氮素营养调控拟南芥开花诱导相关基因表达的研究-硕士论文

分类号： 塑垒墨 密级： 洳：j 潼 单位代码： ! Q 墨墨墨 学号：2 0 8 1 4 0 8 8 硕士学位论文 中文论文题目：氢塞萱羞塑丝壑直莶五垄透昱塑羞薹固塞 ， 达的研究 英文论文题：T h eS t u d yo fN i t r o g e nN u t r i t i o nR e g u l a t i o no f F l o w e r i n gI n d u c t i o nR e l a t e dG e n eE x p r e s s i o n i 壁4 堡垒i 鲤垒罂苎i 查丝鲤! l 鲤丝堡 申请人姓名： 韭友塑 指导教师： 一左 莲数援 专业名称：植物萱羞堂 研究方向： 撞堑萱差生理盏佥壬生堑 所在学院： 巫境生盗遭堂瞳 论文作者签名：毯友幽 指导教师签名： 论文评阅人1 ： 评阅人2 ： 评阅人3 ： 评阅人4 ： 评阅人5 ： 答辩委员会主席： 昌垩数握 委员1 ： 隆二定硒究旦 委员2 ： 童丞松教援 委员3 ： 左莲数援 委员4 ： 挞盛丞数援 委员5 ： A u t h o r SS i S u p e r v i s o r E x t e r n a lR e v i e w e r sl ： 圣h 盟g g i 塑塾 E x t e r n a lR e v i e w e r s 2 ：y 也圣h Q 坠gM i E x t e m a lR e v i e w e r s 3 y 曼i Y Q 垒g 墨b i E x t e m a lR e v i e w e r s 4 ： E x t e r n a lR e v i e w e r s 5 ： E x a m i n i n gC o m m i t t e eC h a i r p e r s o n ： E x a m i n i n gC o m m i t t e eM e m b e r s ： C o m m i t t e e l ： J u nL v C o m m i t t e e 2 ： 堑亟i 坠g h 星望 C o m m i t t e e 3 ： 至o 垒g 墨Q 旦g 圣h 盟g C o m m i t t e e 4 ： i 塾g 墅鱼坠g 。 C o m m i t t e e 5 ： X i 垦n Y Q 望g 曼i 堕 D a t eo fo r a ld e f e n c e ： 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘姿盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：弓次友爿习 签字日期： 2 。f 年多月f 2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝望盘堂 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权盘鎏盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：葫钦友祠 导师签名： 、 、 飞锄 | 签字日期：劢f f 年乡月f Z 日 签字日期：2 , ol1 年弓月侈日 本研究得到国家重点基础研究发展 计划( 9 7 3 计划) ( 2 0 0 7 C B 10 9 3 0 5 ) 资助、承浙江省教育厅科技项目资助 ( Y 2 0 0 9 0 9 8 15 ) T h ep r e s e n tr e s e a r c hw a sf u n d e db y N a t i o n a lB a s i cR e s e a r c hP r o g r a m o f C h i n a ( 9 7 3P r o g r a m ) ( 2 0 0 7 C B l 0 9 3 0 5 ) 、 f o u n d e db yM i n i s t r yo fE d u c a t i o no f Z h e ji a n gP r o v i n c eT e c h n o l o g yP r o j e c t s ( Y 2 0 0 9 0 9 8 1 5 ) 致谢 光阴飞逝，转眼间我在浙江大学两年半的研究生学习生涯即将接近尾声。回 首这一路的求学历程，感触颇多。它没有大学生活的丰富多彩，学习知识面的宽 广，却有着对专业知识的深入研究和探索。实验室就成了我学习和生活的中心， 很高兴能够在这个温暖的大家庭中快乐成长 首先，感谢我的导师方萍教授，恩师是一位治学严谨，知识渊博，求是创新 和和蔼可亲的老师。很感谢方老师在我研究生阶段实验上给予非常悉心的指导和 耐心帮助。在这两年多的时间里，方老师的言传身教将会让我受益终生。同时也 非常感谢方老师给予我生活上无微不至的关怀，将永远铭记在心。感谢方老师对 我的毕业论文提出宝贵的修改意见。