桃果实冷害相关FAD基因家族的表达调控-硕士论文

分类号：s 鳋 单位代码：Q 3 三5 学号：2 0 8 1 6 0 4 8 洳：j 、 硕士学位论文 中文论文题目：挑墨塞垒室担羞F A D 差一i 。i 。i 篁 圃控 英文论文题目：R e g u l a t i o na n de x p r g s 墨i o no fC h i l l i n gI n i u r vR e l a t e d F A DG e ne si nP e a c hF r u i t 申请人姓名： 魏雯鐾 指导教师： 盆昌盔教授 韭达副数控 专业名称：墨挝堂 研究方向： 墨塞墨厦及苤厦金壬生理 所在学院： 盛些生生物技本堂瞳 中国杭州 f 删炒黜 7 ，l 。I 。芍5 19 z o 单位代码：! Q 兰兰 桃果实冷害相关F A D 基因家族的表达调控 答辩委员会主席：隆童松熬援摄建壅盐太堂 答辩委员会成员：塑丞坐熬援直立壅些太堂 王然教援壹盘壅些太堂 戚短塑熬援浙江省壅些型堂院 吐送堇熬援堑江太堂 论文评阅人：奎鲑副熬援逝江太堂 装瞪基副熬拯浙江太堂 郄4 1 挂熬援浙江王直太堂 论文答辩日期：2 0 1 1 年0 3 月 R e g u l a t i o na n dE x p r e s s i o no fC h i l l i n gI n j u r y R e l a t e d 尉DG e n e si nP e a c hF r u i t B yW e n w e n W e i S u p e r v i s o r s ：P r o f e s s o rC h a n g j i eX u A s s o c i a t e P r o f e s s o rB o Z h a n g Z h e ji a n gU n i v e r s i t y H a n g z h o u ，C h i n a M a r2 0 1 l 本研究受 ， 国家自然科学基金( 3 0 8 0 0 7 39 ) 和 公益性行业( 农业) 科研专项 ( 2 0 0 9 0 30 4 4 ) 资助。 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：“+ 签字日期：枷1 1 年 岁月lJ 日 。j ； 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：运嗽 翩签名：彳善昌生 签字日期：矽1 1 年 乃月 f 1 日 签字日期：厶f 年弓月0 日 致谢 致谢 时光匆匆，如自驹过隙，近三年的硕士研究生生活已接近尾声，回首往昔， 有成功时的喜悦，也有失败时的低沉。三年来，置身浙江大学这所百年名校，在 老师和同学们的帮助和影响下，不仅在专业知识方面收获颇丰，更重要的是认识 了一批高层次的老师和朋友，这些在我今后的生活中将是一笔宝贵的财富。面对 顺利完成的论文，我满怀欣喜，回首求学之路，快乐而艰辛，在硕士生涯即将结 束之际，谨对多年来给予我关心和支持的良师益友和亲人们致以最诚挚的谢意! 本研究及学位论文是在导师组陈昆松教授、徐昌杰教授和张波副教授的亲切 关怀和悉心指导下完成的，从论文的选题、构思、资料的收集到研究方法的确立， 撰写以及成文定稿，都得到了导师们的悉心指导和帮助。陈老师的洞察全局，高 屋建瓴，徐老师严肃的科学态度，严谨的治学精神，张波老师敏锐的思维，精益 求精的工作作风，都深深地感染和激励着我。还记得陈老师在百忙之中抽时间和 我们进行试验结果的讨论，仍记得s e m i n a r 上徐老师对我们读书报告和实验进展 提出宝贵的建议，也记得张波老师陪我们做实验到凌晨。三年来，导师们不仅在 学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨 向他们致以诚挚的谢意和崇高的敬意，希望你们能身体健康，永远年轻，永远幸 福。 在近三年的学习科研生活中，课题组高中山老师、李鲜老师、孙崇德老师、 殷学仁师兄和朱长青师兄对我的生活、学习及科研给予了很多关心和提出了许多 宝贵的意见，在此向他们表示衷心的感谢。 感谢果树科学研究所滕元文教授、刘永立教授、张放教授、贾惠娟教授、郭 延平副教授、柴明良副教授等优秀而负责任的授课教师。 攻读硕士学位期间，实验室的许多同学在我的科研和学习生活上给予了帮 助，借此机会特别感谢殷学仁、单兰兰、张志新、金微微、牛姗姗、王平、张水 明、陈琳、席万鹏、谢让金、陈秋燕，宋肖琴、周京一、刘巍立、李雄伟、杨朝 崴、傅秀敏、张绍阳彭剐，黄玉吉、陈明、梁莉，戴美松，孔文斌、朱晓燕、 罗丰雷、冯超、徐倩、闵婷、马英桃、苏明申、吕强、曾教科、石艳娜、宋松、 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 )致谢 林琼、江倩等果实品质生物学实验室的前辈和同学，感谢0 8 级的张九凯、申济 源、蒋天梅、王伟伟、周剑、邱翠花、陈露露、张鑫、耿芳和赵丹丹等，感谢各 位在学 - - j 、生活和实验中给予我的建议和帮助，陪我度过愉快而充实的三年研究 生生活。 