ABI-3500 xL基因分析仪操作流程.docx

ABI 3500xL基因分析仪操作流程一、 标准测序反应（一） 质粒测序标准实验流程1对质粒DNA的质量和浓度要求 纯度：OD 260/OD 280= 1.62.0，用量：每反应150300 ng。2测序 PCR 反应 标准反应体系：3测序产物纯化：使用Edge Bio收集柱进行纯化。（1）离心850g，3min柱子，弃掉收集管，换新的EP管。（2）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。（3）离心850g，3min，弃掉柱子，即得纯化产物。（4）取10 L Hi-Di Formamide加入96孔板中，再加入10 L待测样品，振荡混匀离心。（二） PCR 产物测序标准实验流程1 对PCR 产物的要求纯度：OD 260/ OD280=1.62.0，用量：每反应10100 ng。强烈建议在测序前，先纯化PCR产物。2 PCR产物的测序 PCR 反应标准反应体系：3 测序产物纯化：方法同上。二、 上机测序（一）启动系统1. 打开电脑，检查电脑右下角处3500监控状态是否正常启动。2. 打开3500 xL仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。3. 启动电脑桌面Data collection software。4. 检查维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击。5. 检查耗材状态：点击“Refresh”，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC、CBC和毛细管），若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。6. 仪器预热：点击仪表盘上的“Start Pre-heat”按钮预热炉子和泳道。（二）放置待测样品1. 检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的96孔板上，注意孔对孔盖好。2. 将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。3. 按仪器的TRAY按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者。（三）创建平板1. 点击Create Plate From Template，在弹出对话框中选择模板Std_Seq_Array_xL_POP7，点击Open，输入详细的平板信息，包括Name, Number of Wells, Plate Type, Capillary Length, Polymer。一般详细如下。1. 点击屏幕下方的Assign Plate Contents。（1） 输入各个孔的样品名称等信息，Results group：输入结果的保存路径。（2） 选中下面控制面板上Assay，Filename convention，Results group三个项目。（3） 点击Link Plate for RunOK。2. 检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击Start Run，即启动运行。（四）监控运行仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。1. 可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看Instrument Run Views and Flags中各项：EPT（电流、电压、温度），Array中可查看峰图。2. 可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。3. 启动、暂停或继续运行。（五）查看结果点击Review Results即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。三、 分析测序结果1. 打开软件：双击电脑桌面Sequencing Analysis v5.4图标。2. 导入结果：点击工具栏中Add samples 按钮，选择路径，导入待分析的测序结果。3. 分析：Sample manager中选择分析方法对测序结果进行分析。一般用BC (baseclling, 将原始结果翻译为对应的碱基序列)。（1） 选中BC复选框，点击工具栏中Start analysis 按钮，即开始分析。（2） 分析结束后，结果将自动保存为ab1格式文件。（3） 点击工具栏中Analysis report 按钮，可查看结果状态(BC status)，不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否。（4） 选中某样品前show复选框，即可查看各样品的详细结果。A sequence显示碱基序列及其QV评分结果。注意：a. 蓝色：High QV = 20+，结果可信；黄色Medium QV = 15 to 19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色Low QV15，结果不可信。b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到txt文档中。B Electropherogram显示电泳峰图及序列。C Raw显示看到原始电泳图。4. 打印：Sample manager中选中P (print)复选框，点击Start analysis绿色按钮，即可将测序结果输出为pdf格式文档。操作注意事项1. 测序反应：（1）模板：测序反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定。（2）反应体系：一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时），一般8倍以内稀释比较可靠。（3）反应条件：退火50和延伸60时，升降温速度需降低至1/s，使测序反应充分进行。（4）体系配制：反应体系的制备不能在样品制备区和PCR区进行，移液器不能混用，否则会造成实验室污染。ABI 3500xl日常维护1. 毛细管维护：（1）每周查看阴极缓冲液的液面，避免毛细管露出液面干燥而失效。若液面下降，可在阴极缓冲液中加入双蒸水，保证毛细管插入液面下。下次电泳前换新的缓冲液。（2）防止碰触毛细管针尖，只有在更换新的毛细管时才需打开检测窗口门，之后需在软件中重新校正。包括：A空间校正，maintainancecalibratespeitial，选择fill灌胶后开始，选择no fill不灌胶直接开始start calibrate。结果判定，所有峰只有一个尖且间距在15，16间，峰高比较均一，相差不超过60%，可接受，完成后要点Accept或者reject。B光谱校正，换新毛细管、不同类型试剂盒、不同类型胶时需做maintainancecalibratespectial，G5为片段分析用，Z为测序用calibrate run，chemistry standard：G5。完成后需点Accept。（3）若长期不用仪器时，仍需每周给毛细管灌胶一次。（fill array with polymer）2. 仪器日常维护：（1）可用无尘纸巾、棉签和蒸馏水擦拭仪器表面，勿使用有机溶剂，不能随意搬动仪器。 （2）严禁在电脑上安装其他无关软件，不准用U盘拷贝数据，只能刻盘。（3）长期不用应将POP7胶取下加塑料塞放入4冰箱，用漂洗袋代替。并每周进行一次replenish polymer。（换新胶袋后和每周一次）。（4）若机器使用频繁应每周用contridationing regents清洗灌胶泵(wash pump and channels)一次。（5）fill array with polymer，换毛细管后或认为灌胶有问题时重新灌。（6）shut down ，长期不用时关闭仪器，慎用。（7）remove bubbles，排气泡。（8）灌胶泵维护每月一次：A，水峰，松开泵上方进口旋钮，用注射器注射纯水5-10ml，要缓慢