棉花课题组实验操作手册

棉花基本生物技术操作手册华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室棉花课题组二00三年七月武汉目录1. MS培养基母液配制 12. 棉花胚性愈伤的诱导及植株再生 23. 棉花原生质体操作 34. 根癌农杆菌介导的遗传转化 65. DNA的提取和检测 86. RNA的提取和检测107. 分子标记8. 分子杂交前 言随着本课题组科研队伍的不断壮大，科研工作的全面开展和深入，各个研究方向开始交流渗透，急需一本规范的实验操作手册为课题组各个成员提供指导.手册是由本课题组多个研究方向的成员参照标准的操作程序结合自身的经验编写而成,因此具有一定的科学性和可操作性。这本手册是在张献龙教授的大力倡导和支持下完成的，课题组各个成员都积极参与了手册的编辑，在此一并致谢。金双侠编写了手册第一，二，八部分；孙玉强编写了第三部分；梁绍光编写了第四部分；朱龙付编写了第五部分；涂礼莉编写了第六部分；贺道华编写了第七部分。杨细燕负责部分文字的输入及编辑工作，涂礼莉负责全文的校对和编辑工作。这本手册的编辑是本课题组第一次有益的尝试，经验不足，难免有许多纰漏，期盼课题组在今后的不断发展中能够不断改进和丰富这本手册。MS培养基母液配制一、大量元素（20倍）母液 (g/L)KNO3 38 NH3NO3 33MgSO47H2O(无水MgSO4) 7.4(3.8)KH2PO4 3.4CaCl22H2O(无水CaCl2) 8.8(6.6)二、微量元素（100倍）母液 (g/L)CoCl26H2O 0.0025CuSO45H2O 0.0025H3BO3 0.62KI 0.083MnSO44H2O 2.23NaMO42H2O 0.025ZnSO47H2O 0.86三、铁盐（100倍）母液 (g/L)FeSO47H2O 2.78 Na2EDTA 3.73四、 B5有机物 VB1(硫胺素) 10mg/l VB5（盐酸吡哆醇） 1mg/lVB6（烟酸） 1mg/l肌醇 100mg/l 甘氨酸 2mg/l 五、 生长调节剂生长素（2，4-D、IBA、IAA、NAA等）细胞分裂素（KT、ZT等）母液配制注意事项：1. 配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解,逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaCl2否则容易产生沉淀,定容到一升。2. 配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下10小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。3. 配制铁盐时,两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生,然后才能使用。4. 各种生长激素一般可以用1摩尔/升的NaOH或HCl溶解后，再定容。5. 配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染6. 各种母液配制好后应存放在4冰箱中,发现有沉淀后，不得使用。棉花组织培养一、无菌苗的培养将棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下：2/1 MS大量元素+葡萄糖15克/l+phytagel 2.5g/l，三至四天暗培养，一至二天光照培养。二、愈伤组织的诱导 选取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.50.6cm小段，接种于诱导培养基上配方如下：MS无机盐+B5有机物+2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/l三、非胚性愈伤组织的增殖MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半) +B5有机物+2,4-D 0.05mg/l+ KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/，或者是MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半) +B5有机物+葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/l(针对那些增殖迅速的愈伤)。