大肠杆菌耐喹诺酮类机制分子生物学基础的初步研究.ppt

1,大肠杆菌耐喹诺酮类机制分子生物学基础的初步研究,深圳南山人民医院传染科（518052）邓启文,2,引言,随着氟喹诺酮类药物在临床的广泛应用，其耐药菌株日益增多。氟喹诺酮类的作用的靶位是细菌的DNA回旋酶。为了了解大肠杆菌对其耐药的分子生物学机制，我们对6株耐药菌1株敏感菌和1株标准株（ATCC25922）的gyrA基因的N末端编码区进行了PCR-SSCP及序列测定分析以检测gyrA基因突变。,3,材料和方法（1）,菌株的收集4株大肠杆菌耐药菌株及1株敏感株来自我院院感科及检验科，其中3株来自尿液标本2株粪便培养标本。均经过常规生化及血清学鉴定。大肠杆菌标准株ATCC-25922购自中国药品生物制品检定所。,4,材料和方法（2）,药敏试验诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星药敏纸片购自浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。药敏试验采用Kirby-Bauer法，结果按NCCLS1993年版标准制定。,5,材料和方法（3）,主要试剂扩增DNAgyrA两条外引物为：5-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3及5CCGGTACGGTACGGTACGGTAAGCTTCTTCAA-3分别位于gyrA4061位碱基及686707位碱基，两条内引物为5-TCCGTCGCCTACTTTACGCC-3及5-TCGGCGAAATCGACCGTC-3分别位于gyrA133-152位碱基及420-439位碱基。,6,材料和方法（3）续,上述引物委托上海生物细胞研究所DNA合成部合成。合成仪为BeckmanOli-go1000型。dNTP、Tag酶、Wizard聚合酶链反应产物纯化试剂盒购自北京华美公司。DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。胰化蛋白胨酵母浸膏、NaCl、琼脂糖、甲醇、甲醛、乙酸、重铬酸钾、硝酸银、酚、氯仿等为国内分析纯试验。,7,材料和方法（4）,PCR扩增gyrA按参考文献（1）方法。1ml过夜培养大肠杆菌10000g，5min收集沉淀，加入200ulTE缓冲液（PH8.0）混悬，加入溶菌酶37温浴。10%SDS3730min，蛋白酶K56水浴1h后，用等量酚，氯仿抽提后作模版DNA。,8,材料和方法（4）续,第一次PCR反应体积50ul，含10PCR缓冲液5ul，MgCl22ul，dNTP2.5ul，Tag酶2u，模版2ul，外引物各50pmol（2ul），第二次PCR50ul反应体积中含第一次PCR产物1ul、内引物各2ul，余同第一次PCR反应体积。PCR条件：94预变性5分钟；941分钟，561分钟，7245秒，共35个循环。反应结束后72延伸10分钟。PCR仪为美国Perkin-Elmer公司的PE480热循环仪。,9,材料和方法（5）,GyrAPCR产物的单链构象多态性（SSCP）分析：取第二次PCR产物5ul，94%去离子甲酰胺和溴酚蓝各5ul混匀后置85水浴变性5分钟，然后迅速放入0冰水中使DNA处于单链状态。,10,材料和方法（5）续,配制5%聚丙烯酰胺凝胶（内含5%甘油），取1.5ul变性混合物上样。0.5TBE为电泳缓冲液，15电泳。取出凝胶后在无离子水中浸泡30分钟后：50%甲醇，12%乙酸10分钟；10%甲醇，5%乙酸10分钟；3.4mmol/L重铬酸钾；3.2mmol/L硝酸5分钟；1.2mmol/LAgNO320分钟，0.28mmol/L碳酸钠，0.5ml/L甲醛5分钟后终止反应。观察结果。,11,材料和方法（6）,PCR产物测序利用WizardPCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA产物，纯化产物后以外引物为引物，用末端标记测序试剂盒在自动测序仪上进行测序。,12,结果（1）GyrAPCR扩增结果,Gyr第一次PCR扩增产物为668Vpb片段；第二次为307bp片段（图1）,13,14,结果（2）GyrAPCR-SSCP结果（图2）,标准株及临床分离敏感株gyrAPCR-SSCP结果两条DNA单链处于同一位置。