感谢室友蒋天梅、张志仙、凌泽杰、杨慧和吕静，是你们的包容和爱护，关 心和谦让伴我度过了三年美好的研究生生活，谢谢你们! 在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完 成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的 谢意! 最后我还要感谢我的爸爸妈妈，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回 报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们! 感谢参加本论文评阅、答辩和对本论文提出宝贵建议的所有老师和同学! I l 魏雯雯 2 0 11 年3 月于浙大华家池畔 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 ) 缩略语表 英文缩写 1 M C P B F 3 C A D C D N A C D S C e l C 1 A B C I C T R D B I D E P C d N T P s E B E C E D l A E I L e n d o P G E R E S T E x o - P G E X P F A D 缩略语表 A b b r e v i a t i o n 英文全称 l - M e t h y c y c l o p r o p e n e B o r o nT r i f l u o r i d e C o m p l e m e n t a r y D N A C o d i n gS e q u e n c e C e l l u l a s e 中文名称 1 甲基环丙烯 三氟化硼 肉桂醇脱氢酶 互补脱氧核糖核苷酸 编码序列 纤维素酶 H e x a d e c y lT r i m e t h y lA m m o n i u mB r o m i d e 十六烷基三甲基澳化铵 C h i l l i n gI n j u r y 冷害 C o n s t i t u t i v eT r i p l eR e s p o n s e组成型三重反应 D o u b l eB o n dI n d e x 双键指数 D i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 D e o x y r i b o n u c l e i cT r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 E c h i d i u mB r o m i d e E l e c t r i c a lC o n d u c t i v i t y 澳化乙锭 电导率 E t h y l e n eD i a m i n eT e t r a a c e t i cA c i d L - - 胺四乙酸 E I N 3l i k e E I N 3 同源基因 E n d o - P o l y g a l a c t u r o n a s e 内切多聚半乳糖醛酸酶 E n d o p l a s m i cR e t i c u l u m 内质网 表达序列标签 E x o - P o l y g a l a c t u r o n a s e 外切多聚半乳糖醛酸酶 E x p a n s i n 扩张蛋白 F a t t yA c i dD e s a t u r a s e 脂肪酸去饱和酶 I G C H J ， L T C N 2 p C R P E P G Q P C R R A C E R 7 、协 S S C 咒 G a sC h r o m a t o g r a p h y气相色谱分析 H u J i n g M i L u 湖景蜜露 N i t r o g e n P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n 程序降温 氨气 聚合酶链式反应 果胶酶 P o l y g a l a c t u r o n a s e 多聚半乳糖醛酸酶 R e a l - T u n eQ u a n t i a t i v eP C R实时荧光定量P C R R a p i d - A m p l i f i c a t i o no f c D N A e n d s c D N A 末端快速扩增技术 R i b o n u c l e i cA c i d S o l u b l eS o l i dC o n t e n t I V 核糖核酸 可溶性固形物含量 玉露 ， 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 )中文摘要 中文摘要 以桃( t r u n u sp e r s i c aL ) 果实为试材，开展了F A D 基因家族成员的克隆，研 究了不同温度处理对软溶质玉露和湖景蜜露桃果实脂肪酸组分的影响， 及对F A D 基因家族成员表达水平的调控，分析了桃果实冷害发生与F A D 基因家 族成员表达的相关性。