四、愈伤组织的分化愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基（MS + B5有机物+葡萄糖30g/L + phytagel 2.5g/l + KT0.15mg/l +IBA0.5 mg/l）中，进一步分化成胚状体。五、胚性愈伤组织的继代MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半) +B5有机物+IBA0.5mg/l+ KT0.15mg/l+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/l+Asn(天冬酰胺)0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/l六、成苗生根培养基MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半) +B5有机物+IBA0.5mg/l+ NAA0.5mg/l+Gln1.0mg/l+Asn0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel 2.5g/l 七、胚性愈伤组织的悬浮培养基MS无机盐+B5有机物+Gln(谷胺酰胺)0.2mg/l+Asn(天冬酰胺)0.2mg/l+NaCl 1.0g/l +KCl 1.0g/l+葡萄糖30g/l棉花原生质体操作一、材料的准备1. 胚性细胞悬浮系的建立：从固体培养基上取继代两周的胚性愈伤组织于MS+谷氨酰胺0.2 g/l+ 天门冬酰胺0.2 g/l+葡萄糖30 g/l的液体培养基中 (每瓶40 ml), 120转振荡培养, 每7天继代一次, 4周后可以用于原生质体分离。2. 无菌苗的培养：种子去壳消毒播种在1/2MS 培养基上, 10天后叶片充分伸展开后可分离原生质体。二、原生质体的分离1. 悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取1 g左右的悬浮培养物于1560 mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5-3 ml 酶混合液,轻轻摇匀,封口膜封口, 置于摇床上40转或静置, 28 黑暗条件下酶解18-22小时。2. 叶肉原生质体的分离: 把叶片放在1560mm的培养皿中,并用解剖刀将叶片切成0.1 cm宽的细条, 后加入1.5 ml 酶混合液,轻轻摇匀,封口膜封口, 置于摇床上10转或静置, 28 黑暗条件下酶解14-18小时。三、原生质体的纯化1. 酶解后的原生质体混合物经40目的不锈钢网去掉渣子,CPW9M 洗涤, 滤液在10ml 的离心管离心10分钟(800rpm), 使原生质体沉于管底。2. 沉淀物用3 ml CPW25S 悬浮, 在其上加入1ml 的CPW9M 离心2-6分钟(700rpm), 原生质体在两液面形成一条带, 其他的杂质及少量的原生质体沉于管底。3. 将原生质体轻轻地吸出, 转入另一试管, 用电融合液离心洗涤5-6 分钟(700rpm), 去掉上清夜, 用电融合液悬浮至2-10105/ml 备用。四、原生质体活性检测FDA 溶液(5 mg/ml)按25 l FDA/ml 原生质体的比例加入FDA, 5分钟后, 在荧光显微镜下检测原生质体的活性 (暗视野下发荧光的原生质体数/明视野下原生质体总数)。五、原生质体融合 (电融合)1.将悬浮好的双亲的原生质体等体积混合。2.用吸管取大约1.6 ml 悬浮液于环形融合小槽(FTC-4), Parafilm 封口。3.静置5-10分钟,等大量的原生质体沉淀后, 在选择好融合参数下诱导融合, 可以在倒置显微镜下观察。4.融合后静置10-20分钟, 以便融合的原生质体球形化。5.吸出融合产物后, 离心5-6分钟, 用培养基悬浮到合适的密度进行培养。六、原生质体培养棉花的原生质体培养常采用KM8P或MSB 液体培养, 待形成肉眼可见的愈伤组织后, 转移到继代培养基, 接下来的操作详见遗传转化操作部分。七、再生苗的鉴定1.形态学鉴定: 叶形, 株高等2.细胞学鉴定: 染色体, 气孔3.