借此机会，向恩师表示深深的谢意! 其次，感谢滕一波博后。她是一位学术认真，洞察力强，科研思维敏锐的师 姐。我很感谢师姐对我的实验和硕士论文上给予的细心指导，包括从论文的构思、 选题、论文的修改和定稿上投入的大量精力。借此，向一波师姐表示深深的感谢! 再次，感谢实验室的师姐李亚娟博士，她对我前期实验上给予了耐心的指导 和帮助，让我的实验能力有了很大的提高。同时还要感谢师兄腊贵晓，师姐方素 萍、史林娜和杨俞娟，师妹陈星，刘丽，师弟汪继兵，李田字。感谢我能和你们 一起生活在中南3 1 6 这个温暖的大家庭中。感谢室友刘文靖，薛巧云和李丹给予 的关心和鼓励，1 0 舍5 1 9 将是我们永远的免检寝室感谢大学同学孙嗣阳，徐 国锐，朱丽青，柴如山，黄莹。感谢你们让我感受到团结的力量。 最后，我要深深的感谢我的父母，感谢你们对我多年的养育之恩和辛苦付出， 感谢你们支持我的每一个决定。感谢妹妹和弟弟，让我们成为幸福快乐的五口之 家。 至此论文完成之际，我的心情无比激动，借此，感谢学院所有关心，帮助和 指导过我的各位领导，老师，同学和朋友。祝你们身体健康，心想事成! 张友润 2 0 1 1 年1 月1 1 日于浙大华家池畔 _ 。1 。- 。_ _ _ _ _ 。_ _ _ _ 。_ _ 。1 。1 。1 。1 目录 摘要I A b s t r a c t I 第一章文献综述一l 1 1 模式植物一一拟南芥1 1 1 1 拟南芥的一般生物形态学特征一l 1 。1 2 拟南芥的分子遗传学特征“2 1 2 拟南芥开花诱导的研究进展3 1 2 1 光周期途径( p h o t o p e r i o dp a t h w a y ) 一4 1 2 1 1 光受体4 1 2 1 2 光受体与生物钟之间的信号传导5 1 2 1 3生物节律钟“6 1 2 1 4 生物节律钟中的调节基因C 沙6 1 2 1 5C O 的下游基因7 1 2 2 春化途径( v e r n a l i z a t i o np a t h w a y ) 8 1 2 3 自主途径( a u t o n o m o u sp a t h w a y ) 。1 0 1 2 4G A 途径( G A p a t h w a y ) 1 2 1 2 5 其它环境因子对拟南芥开花的影响”1 3 1 3氮素营养对植物生长发育的影响1 4 1 3 1氮素营养的生理功能1 4 1 3 1 1 氨基酸和蛋白质的主要成分1 4 1 3 1 2 核酸的重要组分1 5 1 3 1 3 氮素是叶绿素的主要成分1 5 1 3 2 氮素营养的信号功能1 5 1 4 本论文问题的提出、技术路线及拟解决的问题”1 7 1 4 1 本论文问题的提出“1 7 1 4 2 技术路线18 1 4 3拟解决的问题2 0 第二章不同氮素水平调控拟南芥开花诱导相关基因表达的研究2 1 2 1 引言2 1 2 2 材料与方法”2 2 2 2 1材料”2 2 2 2 2 方法2 2 2 2 2 1拟南芥种子的处理2 2 2 2 2 2 试验设计2 2 2 。2 2 2 1 光照时间2 2 2 2 2 2 2 氮素营养条件“2 2 2 3 拟南芥种植方法和R N A 的提取、测定2 4 2 3 1拟南芥种植方法2 4 2 3 1 1 幼苗种植试验2 4 2 3 1 2 蛭石培养种植试验2 4 2 3 2R N A 的提取、测定2 4 2 3 3R T - P C R 2 5 2 3 3 1R T - P C R 反应体系2 5 2 3 3 2R T - P C R 反应条件2 6 2 3 4 ( 内参基因) A c t i n 和U b i q u t i n 的P C R 反应2 6 2 3 4 1P C R 扩增反应体系2 6 2 3 4 2P C R 扩增反应条件2 7 2 3 4 3 琼脂糖凝胶电泳仪分析( 以2 0 个样品为例) 2 7 2 3 5R e a l T i m eP C R 检测2 7 2 4 结果与讨论2 8 2 4 1长短日照不同氮素水平影响拟南芥开花差异“2 8 2 4 1 1 长日照不同氮水平拟南芥开花表型差异“2 8 2 4 1 2 短日照不同氮水平拟南芥开花表型差异2 9 2 4 1 3 长短日照不同氮素水平影响拟南芥开花时间差异3 0 2 4 1 4 长短日照不同氮水平拟南芥开花叶片数差异3 l 2 4 2 苗期( 2w e e k s ) 开花诱导相关基因的相对表达量分析( C O F L C ，S O C l 和刀) 3 2 2 4 2 1 长日照下不同硝态氮水平影响拟南芥开花诱导相关基因的相对 表达量3 2 2 4 2 2 短日照下不同硝态氮水平影响拟南芥开花诱导相关基因的相对 表达量3 4 2 4 3 讨论3 5 第三章不同氮素形态调控拟南芥开花诱导相关基因表达的研究3 7 3 1 引言3 7 3 2 材料与方法3 7 3 2 1材料”3 7 3 2 2 方法“3 7 3 2 2 1 拟南芥种子处理3 