具体结果如下： l 、玉露和湖景蜜露桃果实5 1 2 冷藏2 周转至2 0 ( 2 货架2d 出现冷害 症状，表现为果肉组织褐变、少汁，并伴随有电导率显著增加和乙烯释放量下降。 然而两个品种桃果实的硬度变化具有差异，其中玉露在采后低温贮藏的硬度 可正常下降，而湖景蜜露丧失了正常的软化能力。L T C 处理( 8 C 贮藏3d 后转至5 1 2 ) 可有效延缓桃果实冷害发生，并维持良好品质。 2 ，利用气相色谱分析了玉露和湖景蜜露桃果实低温贮藏过程中主要 脂肪酸组分的变化，包括棕榈酸( 1 6 ：0 ) 、硬脂酸( 1 8 ：0 ) 、油酸( 1 8 ：1 ) 、亚 油酸( 1 8 ：2 ) 和亚麻酸( 1 8 ：3 ) 置于5 C 贮藏的玉露桃果实亚油酸含量低 于L T C 处理，而湖景蜜露桃果实中亚麻酸含量较低。L T C 处理的桃果实的 D B I 水平显著高于对照，维持较高水平的生物膜流动性。 3 、利用桃E S T 库克隆到了F A D 基因家族6 个成员，命名为P p F A D l 、P p F A D 2 、 P p F A D 3 、P p F A D 4 、P p F A D 5 和P p F A D 6 ，开放阅读框长度分别为1 1 4 6 b p 、l l l 3 b p 、 1 3 4 7 b p 、1 3 2 3 b p 、1 3 5 9 b p 和1 1 5 2 b p 。生物信息学分析表明，P p F A D 2 、P p F A D 3 、 P p F A D 5 和P p F A D 6 属于C O 一3 类型F A D ，而P p F A D l 和P p F A D 4 则具有C O 6 类 型F A D 活性。 4 、利用实时荧光定量P C R 分析了桃果实F A D 基因家族6 个成员在采后冷藏 过程中表达模式。玉露和湖景蜜露果实在低温冷藏过程中，C O 一3F A D 基 因家族成员P p F A D 2 和P p F A D 6 受低温诱导，转录本含量显著高于采收点； P p F A D 3 基因对低温不敏感，表达水平稳定；P p F A D 5 在5 贮藏的玉露桃果 V 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 )中文摘要 实中表达水平高于L T C 处理的果实，而湖景蜜露中L T C 处理的果实P p F A D 5 基因转录本含量较高。f O 一6 F A D 基因家族成员P p F A D 4 在不同温度处理间的表达 水平相近，且在不同品种表达模式类似；P p F A D l 在不同品种果实中的表达模式 具有差异，玉露果实5 1 2 处理的P p F A D l 的表达水平低于L T C 处理的果实， 而湖景蜜露中则表现出相反的趋势。 本研究利用国际公开的桃E S T 和基因组数据库，开展了F A D 基因家族成员 的克隆- 9 表达分析，初步鉴别了桃果实冷害发生相关的F A D 基因家族成员，玉 露桃果实可能通过增强P p F A D l 的表达提高内质网亚油酸比例从而增强抗冷性， 而湖景蜜露桃果实通过P p F A D 5 的表达在质体中积累亚麻酸减轻果实冷害的发 生。 关键词：桃果实；冷害；程序降温；脂肪酸；脂肪酸去饱和酶 V I 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 )A B S T R A C T A B S T R A C T M e l t i n gp e a c h ( P r u n u sp e r s i c aL C V Wa n d H J M L ) f r u i tw e r eu s e da s m a t e r i a l st Oi n v e s t i g a t ec h a n g e si nf a t t ya c i dc o m p o s i t i o n sa n dF A Dg e n e se x p r e s s i o n i nr e s p o n s et Od i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s R e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 