分子标记鉴定: RAPD, AFLP, SSR, CAPS, RFLP, Southern blotting八、相关的酶液, 洗液及培养基1.enzyme mixtures (仅供参考) 100ml mannitol (9%) 9gNaH2PO4.2H2O (0.011%) 0.011gCaCl2.2H2O(0.36%) 0.36gMES(0.12%) 0.12gCellulase R-10 (3%) 3gPectinase (1.5%) 1.5gHemicellulase(0.5%) 0.5g2.CPW (mg/l) pH 5.8 CaCl2.2H2O 1480KH2PO4 27.2KNO3 101.0MgSO4.7H2O 246.0CuSO4.5H2O 0.025KI 0.16CPW9M 添加90g Mannitol； CPW25S添加250g Sucrose3.electrofusion medium (100ml)0.1mM CaCl2.2H2O，10% (w/v)mannitol4. KM8P organic elements Sugar (g/l)Sucrose 0.25Mannose 0.25Glucose 68.4Fructose 0.25Ribose 0.25Xylose 0.25Rhamnose 0.25Cellobiose 0.25Sorbitol 0.25Vitamins and organic acids (mg/l)Inositol 100Nicotinic amid 1Pyrridox-HCl 1Thiamine-HCl 10D-Ca-Pantothenate 1Folic acid 0.4p-Aminobenzoic acid 0.02Biotin 0.01Cholinchloride 1Ascorbic acid 2Vitamin A 0.01Vitamin D3 0.01Vitamin B12 0.02Glycine 2 Na-pyruvate 20Citric acid 40Malate 40Fumarate 40Organic supplements (mg/l)Casein hydrolysate 250根癌农杆菌介导棉花愈伤组织遗传转化1愈伤状态的调整和活化 选择再生性较好的棉花品种的胚性愈伤组织接种于增殖培养基上，挑取细颗粒(非粉末)胚性愈伤两周继代一次，在继代过程中尽量使愈伤状态均一生长同步，减少愈伤中幼胚的发生，待增殖到足够的量后继代于预培养培养基上弱光培养(非暗培养)十天即可用于侵染。2农杆菌的活化和保存2.1准备： 农杆菌，MGL液体培养基（含kan 50mg/L），无菌三角瓶， LB（固、液）培养基（含kan 50mg/L），灭菌甘油，无菌枪头，无菌1.5ml离心管 2.2操作：2.2.1 活化，悬浮： 超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，LB平皿上划线，26.5暗培养36-48hr，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在另外的LB平皿划线，26.5暗培养36-48hr，待皿内长出足够的菌落结束培养，把培养基表面菌落刮入三角瓶内的MGL培养基中，27、200rpm摇2hr，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。2.2.2菌株的保存： 从培养皿内挑取单菌落接于LB液体培养基中150rpm、26摇48hr，按菌液和甘油1：1加入1.5ml离心管混匀，-70保存。注意： 从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱；农杆菌在LB平皿内保存时间不宜过长应尽量保持新鲜；用MGL培养基悬浮农杆菌时，某些菌株若出现结块，可在瓶内放入几根灭过菌的大头针，或者结合减少悬浮时间，在其结块前进行侵染。3浸染，共培养：3.1准备： 经活化生长旺盛胚性愈伤，经活化农杆菌，无菌培养皿，无菌滤纸3.2操作： 把胚性愈伤从三角瓶转入无菌培养皿，去掉幼胚，发白和死亡等状态不好的愈伤，吹5分钟使表面稍为干燥，把经活化的菌液倒入其中，刚盖过表面为宜，搅匀，静置5-10分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，薄层分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21暗培养38-42小时，待少部分愈伤表面出现不太明显的菌落结束共培养。