4株耐药菌株其结果与临床敏感株及标准株DNA单链结果不同，说明有碱基变异存在。,15,16,结果（3）DNA测序结果及推定氨基酸序列（1）,A株在gyrA基因碱基序列的第259位有GA突变，致Asp-87Asn。第267位有TC突变，为无意突变。B株在247，259，300，332，552位分别有CT，GA，TC，TC，CA突变，其中247位致Ser-83Leu，259位致Asp-87Asn，552位致His-184Asn（图3）其余为无意突变。,17,图5,18,19,讨论（1）,DNA回旋酶（DNAgyrase）是细菌特有的一种拓扑异构酶，它能够利用ATP水解的能量将共价闭合环状DNA转变为负超螺旋DNA，对DNA的复制、转录、重组和修复过程有着重要作用（3）。该酶由A、B两个亚单位组成。A亚单位参与酶反应中DNA链的断裂和重接，B亚单位参与酶反应中能量的转换和ATP的水解。,20,讨论（1）续,喹诺酮类药物作用的靶位是细菌的DNA回旋酶，阻止DNA的超螺旋型转化产生杀菌作用。DNA回旋酶A单位（gyrA）发生点突变是造成细菌产生耐药性的主要原因（4）。国外研究以发现gyrA基因突变位点集中发生在N末端核苷酸序列为199-318的区间内，即所谓氟喹喏酮类药物耐药决定区。,21,本研究根据gyrA基因已知序列（6），针对氟喹喏酮类药物耐药决定区区域设计了两对引物，经PCR反应后，扩增出307bp片段，与预期结果相符。自1989年Orita等（2）首次报道单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism，SSCP）分析技术以来，SSCP技术已成为基因突变的快速筛选和检测的重要手段。,讨论（2）,22,讨论（2）续,其原理是序列不同的单链DNA，形成不同的构象，在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁徙率不同形成不同的条带。本研究表明大肠杆菌标准株和敏感株gyrA基因电泳后在同一位置，碱基未发生变化。而4株耐药菌株其DNA单链与标准株及临床敏感株迁移率不同，可以推论4株耐药菌株其gyrA基因发生了突变。,23,讨论（3）,通过DNA序列测定分析发现a株、b株、d株同时存在Asp-87Asn，、b株、d株同时存在Ser-83Leu，b株还有His-184Asn突变，其余突变为无意义突变，突变的碱基以CT为主。Ser-83Leu及Asp-87Asn突变位于氟喹酮类药物耐药决定区，与文献（4，5）报道相同。,24,讨论（3）续,本研究发现的gyrA基因氨基酸184位点CA碱基突变致组氨酸突变为无冬酰氨尚未见文献报道，因此我们认为我院分离的大肠杆菌对氟喹酮类药物产生耐药性与gyrA基因的点突变有关。,25,讨论（3）续,e株虽然存在碱基突变并未导致氨基酸的变异为无意突变。其耐药可能与细菌膜对药物通透性下降或主动流出系统有关。,26,参考文献（1）,1金冬雁，黎孟枫，译。分子克隆实验指南。第二版，北京：科学技术出版社。1992.49-55.2OritaM,SuzukiY,SekiyaT,etal.RapidandsensitivedetectionofpointmutationsandDNApolymorphismsusingthepolymerasechainreaction.Genomics.1989,5.74.3ReeceRJ,MaxwellA.DNAgyrasestructureandfunctioncriticalReviewsinBiochemistryandMolecularbiology.1991.26:335.,27,参考文献（2）,4LewinCS.AllwnRA,AmgesSGB.Potentialmechanismsofresistancetothemodernfluorinated4-quinolones.JMedMicrobiol.1990,31:153-161.5YoshidaH,BoyakiM,NakamuraM,etal.QuinoloneresistancedeterminingregionintheDNAgyraseAgeneofEscherichiacoli.AntimicrobAgentsChemot