7 3 2 2 2 试验设计3 8 3 2 2 2 1 光照时间3 8 3 2 2 2 2 氮素营养条件3 8 3 3 拟南芥种植方法和R N A 的提取、测定3 9 3 3 1拟南芥种植方法3 9 3 3 I 1 幼苗种植试验3 9 3 3 1 2 蛭石培养种植试验”3 9 3 3 2R N A 的提取、测定3 9 3 3 3P C R 反应”3 9 3 3 4 电泳分析( 以内对照基因A c t i n 和U b i q u t i n 为例) 3 9 3 3 5 R e a l T i m eP C R 检测4 0 3 4 结果与分析4 0 3 4 1长短日照不同氮素形态影响拟南芥开花差异“4 0 3 4 1 1 长日照不同氮素形态影响拟南芥开花表型差异4 0 3 4 1 2 短日照不同氮素形态影响拟南芥开花表型差异4 1 3 4 1 3 长短日照不同氮素形态影响拟南芥开花时间差异4 1 3 4 1 4 长短日照不同氮素形态影响拟南芥开花叶片数差异4 2 3 4 2 苗期( 2w e e k s ) 开花诱导相关基因的相对表达量分析( C O 、F L C 、S O C l 浙江太堂亟堂位i 金塞 目显 和刀) ”：一4 3 3 4 2 1 长日照下不同氮素形态影响拟南芥开花诱导相关基因的相对表 达量”4 3 3 4 2 2 短日照下不同氮素形态影响拟南芥开花诱导相关基因的相对表 达量“4 5 3 4 3 讨论4 6 第四章全文总结4 8 参考文献5 0 摘要 开花是植物生命周期中的关键环节，近年来，通过对模式植物拟南芥开花诱 导的研究，探明了控制植物开花诱导的4 条主要途径：光周期途径、春化途径、 自主途径和G A 途径。植物的开花诱导除了受自身的遗传因子调控以外，还受其 它一些环境因子的影响，比如外界养分条件、水分状况等等。氮是植物生长所必 需的营养元素，是否会在转录水平上调控开花途径中相关基因的表达，从而抑制 或促进植物开花，相关研究尚未见报道因此，本研究以模式植物拟南芥 ( A r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 为试验材料，通过荧光定量P c R 研究不同氮素水平和不同氮 素形态处理下，拟南芥开花诱导相关基因，F L C 、S O C l 和刀的表达量，从而 揭示氮素营养调控植物成花的分子机制。本研究主要取得以下结果： ( 1 ) 以正常供氮水平4 2 5r n M N 0 3 - N 为对照，0 4 2 5m M N 0 3 - N 为低氮处理， 8 5m M N 0 3 - N 为高氮处理对拟南芥进行开花诱导相关基因表达影响的蛭石培养 试验。结果表明，低氮处理的开花时间明显晚于对照和高氮处理。进一步分析调 控拟南芥开花诱导相关基因的表达量，发现正常供氮水平下，C O 表达量明显高 于低氮处理，F L C 的表达量显著低于低氮处理；S O C l 和刀的表达量显著高于 低氮处理。这说明低氮胁迫降低了促进开花的相关基因C O 、S O C l 和刀的表达， 增强了抑制开花的相关基因F L C 的表达，最终抑制了开花综合效应基因S O C l 和刀的表达，从而延缓了拟南芥开花的时间。 ( 2 ) 在4 2 5m MN 的供氮水平下，分别以1 0 0 硝态氮、5 0 硝态氮+ 5 0 铵 态氮和1 0 0 铵态氮3 种形态氮源对拟南芥进行开花诱导相关基因表达影响的蛭 石培养试验。结果表明，硝态氮处理的拟南芥开花最早，铵态氮处理的拟南芥开 花最晚；调控拟南芥开花诱导的相关基因表达量在3 种氮源处理间具有明显差 异，硝态氮处理的C O 表达量明显高铵态氮处理；S O C l 的表达量在铵态氮处理 下最低，硝态氮处理下最高，而硝铵对半处理的居于两者之间；刀在三种氮源 处理间的表达没有差异。这说明铵态氮同样会降低促进开花的相关基因C O 和 S O C l 的表达虽然铵态氮的处理不影响刀的表达，但是最终抑制了开花综合 效应基因的表达，最终导致拟南芥开花时间延迟 关键字：拟南芥；开花诱导相关基因；不同氮素水平；不同氮素形态 n A b s t r a c t T h et i m eo ff l o w e r i n gi sc r u c i a l f o rp l a n tr e p r o d u c t i v es u c c e s s I n r e c e n ty e a r s ，i th a sb e e np r o p o s e dt h a tt h e r ea r ef o u rm a i np a t h w a y st o c o n t r o lt h ep l a n tf l o w e r i n gt i m ei nm o d e lp l a n tA r a b i d o p s i st h a l i a n a ： p h o t o p e r i o dp a t h w a y , v e r n a l i