C Is y m p t o m sw e r em a i n l yd e v e l o p e dw i t h i n2w e e k sd u r i n gs t o r a g ea t5 C ， a n de x p r e s s e da sf l e s hb r o w n i n g ，m e a l ya n dw o o l l y ( 1 a c ko fj u i c e ) T h e r ew e r e s i g n i f i c a n th i g h e rl e v e l si I le l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t ya n dr e d u c e de t h y l e n ep r o d u c t i o ni n C If r u i t F r u i tf i r m n e s so f Y L p e a c hd e c l i n e dn o r m a l l yd u r i n gt h el o wt e m p e r a t u r e s t o r a g e ，w h i l e H J M L p e a c hf r u i tm a i n t a i nh i 曲l e v e l L T Ct r e a t m e n ts i g n i f i c a n t l y a l l e v i a t ec h i l l i n gi n j u r yo f p e a c hf r u i ta n dm a i n t a i n e dg o o dq u a l i t y 2 P a l m i t i ca c i d ，s t e a r i ca c i d ，o l e i ca c i d ，l i n o l e i ca c i da n dl i n o l e n i ca c i dw e r ef i v e m a j o rf a t t ya c i d sd e t e c t e di n Y L a n d H J M L p e a c hf r u i t F a t t ya c i dc o m p o s i t i o n s c h a n g e dd i f f e r e n t l y i n t h e Y L a n d I M M L Y L p e a c hf r u i t s t o r e da t5 c o n t a i n e dl o w e rl i n o l e i ca c i dc o m p a r e dw i t hL T Ct r e a t m e n t , h o w e v e r H J M L p e a c h s h o w e dl o w e rl i n o l e n i ca c i d A tt h es a m et i m e ，p e a c hw i t hL T Ct r e a t m e n tp e r f o r m e d h i g h e rD B It ok e 印m e m b r a n ef l u i d i t y 3 S i xF A D g e n e sw e r ec l o n e df r o mp e a c h , n a m e dP p F A D l ，P p F A D 2 ，P p F A D 3 ， P p F A D 4 ，P p F A D 5a n dP p F A D 6 F u l l l e n g t ho ft h ea b o v es i xF A Dg e n e sW a s114 6 b p , 1 113b p , 13 4 7b p ，13 2 3b p ，13 5 9b pa n d115 2b p ，r e s p e c t i v e l y S e q u e n c ea n a l y s i s s h o w e dt h a tP p F A D 2 ，P p F A D 3 ，P p F A D 5a n dP p F A D 6w e r ec l u s t e r e da sC O 一3F A D g r o u p ，w h i l eP p F A D la n dP p F A D 4b e l o n gt oo J - 6F A Dg r o u p 4 E x p r e s s i o np a t t e r n so fs i xm e m b e r so fP p F A Dg e n ef a m i l yd u r i n gl o w t e m p e r a t u r es