3.3注意： 侵染时愈伤表面稍为干燥可以增加农杆菌的吸附；共培养过程中愈伤上带过多的菌液容易导致愈伤在共培养过程中受缺氧和毒害等不利环境条件而大量死亡，可以通过增加侵染时菌液的浓度和风干代替滤纸吸干等方法来提高愈伤表面的农杆菌密度；共培养时愈伤上的残渣过多容易滋生农杆菌，使其增殖过快而不利于以后的操作。4选择培养4.1 准备： 无菌水，无菌滤纸，头孢酶素，无菌培养皿，选择培养基4.2 操作： 把经过共培养的愈伤连同滤纸一起取出浸入含500mg/LCef的无菌水中，把滤纸上的愈伤洗干净，倒掉洗液，用含500mg/L Cef 的无菌水浸泡15-20 min ，期间多搅动,去掉幼胚，发白和死亡等状态不好的愈伤；倒掉洗液，用无菌水清洗三遍，滤纸吸干水分，小堆分散布于选择培养基一上，吹10分钟使表面稍为干燥；弱光培养；培养20天左右继代转入选择培养基二正常光照培养，培养20天左右继代转入选择培养基三正常光照培养，培养20-30天，黑色死亡愈伤上出现浅黄色颗粒较小生长正常的愈伤即为抗性愈伤。一般可以把抗性愈伤单克隆在选择培养基三上再继代一次以增加愈伤数量。4.3注意： 共培养后第一次进行选择培养时应尽量使培养的环境保持干燥，包括愈伤表面和培养基，这样可以减少农杆菌的污染；愈伤布在选择培养基上应尽量小堆、薄层和分散，可以减少农杆菌的污染，但过分那样则不利于抗性细胞启动增殖，应该把握好分散和密集的尺度。5分化成苗从选择培养基上挑取单克隆抗性愈伤分别接种到分化培养基上，20天左右继代一次，分化和成苗的过程中尽量把不同克隆之间区分清楚。附：LB培养基配方胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，PH值7.0MGL液体培养基配方胰化蛋白胨5 g/L，氯化钠5 g/L， MgSO4.7H2O 0.1 g/L, KH2PO4 0.25 g/L,甘露醇5 g/L，甘氨酸1.0 g/L, PH值7.0棉花DNA的抽提（CTAB法）： 将-70冷冻叶片或新鲜叶片25克用液氮充分研磨至细粉状，装入50 ml离心管中。加入100200 ul -巯基乙醇,按6 ml/ g样的比例加入预冷（4）的抽提缓冲液，剧烈振荡均匀，4下3500转（BACKMAN离心机，日立离心机为10000转左右）离心10分钟，倒去上清。按5 ml/ g样的比例加入预热到65的裂解缓冲液,并迅速搅拌均匀,65水浴30 min或更长到60 min。每隔10 min轻轻摇动一次。加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻上下颠倒混匀（注意放气）。混匀到下部溶液变成黑色。3500转，室温离心（BACKMAN离心机，日立离心机为10000转左右）10分钟。取上清至新管，重新加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻摇动直至混匀为一相。重复步骤5。取上清至新管，加入2/3体积冰冷的（-20）异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，这时会出现絮状的DNA沉淀。-20冷冻30分钟。将DNA转移至新管，用75%乙醇10 ml（开始可以多加至30 ml）浸泡来洗盐和去杂。每23小时换一次。换23次或至DNA为白色，酒精清澈为止。10DNA风干至透明状时（不可过于风干，否则很难溶解）用2 ml PH8.0的TE溶解，然后加10 ul 浓度为10ug/ ul的RNase, 37水浴30分钟。(或者60水浴30分钟)RNase用之前要在沸水中煮10分钟以去除DNase。11 加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻混匀后，3500转离心10分钟，取上清至新管。加入1/10体积的3M的NaOAC（PH5.2）和2倍体积冰冻无水乙醇, 轻摇可见DNA沉淀.勾出DNA，用76%乙醇浸泡，可换1-2次。风干后加200 ul400 ul TE溶解。-20可长期保存，或者在76%乙醇浸泡长期保存。DNA浓度的测定：1 DNA原液稀释100倍后，用0.8%的琼脂糖检测，根据MARKER的亮度可以初步判断DNA的浓度，此外还可以看出DNA是否降解，RNA是否去除干净，蛋白质和多糖是否含量比较多等。