z a t i o np a t h w a y , a u t o n o m o u sp a t h w a ya n d G a p a t h w a y B e s i d e si t so w ng e n e t i cf a c t o r s ，P l a n t sb l o s s o mi n d u c t i o nc a n a l s ob ea f f e c t e db yo t h e re n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，s u c ha se x t e r n a ln u t r i t i o n c o n d i t i o n sa n dw a t e rc o n d i t i o n N i t r o g e n ( i sa ne s s e n t i a ln u t r i e n t e l e m e n tw h i c hi sr e q u i r e df o rp l a n tg r o w t h C a ni te v e n t u a l l yi n f l u e n c e f l o w e r i n gt i m et h r o u g hr e g u l a t i n gf o w e r i n gt i m eg e n e st r a n s c r i p t i o n l e v e l ? S of a r , s u c hi n v e s t i g a t i o nh a sn o tb e e nr e p o r t e d T h e r e f o r e ，i nt h i s s t u d y , w eu s er e a l t i m eP C Rt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fm a i n f l o w e r i n gi n d u c t i o nr e l a t e dg e n eC QF L C , S O C la n d F Tu n d e rd i f f e r e n t n i t r o g e nl e v e l sa n dn i t r o g e nf o r m ss u p p l yi nm o d e lp l a n tA r a b i d o p i s i s t h a l i a n at or e v e a lt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fn i t r o g e nn u t r i t i o n r e g u l a t i o nf l o w e r i n gi n d u c t i o n T h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) Av e r m i c u l i t ei n c u b a t i o ne x p e r i m e n tw a sc o n d u c t e dt os t u d yt h e i n f l u e n c eo fd i f f e r e n tn i t r o g e nl e v e l so nf l o w e r i n gi n d u c t i o nr e l a t e dg e n e e x p r e s s i o ni nA r a b i d o p s i s ，u s i n g4 2 5m M n i t r a t ea sc o n t r o lt r e a t m e n t ， 0 4 2 5m Mn i t r a t ea sl o wNt r e a t m e n ta n d8 5m Mn i t r a t ea sh i g hN t r e a t m e n t R e s u l t ss h o w e dt h a tf l o w e r i n gt i m ei nl o wNt r e a t m e n tw a s s i g n i f i c a n t l yl a t e rt h a nt h a ti nn o r m a la n dh i g hNt r e a t m e n t C o n s e q u e n t l y , w e a n a l y z e de x p r e s s i o n o f f l o w e r i n g i n d u c t i o nr e l a t e d g e n e i n A r a b i d o p s i s C o n t r a s tw i t hl o wNt r e