t o r a g ew e r es t u d i e db yQ P C R P p F A D 2a n dP p F A D 6w e r ei n d u c e db y l o wt e m p e r a t u r e ，w h i l eP p F A D 3w a sn o ts e n s i t i v et ol o wt e m p e r a t u r e P p F A D 5 e x p r e s s i o nW a sr e l a t i v eh i g h e ra t5 Cf o r Y L f r u i t , w h i l et r a n s c r i p t sl e v e l sW a s V I I 浙江大学硕士学位论文( 2 0 11 ) A B S T R A C T h i g h e ri n H J M L p e a c ht r e a t e dw i t hL T C P p F A D 4h a ds i m i l a re x p r e s s i o np a t t e r n si n Y L a n d H J M Lp e a c hf r u i t T r a n s c r i p tl e v e l so fP p F A D lw e r er e l a t i v eh i g h e ri n Y L p e a c h t r e a t e dw i t hL T C ，a n dw e r er e d c u e db yL T Ci n Y L f r u i t I nt h i sr e s e a r c h , e x p r e s s i o np a t t e r n so fF A Dg e n ef a m i l yw a ss t u d i e di np e a c h f r u i td u r i n gl o wt e m p e r a t u r es t o r a g e E n h a n c e m e n to fP p F A D le x p r e s s i o ni n c r e a s e d t h ec o n t e n to fl i n o l e i ca c i di ne n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ，a c c o r d i n g l yr a i s e dt h ec h i l l i n g r e s i s t a n to f Y L p e a c h ，w h i l ei n H J M L p e a c h , l i n o l e n i ca c i dW a sa c c u m l a t e db y i n c r e a s i n gt h ee x p r e s s i o no f P p F A D 5 i np l a s t i dt oa l l e v i a t ec h i l l i n gi n j u r y K e yW o r d s ：p e a c hf r u i t ；c h i l l i n gi n j u r y ；l o wt e m p e r a t u r ec o n d i t i o n i n g ；f a t t ya c i d ； f a t t ya c i dd e s a t u r a s e V I I I 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 )目录 目录 j l I 谢：1 缩略语表I I I 中文摘要V A B S l R A C T V I I 。目录I X 第一章文献综述l 1 1F A D 的基本特性l 1 1 1F A D 的生化特性l 1 1 2F A D 基因家族克隆、分类与功能2 1 2 F A D 在果实低温贮藏过程中的作用。4 1 2 1F A D 基因家族与果实脂肪酸形成4 1 2 2F A D 基因家族与果实低温适应性5 1 3 采后桃果实冷害的研究进展6 1 3 1 桃果实冷害症状7 1 3 2 桃果实冷害发生机理的进展7 1 3 3L T C 处理对采后桃果实冷害的调控8 1 4 研究目标与内容8 第二章采后冷害桃果实品质变化与调控1 0 2 1 材料1 0 2 1 1 实验材料1O 2 1 2 材料处理1O 2 2 方法1 0 2 2 1 冷害指数1 0 2 2 2 果实硬度测定1 0 2 2 3 乙烯释放量测定l l 2 2 4 电导率测定1 1 2 3 结果与分析1 1 2 3 1 玉露和湖景蜜露果实冷藏期间的冷害症状1 1 2 3 2 玉露和湖景蜜露果实冷藏期间冷害指数变化1 