核酸的重要理化性质.ppt

一、核酸的一般物理性质,DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。DNA核蛋白RNA核蛋白0.14mol/LNaCl-+1-2mol/LNaCl+-DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。,第四节核酸的重要理化性质,二、核酸的两性性质及等电点,与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的pH值即为核酸的等电点pI）如DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。核酸在其等电点时溶解度最小。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。,三、核酸的水解,1.核酸的酸解和碱解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断（降解）。酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来。DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.3-1mol/LNaOH溶液中，在室温至370C条件下RNA几乎可以完全水解，生成2-或3-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响，若加温至1000C，4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2-OH的羟基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。,2、核酸的酶解,生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-端或5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。（小球菌核酸酶即可外切又可内切）在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。,四、核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。,五核酸的变性、复性与杂交,1.核酸的变性（denaturation）与变性因素核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加2540%.而RNA变性后，约增加1.1%。增色效应：变性后DNA对260nm紫外光的吸收率（A260）比变性前明显增加，这种现象称为增色效应.,A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不变,2.DNA变性后的表现,3.DNA的热变性和解链温度（Tm）,用加热的方法使DNA变性叫做热变性DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到50%时，即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度（meltingtemperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA的熔点。一般DNA的Tm值在70-85C之间,RNA的Tm值tRNA的Tm值,G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm大小可反映出DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。Tm与介质中离子强度有关：DNA的保存应在含盐的缓冲液中,温度/0C,A260,0.02,0.1,1.0,mol/LKCl,DNA变性（加热或极端pH）,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260nm)值升高,粘度降低等。,4、核酸的复性,变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。复性反应的速度用Cot1/2表示。Co为变性DNA复性时的浓度，t为时间，以秒表示。（P352）,DNA复性,5、核酸的杂交（hybridization）,热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生