2 DNA浓度的精确测定：用3 ul DNA原液稀释到300 ul，利用BACKMAN紫外分光光度计210nm300nm全波长扫描。利用OD260可以计算出DNA浓度。 DNA=OD260*50*100 (ng/ul) 用OD260/OD280的比值衡量DNA的质量，DNA的比值在1.8左右为佳。大于1.8 RNA和蛋白质含量高, 小于1.8则是多糖含量高。抽提缓冲液和抽提裂解液不需灭菌，但要贮藏在4，一般不得超过两个星期（但也有在一个月后可使用的经历）。抽提缓冲液（PH7.5）1L： 0.35M 葡萄糖 69.36克 0.1M Tris-HCl 12.44克 0.005M Na2EDTA 1.86克 2%(W/V) PVP K-30 20克 0.1% DIECA 12克使用前加-巯基乙醇至0.2% , PH调至7.5。抽提裂解液(PH 8.0): 1L 0.1M Tris-HCl 12.44克 1.4M NaCl 81.816克 0.02 M Na2EDTA 7.45克 2% CTAB 20克 0.1% DIECA 1克 2% PVP K-30 20克加0.2%-巯基乙醇后调PH值至8.0。注意：1 DNA抽提的物品请勿和RNA抽提的相互混用。2 氯仿是具有强烈腐蚀性和挥发性，请勿用枪吸取，含氯仿的废液不要倒入水池3 -巯基乙醇有强烈刺激气味，并对人体有一定损害，操作时请在通风厨中进行防止在实验室中扩散并注意个人防护。4 若第一次调PH值，请找相关人员询问。由于缓冲液缓冲能力很强，请勿用PH计调。5 若第一次进行实验操作，请找相关人员询问各种仪器的使用，严禁新手独自使用大型离心机等大型仪器和精密仪器。6 所需耗材如50 ml，7 ml，1.5 ml管等自己准备,消毒灭菌7 用完仪器后请凳记，实验管，台面请及时清理。废弃物品请按有关规定处理8 本法同样适合于 微量法提取DNA,用量酌减. RNA 的提取（异硫氰酸胍法）称适量的材料（如有需要则液氮研磨），按40l/100 mg、 100mg/ml比例分别加入-巯基乙醇及变性液匀浆按1/10变性液比例加入2mol/L的NaAc，混匀；再加入等体积的24：1的氯仿/异戊醇，剧烈摇动混匀冰浴15min10000g，4离心15min取上清，加入1异丙醇，混匀-20，30min10000g，4离心15min弃上清，加入 DEPC处理的75%乙醇洗涤几次风干15 min，100 mg材料加40l DEPC水溶解1.4%常规琼脂糖胶检测，每点样孔3l RNA注：此方法是根据精编分子生物学实验指南略有改动，棉花RNA提取一般不用酚。其他可参照相应的试剂盒。 此处可以加入NaAc之后10000g，4离心10min取上清加入等体积氯仿/异戊醇,有利于去除多糖 此处可以用等体积的24：1的氯仿/异戊醇反复抽提，一般是2次。 也可以过夜，一般在这步就可将RNA放置-70长期保存。 没降解的标准为有28S、18S、5S三条带（叶片可能多一些），28S亮度大约是18S的两倍。A260：A2801.92.1纯度高，否则蛋白含量高。RNA=OD260*40*稀释倍数 (ng/ul)一、溶液的配制1. 变性液Buffer（100mlDEPC处理水）： 42 mmol/L 柠檬酸钠 1.235g0.83% 十二烷基肌氨酸钠 0.83g 2. 变性液（提取前配置）（4储存）：Buffer 33 ml异硫氰酸胍 25gPVP 4%（M/V） -巯基乙醇 1 mlEDTA 20 mmol/L3. 30.1%DEPC水（V/V）：搅拌混匀，或静置过夜，再高温灭菌。4. 75% DEPC处理的75%乙醇：按体积比加入0.1%DEPC水，乙醇应为未开封。二、器具的处理：RNA提取操作全程在超净工作台完成，实验前应将超净工作台用酒精棉球彻底搽一遍。所有塑料制品用0.1%DEPC水侵泡过夜，在高温灭菌，烘干备用。三、注意事项1 提前预冷离心机，实验前15分钟打开超净工作台 2 离心前一定要平衡好 3 氯仿具有强烈腐蚀性和挥发性，请勿用枪吸取，含氯仿的废液不要倒入水池4 2mol/L的NaAc的配制请询问相关人员.5 不要徒手接触与RNA提取相关的试剂和器具分子标记l AFLP标记的试验步骤实验步骤：1. 模板DNA制备（1） 双酶切目的DNA，选用EcoR/Mse两种酶，反应混合液按表1配制。先在37温浴3hr,再在65温浴3hr。