2 2 3 3 玉露和湖景蜜露桃果实冷藏过中硬度的变化1 3 I X 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 )目录 2 3 4 玉露和湖景蜜露桃果实冷藏过程中乙烯的变化1 4 2 3 5 玉露和湖景蜜露桃果实冷藏过程中电导率的变化1 5 2 4 讨论1 6 第三章基于E S T 库的桃F A D 基因家族成员的克隆1 8 3 1 材料18 3 2 方法18 3 2 1F A D 基因E S T 序列获取与组装1 8 3 2 2 总R N A 提取18 3 2 3c D N A 合成1 9 3 2 4P C R 扩增及克隆测序1 9 3 3 结果与分析2 0 3 3 1 尉D 基因家族成员的分离2 0 3 3 2 尉D 基因家族成员基因序列分析2 0 3 3 3 尉D 基因家族成员系统进化分析2 0 3 4 讨论2 3 第四章冷害桃果实脂肪酸组分及厨D 基因表达分析2 4 4 1 材料2 4 4 2 方法2 4 4 2 1 脂肪酸组分分析2 4 4 2 2e D N A 合成2 5 4 2 3Q P C R 检测体系2 5 4 3 结果与分析2 6 4 3 1 玉露和湖景蜜露桃果实冷藏期间脂肪酸组分分析2 6 4 3 2Q P C R 引物的特异性扩增检测2 9 4 3 3 尉D 基因家族成员在玉露和湖景蜜露果实中的表达3 0 4 4 讨论3 3 第五章小结与展望3 4 参考文献3 5 附录硕士学习阶段参加研究课题及发表论文4 1 X 浙江大学硕士学位论文( 2 0 11 )文献综述 1 1F A D 的基本特性 1 1 1F A D 的生化特性 第一章文献综述 脂肪酸去饱和酶( F A D ，E C1 1 4 1 9 1 _ 3 ) 是一种膜结合蛋白，催化与甘油脂 结合的脂肪酸形成双键，或者在糖脂结合的脂肪酸烃链上引入不饱和键，广泛存 在植物内质网、质体膜和蓝藻类囊体膜上。在脂肪酸去饱和的反应过程中存在两 种电子供体，一类电子供体为N A D H ：N A D H 细胞色素b 5 还原酶和细胞色素b 5 ， 另外，N A D P H ：铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧还蛋白可作为可溶性的脂肪酸去 饱和酶的电子供体。 人们对F A D 的最早认识来自对酵母的研究，B l o o m f i e l d 和B l o c h 在1 9 6 0 年用紫 外线照射得到了第一个酵母o l e l 突变体，证明了O L E l 是A 9 - F A D 的结构基因 ( R e s n i c k 和M o r t i m e r ，1 9 6 6 ) ，动物F A D 的研究则起始于S t r i t t m a t t e r 等1 9 7 4 年成功 纯化获得的鼠肝脏A 9 F A D 。植物F A D 多为膜结合蛋白，而且从膜中分离纯化后 其活性会明显下降( S c h m i d t 等，1 9 9 4 ) ，因此难以得到足够的纯化酶进行生化分析。 第一个被分离纯化的植物膜结合F A D 是菠菜叶绿体被膜中的F A D 6 ( S c h m i d t 和、 H e i n z ，1 9 9 3 ；S c h m i d t 等，1 9 9 4 ) ，迄今仅此一种膜结合酶是用传统的生化方法分 离提纯的。因此，研究脂肪酸去饱和酶的主要途径是通过筛选F A D 功能缺失的拟 南芥突变体而间接地研究其功能。迄今为止，拟南芥叶绿体去饱和途径有五个突 变体位拗，f a d 5 ，f a d 6 ，f a d 7 f f a f a d 8 ，内质网去饱和途径有两个突变体位, 点, r a d 2 和f a d 3 ( B r o w s e 和S o m e r v i l l e ，1 9 9 1 ；M c C o n n 等，1 9 9 4 ) 多数酰基脂去饱和酶有3 0 0 3 5 0 个氨基酸残基，四个跨膜区。所有已知的去 饱和酶都有三个组氨酸保守区域，在高等植物中是：H X C G H ，E X X X X X H X X H H ， H X X H H ( L o s 和M u r a t a ，19 9 8 ) 。 在模式植物拟南芥中，多不饱和脂肪酸合成有两条途径：原核途径和真核途 径。植物首先在质体基质中合成饱和脂肪酸( C 1 6 ：0 和C 1 8 ：0 ) ，然后在各种去饱 和酶的作用下，进入原核途径和真核途径，将质体和内质网中的饱和脂肪酸还原， 形成不饱和脂肪酸( O h l r o g g e 和B r o w s e ，1 9 9 5 ) 根据作用底物和催化产物的不 同，可将F A D 基因家族成员分为一6 和3 类型，其中F A D 2 和F A D 6 在6 引 入双键，催化单不饱和脂肪酸向双不饱和脂肪酸转化，属于6 类型，而F A D 3 、 F A D 7 和F A D 8 属于3 类型F A D ，在3 位置引入双键催化三不饱和脂肪酸的 合成。 