a t m e n t ，i nn o r m a lNt r e a t m e n t ，t h e e x p r e s s i o no fC O w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r ；t h ee x p r e s s i o no fF L Cg e n e w a s s i g n i f i c a n t l yl o w e r ；t h ee x p r e s s i o n o fS O C la n dF Tw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e r I ti n d i c a t e st h a tl o wn i t r o g e ns t r e s sc o u l ds u p p r e s s t h ee x p r e s s i o no fC Ow h i c hi sak e yc o m p o n e n ti np h o t o p e r i o dp a t h w a y , w h i l ec o u l dp r o m o t et h e e x p r e s s i n go fF L Ci na u t o n o m yp a t h w a y s E v e n t u a l l y , t h ef l o w e r i n gi n t e g r a t i v ee f f e c tg e n eS O C la n dF Tw e r e i n h i b i t e db yl o wn i t r o g e ns t r e s s ，w h i c hd i r e c t l yc a u s e dd e l a y e df l o w e r i n g ( 2 ) Av e r m i c u l i t ei n c u b a t i o ne x p e r i m e n tw a sc o n d u c t e dt os t u d yt h e i n f l u e n c eo fd i f f e r e n t n i t r o g e n f o r m so n f l o w e r i n g r e l a t e d g e n e e x p r e s s i o n i n A r a b i d o p s i s ，u s i n g 10 0 n i t r a t e ，50 n i t r a t e + 50 a m m o n i u ma n d1O O a n m o n i u ma st h r e et r e a t m e n t sw i t h4 2 5m m o l LN R e s u l t ss h o w e dt h a tA r a b i d o p s i sf l o w e r e df i r s t l yi nn i t r a t et r e a t m e n t ， w h i l ef l o w e r e dl a t e s t l yi na m m o n i u mt r e a t m e n t C o n s i s t e n tw i t hi t ， e x p r e s s i o no ff l o w e r i n gi n d u c t i o nr e l a t e dg e n ev a r i e da m o n gt h et h r e e t r e a t m e n t s I nn i t r a t et r e a t m e n t ，t h ee x p r e s s i o no fC Ow a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a ti na m m o n i u mt r e a t m e n t ；t h ee x p r e s s i o no fS O C lw a s t h e l o w e s ti na m m o n i u mt r e a t m e n t ，a n dw a st h eh i g h e s ti nn i t r a t et r e a t m e n t M o r e o v e r , i na m m o n i u mn i t r a t et r e a t m e n t ，t h ee x p r e s s i o no fS O C lw a s n b e t w e e nn i t r a t ea n da m m o n i u mn i t r o g e n H o w e v e r , t h e r ew a sn o d i f f