物质(淀粉、纤维素、蛋白质和脂肪等)水解为可溶性的低分子物质 ，才能吸收到细胞内加以利用，这是微生物进行营养的基本特点。一般情况下的霉变烟叶中，会出现烟叶的蛋白质氮减少，而非蛋白质氮增加的现象。本试验中霉变烟叶里出现的特异性蛋白，很可能是大量繁殖的微生物的自身蛋白。微生物在烟叶上的代谢活动，保证了微生物 自身的生长、发育和大量繁殖，其结果反映在烟叶上，便是霉变的发生和发展。图1 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果120(kda)8647342620 正常烟叶 霉变烟叶由图1可知,霉变烟叶中出现了蛋白分子量约为20kda的蛋白条带，而在正常烟叶中则没有出现这样的特异蛋白。因此我们可以通过进一步筛选霉变烟叶异性标志蛋白，检测引起烟叶霉变的微生物类群。此外,霉变和正常这两种不同样品间的蛋白除一段差异蛋白点外,在87kda120kda附近有相似蛋白系列，为烟叶本身的蛋白组系列。通过总蛋白一维电泳指纹图谱分析完全可以区分霉变和正常烟叶，对于差异性蛋白点和相匹配蛋白点可以给出明确的判定。3 展望蛋白质氨基酸鉴定上的应用已经应用于中医药界药品的检验,疾病的快速检验，食物过敏原的快速检测、分析和鉴定等等,结果证明以聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质指纹图谱鉴定不同试验样品的总蛋白确实可行,而且检测分析结果在不同实验仪器和耗材之间具有良好的重现性和稳定性,这对建立快速、精确的烟叶霉变检测方法提供了良好的基础。我们有理由相信，利用筛选霉变烟叶特异性标志蛋白，很有可能够找到快速、精确的烟叶霉变检测方法。接下来，我们要探讨更进一步地分离纯化蛋白质，用更精确的蛋白质分离技术分离霉变烟叶中的蛋白质，对比微生物的蛋白图谱，从而找出霉变烟叶中微生物中的类型。致谢在毕业论文过程当中，我得到了很多老师和同学的关怀和帮助。在此论文完成之际，我要向他们表示我最真诚的谢意。首先我要感谢我的指导老师李文鹏老师。感谢李老师让我承担这个研究课题，并在实验中给与我悉心的指导和支持，教给我科研的方法，在实验过后悉心指导毕业论文的写作。正是在李老师的帮助下我才能顺利完成毕业论文。我要感谢周海军、王建雄、李金龙和徐晓川同学，他们在实验中给我很大的帮助和启发。感谢同宿舍同学在我实验不顺利时给我的支持和鼓励。论文的完成和他们也是分不开的，在此我向他们一并表示最衷心的感谢！参考文献:1 黄福新,周兴华,朱桂宁,晏卫红,等.广西烟仓霉变发生状况调查及主要霉变因素J. 2007，4：4114142连宾,烟叶霉变及防治J. 贵州科学1998，6：124127.3周建新,论粮食霉变中的生物化学，南京经济学院食品科学与工程系.2004：1911.4李梅云,高家合,王革,微生物对烟叶蛋白质含量的影响J.生物技术通报，2006.增刊：3763805吴海强,余晓,刘志刚,食品过敏原指纹图谱快速检测研究J.热带医学杂志，2006,02：1311346吴莉莉,林爱英,郑宝周,电子鼻检测技术在粮食霉变识别中的应用研究J.安徽农业科学，2009,37(21)：10133101357高德民,5个生姜品种的蛋白电泳指纹图谱研究J.中国野生植物资源, 2009, 28（4）：51