表1：AFLP双酶切反应体系（总体积20l）组 分 Component 体积Volume10倍的反应缓冲液2.0lEcoRM（10U/l）0.3lMse（10U/l）0.3l基因组DNA（250ng in18l）5l灭菌双蒸水12.4l注：视不同公司的内切酶选择合适的反应缓冲液。可在此时进行接头的复性：表2：接头配方Mse接头（50） EcoR接头（） 100l 100M Mse.110l 100M EcoR.1100l 100M Mse.210l 100M EcoR.2180lddH2O复性的热循环条件为：65 10min 3710min 2510min 425min注：复性的接头可在20保存。（2） 用T4连接酶，将表3混合液加入酶切混合物，25连接2hr或室温下放置过夜表3：AFLP连接反应体系组分Component体积Volume连接缓冲液4.0lMse接头1.0lEcoR接头1.0l灭菌双蒸水13.6lT4连接酶（3u/l）0.4l总体积20l （3） 将连接产物稀释10倍，稀释好的产物和剩下的产物一起置20贮存。注：酶切反应后立即进行连接反应;连接产物放置太长时间将影响最后试验效果。2. 预扩增反应预扩增的PCR混合液的配制表4所示。PCR程序为20个循环：94 30s, 56 1min,72 1min.扩增反应在PTC-200上进行（下同）表4：AFLP预扩增PCR反应体系组分体积上一步稀释好的模板DNA50lMse引物（25ng/l）2.0lEcoR引物（25ng/l）2.0lMgCl2(50mM)0.6lTaq DNA polymerase(5u/l)0.08ldNTPs(2mM)1.0l10倍的反应缓冲液2.0l灭菌双蒸水7.32l总体积20.0l 扩增后，反应混合物稀释50倍，稀释好的产物和剩下的产物一起置20贮存。稀释好的产物为下一步扩增反应的模板。3. 选择性扩增选择性扩增混合液配制见表5。PCR程序为：第一个循环是：94 30s,65 1min, 72 1min；第2到13个循环，DNA退火温度每次递减0.7，其余步骤同第一个循环；第1436循环，退火温度是56，其余步骤同第一个循环（VOS,1995）。表5：AFLP选择性扩增PCR反应体系组分体积上一步稀释好的模板50lEcoR引物（10ng/l）2.0lMse引物（10ng/l）6.0lMgCl2(50mM)0.6lTaq DNA polymerase(5/l)0.2ldNTPs(2mM)2.0l10倍的反应缓冲液2.0l灭菌双蒸水2.2l总体积20.0l 扩增反应结束后，取4l扩增产物在1.5的琼脂糖胶上检测20min-30min,如果产物为一条横跨溴酚兰的弥散（Smear）则可以继续下一步实验。注： 若实验的目的对于带的数量没有太多的要求，可将两步的退火温度都提高，在水稻上60的退火温度得到很好的效果（陶爱林，私人交流）。 引物的比例对于实验结果没有太大的影响，为节约起见，EcoR或Pst等六碱基识别酶的选择性引物不要超过30ng/反应。原始手册上引物的比例为E:M=1:6聚丙烯酰胺凝胶电泳准备工作：反硅化液稀释液（95%无水乙醇，0.5%冰醋酸，4.5%ddH2O）,4保存。10%的过硫酸胺（AP）:1克过硫酸胺溶于10ml双蒸水中，置于4保存。6%丙烯酰胺凝胶母液：420克尿素，200ml5TBE，57克丙烯酰胺，3克N,N-甲叉二丙烯酰胺，加dH2O至1000ml，过滤后在4保存。5TBE：54克Tris-Base，27.5克硼酸，EDTA为3.72克，加dH2O水溶解定溶至1000ml.变性PAGE凝胶的制备：1. 用洗涤剂将两块玻璃彻底清洗干净，晾干。2. 以面巾纸用无水酒精将玻璃板清洗一遍，可以处理2次。3. 粘胶玻璃板的处理：用面巾纸均匀的将1ml的反硅化液（1ml反硅化液含2ul反硅化剂和1ml反硅化液稀释液）。放置3min后用无水乙醇轻轻擦洗以除去多余的反硅化液。4. 不粘胶玻璃板的处理：均匀滴35滴硅化液于玻璃板上，迅速用面巾纸涂抹均匀。放置3min后，用无水乙醇轻轻擦洗以除去多余的硅化液。5. 用酒精将边条擦拭一下后，把边条放置在小玻璃板的两边，小心的将大玻璃板扣在小玻璃板上，两边用夹子在边条上夹紧。6. 用有色胶带在两边和底边粘紧，特别要注意底边的两个角要重叠粘好，以防漏胶。（也可以不粘胶带，以极微小的倾斜角灌胶）7. 按60ml6%丙烯酰胺凝胶母液+390ulAP+39ulTEMED的比例配制凝胶液混匀，沿玻璃棒将溶液注入两块玻璃板空隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部。