e r e n c eo fF T e x p r e s s i o na m o n gt h et h r e et r e a t m e n t s I ts u g g e s t st h a t a m m o n i u mc o u l da l s o s u p p r e s sC Oa n do n l y i n h i b i to n ef l o w e r i n g i n t e g r a t i v ee f f e c tg e n eS O C lb u tn o tF T , w h i c hf i n a l l yl e a d e dt od e l a y e d f l o w e r i n g K e yw o r d s ：A r a b i d o p s i st h a l i a n a ；F l o w e r i n gi n d u c t i o nr e l a t e dg e n e ； D i f f e r e n tn i t r o g e nl e v e l ；D i f f e r e n tn i t r o g e nf o r m I I I 第一章文献综述 1 1 模式植物一一拟南芥 1 1 1 拟南芥的一般生物形态学特征 拟南芥( A r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 在分类学上是属于十字花科拟南芥属，它是一 种广泛分布于亚洲、非洲、欧洲、澳洲和北美洲等地区的一种常见的野生型小草 ( M e y e r o w i t z ，EM ，1 9 8 7 ) 。虽然拟南芥与甘蓝、辣根、花椰菜等经济作物是同科 的，但是它并没有实际的实用价值和生产价值。在所有的高等植物中，拟南芥是 基因组最小，结构相对最简单的物种之一( 樊妙姬，1 9 9 3 ) 尽管拟南芥没有任 何经济价值，但是由于它的结构在植物界中是最简单的，因此，从2 0 世纪8 0 年代中期开始，拟南芥就被人们广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物 学等方面的科学研究中( 陈璋等，1 9 9 4 ) 。到目前为止，植物科学研究中有很多有 价值的发现大多数都是以拟南芥为实验材料所取得的。因此，拟南芥已经成为一 种典型的“模式”植物，并且被誉为植物界公认的“果蝇”( 郝林等，1 9 9 6 ；毛 健民等，2 0 0 1 ) 。 拟南芥是一种一年生且体型细小的草本植物。拟南芥会随着其生长环境或者 外界培养条件的变化而变化。它的生育周期很短，在正常条件下生长，一般生育 周期约为6 8 个星期。其植株比较矮小，株高约为1 5 3 0 c m ( M a r k sM D 等，1 9 9 7 ) 。 一般基生叶较多，基叶呈莲座状小叶，叶片呈长圆形或者椭圆形；在茎顶端为无 限花序，主茎上会生成分枝，并从主茎的最底部产生次生茎；拟南芥开出的花很 小，花瓣白色，直径约lm m ；一般雄蕊有6 枚，而雌蕊较多，呈圆柱状；子房 具有两心皮；长角是呈过线型，长约1 0 1 6m m ，在成熟时会开裂；而种子则呈 卵形，种子极小，长约lm i l l ，千粒重约0 0 2 9 ，成熟时一般是红褐色( 陈吉 龙，1 9 8 5 ) 拟南芥发育可以通过自交或杂交授粉，在开花两周以后，角果成熟， 每角果可以结3 0 6 0 粒种子( H u a n gH a i ，1 9 9 7 ) ，每株结籽多少是外界所供给的 营养条件和生育期的长短而异的一般最少可以结籽粒数目达数百粒，最多可达 数万粒( M e y e r o w i t z EM 等，1 9 9 3 ) 。而对于经济类作物如，小麦、玉米等的生长 期一般需几个月，这就使得遗传实验分析所耗费的时间较长。相比之下，拟南芥 的这一特有的生物学特性，决定了科学工作者在以它作为实验材料进行遗传实验 分析时，节省了很多宝贵的时间。 由于世界各地的地理位置和气候条件各不相同，使得拟南芥在不同的地方生 长，会出现具有地域性特点的形态。在自然条件下生长的通常为野生型。目前， 拟南芥被用作科学实验的野生型主要有三种，即C o l u m b i a 型、L a n d s b e r g 型和 W a s s i l e w s k i j i a 型。其中以C o l u m b i a 型( C o l 型) 是最为常用的科研实验材料( 郝 林，1 9 9 6 ) 。 1 1 2 拟南芥的分子遗传学特征 拟南芥有5 条染色单体，这5 条单体就组成了拟南芥的5 个连锁群。在拟南 芥单倍体核内的整个基因大约有2 5 0 0 0 个，而每个基因组大小有7 0 0 0 0 k b 个碱基 对( G o o d r i c h ，e t a l ，1 9 9 3 ) ，这也是目前为止我们所知道的高等植物中基因组最小 的植物，且基因组数目仅及果蝇的二分之一。