F As y l 剃凇皿匝皿础 图I I 拟南芥膜脂多不饱和脂肪酸合成途径( W u 等，2 0 0 9 ) F i g 1 1Ad i a g r a ms u m m a r i z i n gm e m b r a n eP U F Ab i o s y n t h e s i si nA r a b i d o p s i s 尉D 主要以基因家族的形式存在，已经从拟南芥、番茄、烟草、大豆、向日 葵、苹果、鳄梨、杏、橄榄等植物中分别获得了多个基因家族成员。根据G e n B a n k 公布的氨基酸序列，我们构建了植物F A D 基因家族成员的系统进化树( 图2 ) 。 2 浙江大学硕士学位论文( 2 0 1 1 )文献综述 ” 图1 2 基于氨基酸序列的植物翩D 进化树 F i g 1 2P h y l o g e n e t i ct r e eo fp l a n tF A Db a s e do nt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e 基因名称和G e n B a n k 登录号：拟南芥( A r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ：A t F A D 2 N M 1 12 0 4 7 ) ，A 删D 3N M12 8 5 5 2 ) ，A 绷D 6N M1 19 2 4 3 ) A 删D 7 ( N M1 11 9 5 3 ) ，A t F A D 8N M1 2 0 6 4 0 ) ；番茄( L y c o p e r s i c u me s c u l e n t u m ) ：三P 尉D 3 ( E U 2 5 119 0 ) ，L e F A D 7 ( A Y l5 7 317 ) ； 烟草( N i c o t i a n at a b a c u m ) ： N t F A D 2 ( A Y 6 6 0 0 2 4 ) ，m 翩仍( P 4 8 6 2 6 ) ，N t F A D 7 ( D 7 9 9 7 9 ) ；橄榄( O l e ae u r o p a e a ) ： o e F A D 2 1 ( A Y 7 3 3 0 7 6 ) ，o e E A D 2 2 ( A Y 7 3 3 0 7 7 ) ，o e 壬强D 3 ( D Q 7 8 8 6 7 3 ) 。O e F A D 6 ( A Y 7 3 3 0 7 5 ) ，O e F A D 7 ( D Q 7 8 8 6 7 4 ) ；大豆( G l y c i n em a x ) ：G m F A D 2 ( A Y 6 11 4 7 2 ) ， G m F A D 3 ( A Y 2 0 4 7 1 0 ) ，G m F A D 7 ( E U 6 2 1 3 9 0 ) ，G m F A D 8 ( F J 3 9 3 2 2 9 ) ；向日葵 ( H e l i a n t h u sa n n u u s ) ：H n F A D 2 1 ( A F 2 5 、8 4 2 ) ，H n 壬、A D 2 2 ( A F 2 5 、8 4 3 ) 、H n 礅D 2 3 ( A F 2 5 18 4 4 ) ，胁翩D 7 ( A Y 2 5 4 8 5 8 ) ；苹果( M a l u sd o m e s t i c a ) ：M d F A D ( A Y 5 5l5 5 8 ) ； 鳄梨( P e r s e aa m e r i c a n a ) ：A v F A D l 2 ( A Y 0 5 7 4 0 6 ) ；杏( P r u n u sa r m e n i a c a ) ：尸捌D t A 譬0 7 1 8 9 2 ) 由图可知，植物F A D 大致可以分为四大类。第一组F A D 主要包括拟南芥 A t F A D 2 、烟草N t F A D 2 ，橄榄O e F A D 2 J f 和O e F A D 2 2 ，它们属于6 F A D 类型， 主要分布在内质网( 空心圆圈表示) 。第二组也属于C O 6 F A D 类型，但定位于叶 绿体，主要包括A t F A D 6 和O e F A D 6 ( 空心三角形表示) 。第三组厨D 主要包括 拟南芥A t F A D 3 ，番茄L e F A D 3 ，烟草N t F A D 3 和橄榄O e F A D 3 ，它们属于C O 3 类 3 浙江大学硕士学位论文( 2 0 11 )文献综述 型F A D ，定位于内质网( 实心圆圈表示) 。