将鲨鱼齿梳子的边缘用酒精擦净后小心的插入（最好先以一端先插入，然后全部插入，可以防止产生气泡）。8. 聚合2hr以上即可电泳。变性PAGE凝胶电泳：1. 撕去胶带，小心的取出梳子。2. 用自来水冲洗胶上部的表面，将梳子处吸附的胶冲洗干净，并把玻璃板冲洗干净以免散热不均匀。3. 下槽加入450ml左右1TBE后，将凝胶模具装上电泳装置。上槽加入480ml1TBE.4. 以恒功率75W电泳30min直到电压回升（此处的参数推荐为SSR电泳使用）。5. 在PCR产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，沸水变性5min后，立即放置于冰水混合物中冷却至少3min以上。6. 预电泳结束后，用注水器冲洗凝胶的上表面以冲走析出的尿素和碎胶，插上梳子。7. 点样5ul，注意不要串样，并要求尽快点完。8. 盖上上槽盒，在恒电压1800伏下电泳1.5Hr，终止电泳。9. 取下玻璃，用自来水冲洗降温。将长玻璃板朝下，将两块玻璃板分离开来，然后放入固定液中固定。染色方法一：试剂的准备：固定液（10%冰醋酸）： 150ml的冰醋酸加入到1350ml的ddH2O中。染色液（1g/LAgNO3，0.056%甲醛）： 加入2gAgNO3和3.0ml37%甲醛至2LddH2O中。显色液（30g/LNa2CO3，0.056%甲醛，2mg/LNa2S2O3.5H2O）:把60克Na2CO3溶于2LddH2O中，在410 冷却。在使用前几分钟，加入3ml37%甲醛和400ul浓度为10mg/ml的硫代硫酸钠）。染色过程：1 定。将粘附胶的长玻璃板放置于固定液中，置于摇床上振荡30min，直至二甲苯青全部消失即可。如果要过夜则不需要振荡。2 漂洗。将玻璃板放置于ddH2O中，漂洗2min，将玻璃板取出，稍微沥干，重复处理2次。3 染色。将玻璃板放入准备好的装有染色液的塑料盒中，放在摇床上振荡，染色30min。# 此时应将显色液放入冰浴中进行冷却。4 在染色将结束时，在清洗塑料盒中加入ddH2O；将3ml37%甲醛和400ul浓度为10mg/ml的硫代硫酸钠加入冰却好的显色液中,混匀。将1L配好的显色液倒入显影塑料盒中。5 漂洗。将玻璃板从染色液中取出，在清洗盒中迅速漂洗一遍，时间应严格控制在510秒内。若漂洗的时间过长，可返回染色步骤再继续染色25min.6 显色。将玻璃板放入显色液中，轻轻摇动至第一条带出现，倒掉已经上色的显色液，更换另一半显色液，继续轻轻摇动，一般上部显色，应对带弱的部分尤其是下部着重进行显色，至条带清晰可见，放入固定液终止显色反映。轻轻摇动2min后，在将玻璃板用ddH2O漂洗3min.染色方法二：试剂的准备：固定液（10%已酸+0.5%冰醋酸）：150ml的已酸和7.5ml冰醋酸加入到1342.5ml的dH2O中。Na2S2O3贮备液：10mg/ml Na2S2O3贮备液用于控制背景。染色液（0.2%AgNO3）： 加3gAgNO3到1.5LdH2O中。显色液（1.5%NaOH，0.4%甲醛）:把22.5克NaOH溶于1.5LdH2O中，在使用前几分钟，加入6ml37%甲醛。染色过程：1 固定。将粘附胶的长玻璃板放置于固定液中，置于摇床上振荡6min，处理2次。如果要过夜则不需要振荡。2 漂洗。将玻璃板放置于dH2O中，漂洗3min，将玻璃板取出，稍微沥干，重复处理2次。3 在1.5LdH2O中加入3ml的10mg/ml Na2S2O3贮备液，形成0.002%（W/V）硫代硫酸钠漂洗液，漂洗玻璃板2min。4 染色。将玻璃板放入准备好的装有染色液的塑料盒中，放在摇床上振荡，染色1215min。5 在染色将结束时，在清洗塑料盒中加入dH2O；将6ml37%甲醛加入显色液（1.5%NaOH）中,混匀并倒入显影塑料盒中。6 漂洗。将玻璃板从染色液中取出，在清洗盒中迅速漂洗一遍，时间应严格控制在35秒内。若漂洗的时间过长，可返回染色步骤再继续染色25min。7 显色。将玻璃板放入显色液中，轻轻摇动至条带出现（一般以Marker来定显影时间）。8 定影。放入定影液终止显色反映。轻轻摇动5min即可（此步可省）。9 冲洗。用自来水冲洗玻璃板10sec。