拟南芥A t F A D 7 和A t F A D 8 ，番茄L e F A D 7 ， 烟草N t F A D 7 ，橄榄O e F A D 7 ，以及来自杏和鳄梨果实的F A D 基因相对聚类，它 们属于C O 3 类型F A D ，主要分布在叶绿体( 实心三角形表示) 研究显示，植物F A D 基因家族成员的功能具有多样性。模式植物拟南芥f a d 2 突变体的不饱和脂肪酸与叶绿素含量显著低于野生型植株，对低温非常敏感，易 引发叶片坏死等症状( M i q u e l 等，1 9 9 3 ) ，其它突变体如f a d 5 、f a d 6 ，双突变体 f a d 7 f a d 8 和三重突变体倒罗倒棚在低温下的生长速度均明显下降，其f a d 5 和f a d 6 约降低了3 0 ( W a l l i s 等，2 0 0 2 ) 另外，F A D 基因还参与了其它胁迫反 应。如拟南芥f a d 6 突变体表现出对盐胁迫的高敏感性( Z h a n g 等，2 0 0 9 ) ，反义 抑制A t F A D 7 表达的烟草植株对干旱胁迫敏感( I I n 等，2 0 0 1 ) ，而C O 3 类型F A D 特异性参与拟南芥茉莉酸合成进而调控生物胁迫反应( M c C o r m 等，1 9 9 7 ) 。 1 2 F A D 在果实低温贮藏过程中的作用 1 2 1F A D 基因家族与果实脂肪酸形成 脂肪酸组成是橄榄、鳄梨、核桃、榛子等果实重要的品质指标，不同种类果 实和果实不同部位的脂肪酸组成具有差异。核桃果实的脂肪酸可占核仁重量的 6 2 7 4 ，主要成分亚油酸( 1 8 ：2 ) 可占脂肪酸总量的7 0 以上，油酸( 1 8 ：1 ) 和 亚麻酸( 1 8 ：3 ) 含量接近( M a r t i n e z 等，2 0 1 0 ) 。不同于核桃果实，鳄梨果实的 脂肪酸以油酸为主，约占脂肪酸总量的6 0 左右，其次是亚油酸，硬脂酸含量最 低( L u 等，2 0 0 9 ) 。榛子果实的脂肪酸组成也以油酸为主( A l a s a l v a r 等，2 0 1 0 ) 。 何志勇( 2 0 0 8 ) 发现橄榄果实不同部位的脂肪酸组成具有差异，果肉与核仁组织 的油酸相对含量分别为5 5 2 和3 0 5 ，亚油酸为4 7 和4 1 8 。鳄梨果实果肉 和种子的脂肪酸组成也有不同，其中果肉组织以油酸为主，其含量可达种子的2 倍，而核仁则以亚油酸为脂肪酸主要成分( T a k e n a g e 等，2 0 0 8 ) 。 不同于大豆和向日葵等油料作物及模式植物拟南芥的进展，有关F A D 基因 家族参与果实脂肪酸形成的研究仍处于起步阶段，下文以橄榄果实为材料进行概 述。基于酵母表达的结果显示橄榄果实O e p F A D 2 一J 和O e p F A D 2 2 具有催化油酸 4 浙江大学硕士学位论文( 2 0 11 ) 文献综述 形成亚油酸的功能，B a n i l a s 等( 2 0 0 5 ) 认为它们可能定位于微粒体在果实成 熟进程中O e p F A D 2 J 转录本含量趋于下降而O e p F A D 2 2 则不断增加，结合核仁 组织中亚油酸含量的变化模式，认为O e p F A D 2 J 参与了发育初始阶段的亚油酸 合成，O e p F A D 2 - 2 主要在成熟后期亚油酸的积累过程中起作用( B a n i l a s 等， 2 0 0 5 ) 进一步研究表明，O e p F A D 2 2 是参与橄榄果实果肉组织亚油酸生物合 成的特异性成员( H e r f i n d e z 等，2 0 0 9 ) 。O e p F A D 6 在橄榄果实成熟进程中的表 达水平维持基本稳定，但在叶片组织中具有较高转录本含量，认为它可能参与了 叶片组织的油酸去饱和过程( H e r f i n d e z 等，2 0 0 9 ) 。橄榄F A D 基因家族还包括 O e F A D 3 和O e F A D 7 ，它们分别定位于内质网和叶绿体，B a n i l a s 等( 2 0 0 7 ) 通过 分析两者在根、茎、叶、花和果实等不同器官发育进程中的表达模式，并结合原 核杂交结果，认为O e F A D 3 和O e F A D 7 通过调控亚麻酸合成分别参与了雌配子 体发育和茎叶尖组织的细胞分裂。 1 2 2F A D 基因家族与果实低温适应性 低温贮藏可延缓成熟衰老进程，是维持采后果实品质最有效的方法之一然 而冷敏果实在低温贮藏过程中易发生生理失调，造成冷害，导致品质下降。采后 桃果实于5 C 贮藏3 0d ，其不饱和脂肪酸如亚麻酸含量下降了6 8 ，细胞膜流动 性显著降低，组织电导率明显上升，并发生严重褐变等冷害症状( Z h a n g 等， 2 0 0 9 ) 。油桃果实上的研究也显示，亚麻酸等不饱和脂肪酸含量同冷害发生具有 密切负相关关系( 高慧等，2 0 0 7 ) 。对于非冷敏性的猕猴桃果实而言，5 C 低温 贮藏过程中不饱和脂肪酸比