SSR标记：SSR反应体系：组分： 体积DNA(10ng/ul) 2ul正向引物（25uM） 0.12ul反向引物（25uM） 0.12ulTaq DNA polymerase(2.5U/ul) 0.2uldNTPs(10mM) 0.2ul10Buffer 1.0ulddH2O 6.36ulPCR扩增程序：94 3min,94 1min, 58 55sec, 72 1min, 34cycle,7210min4 保存PAGE电泳：6%PAGE(含1TBE)，1800V电压75W功率电泳。SRAP标记：SRAP反应体系：组分： 体积DNA(20ng/ul) 3ul正向引物 30ng反向引物 30ngTaq DNA polymerase(2.5U/ul) 0.4uldNTPs(10mM) 20ul10Buffer 2.0ulddH2O 加至总体积为20ulPCR扩增程序：94 2min,94 1min, 35 1min, 72 1min, 4cycle,94 1min, 50 1min, 72 1min, 34cycle,72 5min4 保存PAGE电泳：6%PAGE(含0.5TBE)，2000V电压预电泳至30mA, 上样5ul后2500V恒压电泳1.52hr。染色：使用方法一（参考吴冠芸等的方法）Southern blotting实验前准备工作：5X TBE溶液配制：约800ml蒸馏水中加入Tris-base54g，硼酸27.5g，充分溶解后加入0.5M EDTA（pH:8.0）定溶到1000ml，于室温下短期存放。1将DNA稀释至500ng/l,并电泳检测。欲转到同一张膜上的DNA浓度是否一致，若亮度差异太大，则应进行进一步的浓度校正。2在200l微量离心管中加入25lDNA样品，6.5l限制性内切酶（MBI，10Ul）T8l相应的buffer，上加一滴矿物油覆盖，在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37水浴1618小时。3取5l酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上,检测酶切是否充分。4于DYY34A型电泳槽中制备3/4块0.8%的1X TBE琼脂糖凝胶,需要胶260300ml。5向每个样品中加入5l溴酚蓝上样缓冲液，混匀后稍微离心后点样。（样品多时点样要迅速，以防先点的样品DNA在胶中扩散；点样时不主张加混有二甲苯菁的上样缓冲液，因为它影响染色后的照相效果；点样时要注意Marker最好采用不对称点样，以便在X光片上确定样品顺序，同时Marker的点样孔使用其配套的上样缓冲液，其中有二甲苯菁以便确定凝胶的正反面。）6点样后在1X TBE电泳缓冲液中250V高压电泳10分钟后把电压调至40V电泳1214小时，这时溴酚蓝已离开点样孔10cm左右。7将胶置于装有EB的瓷盘中染色1520分钟，在紫外灯下用塑料板切除多余的凝胶，凝胶点样孔一端及两侧应留出2mm左右，溴酚蓝一端要保留溴酚蓝作为变性处理的显色指示。（这一步非常重要，如果样品酶切不充分、电泳泳道不直、样品间相互弥散或样品间DNA量差异太大都不能再往下做，要找出原因后重新再做。最好把待Blot的凝胶规格控制在其宽度或长度之一为10cm，因为我们使用的尼龙膜的规格为30cm3m这样不至于浪费昂贵的尼龙膜，同时酶切的DNA smear长度达10cm时各片段也能得到很好的分离。）Southern Blotting onto Hybond- N+Nylon MembraneHybond-N+ Nylon Membrange,0.45 1pore size,20 cm30m rolls available from Amersham(Cat.#RPN.203B)实验前准备工作：酸变性液和碱变性液的配制：Depurination solution:11 ml HCl989ml distilled waterMix.store at room temperature for up to 1 month.Denaturation buffer87.66g NaCl20g NaOHAdd approximately 800 ml of distilled water.Mix to dissolve.Make up to a final volume of 1000 ml.Store at room temperature for up to 3 month.1将切好的胶夹在两块软塑料板之间，小心翻转180度，使胶底面向上。2将胶放入20X30cm的