目前，在拟南芥体内已有1 0 0 多 个单基因的变异可以用遗传的方法定位在这5 个单体连锁群上正是由于这些 变异位点的基因在参与了植物体内很重要的生理生化及发育过程中的调控，因 此，在克隆这些基因时，这些变异位点的遗传本质、分子机理和它们控制植物发 育的原理等，对于阐明植物的整个生长发育及其发育过程有着重大的意义。比如 在拟南芥花器官特异性基因的研究方面；某个基因调控的器官的特异性表达等， 这些变异位点的基因就为这种相互之间的关系找到了有力的分子证据( P r u i t tR E 等，1 9 8 6 ) 。 拟南芥体内的基因组虽然很小，但是其基因组的重复性也有不同程度的重复 性。一般可以分为高度重复、中度重复和低度重复。大量的关于基因组重复性方 面的实验表明，在拟南芥基因组中，能够有高度重复性顺序的占1 0 一1 5 ，中 度重复性的占7 5 ，低度重复顺序只占l 左右，而剩下的将近8 0 的基因组 D N A 基本上都是用来构建单拷贝基因的( 孟金陵等，1 9 9 5 ) 在低度重复中D N A 的重复比例自然就很低，这一重复性特点对分子生物学专家来说，就意味着能够 比较容易地克隆出感兴趣的基因，并对其进行研究，尤其是关于高等植物生长和 2 发育方面的基因研究。我们知道，在基因组中由于编码某一个具特定功能产物的 基因拷贝只能有1 个，若基因组中的某个基因的产物参与调控植物的个体形态发 育过程，当这个基因发生变异后，那么它的功能就得不到额外的拷贝基因的补偿， 这就会导致这个基因得不到表达，从而导致它的个体形态发生了变异。这就是为 什么科学实验者在人工诱变拟南芥种子后，就可以获得大量的种类各异的、形态 各异的和关系植物整个发育过程的各种变异性的植株( K i mJ Y 等，2 0 0 3 ) 。而这些 变异性植株为研究各种基因在植物整个发育中的所具有的功能及其调节提供了 良好的试验材料。这已经逐渐成为植物分子生物学家在了解植物体内调控生长发 育的特定基因的结构、表达与调控最重要的模式系统之一。 1 2 拟南芥开花诱导的研究进展 在二十世纪九十年代，K o o r n n e e f 第一次提出在拟南芥体中发现了有1 1 个可 以控制开花的基因遗传位点，这一结果的公布，意味着这在植物开花时间调控的 研究史上具有里程碑式的重大意义。从那以后，全世界各个国家的科学家就开始 致力于这些调控开花的基因的克隆、其基因功能研究以及新的开花基因的探索、 其基因功能的分析以及这些控制开花基因之间的相互关系的研究( 张素芝 等，2 0 0 6 ) 。到目前为止，科学家认为高等植物的开花诱导同时由遗传因素和外 界环境因素共同决定的，同时也受错综复杂的网络信号传导途径的调控( H u a n gT 等，2 0 0 5 ) 。最近几年，随着拟南芥、水稻等实验材料的突变体的培育成功，被鉴 定出的开花突变体也逐渐增多，这就为挖掘控制开花诱导途径中的相关基因研究 提供了很好的实验材料。随着拟南芥开花过程中起重要作用的调控基因被克隆以 后，使得这个复杂的网络状信号传导途径被逐渐揭开( K o m e d aY 等，2 0 0 4 ) 。大 量的研究表明，拟南芥在开花诱导过程中主要是受四种反应途径调控，即：光周 期途径( p h o t o p e r i o d p a t h w a y ) 、春化途径( v e r n a l i z a t i o np a t h w a y ) 、自主途径 ( a u t o n o m o u sp a t h w a y ) 和G A 途径( G a p a t h w a y )( 张素芝等，2 0 0 6 ) 这四种途径 都是通过一些主要的开花基因如S O C l ，F L C C O 、F T F L D 和C C A 等的表达， 从而实现对拟南芥开花时间上的调控 1 2 1 光周期途径( p h o t o p e r i o dp a t h w a y ) 光周期途径也称为长日照途径( t h el o n gd a yp a t h w a y ) ，它是植物对外界环境 中的光信号做出的反应，从而促进植物开花。在植物生长发育过程中，光周期是 一个很重要的影响条件，而且植物的整个生命过程都是在光周期的影响下完成 的。在上个世纪二十年代G a r n e r 和A l l a r d 就证明了光周期是影响植物开花时间的 重要条件( G A M E RWW 等，1 9 2 0 ) 。我们都知道，自然界中植物由于自身遗传 因素各异，导致它们对光照时间也是不一样的。根据光照时间的不同，可以将植 物分为长日照植物和短日照植物所谓长日照条件可以促进开花，短日照则会抑 制开花。而拟南芥是一个典型的长日照植物。到目前为止，光周期途径是人们对 拟南芥开花诱导四种途径中研究最为完整和清楚的一条途径( P u t t e r i l lJ 等，2 0 0 4 ) 。 随着大量光周期途径中的基因及功能被鉴定出，有关光周期途径诱导植物开花的 研究也就意味着取得了很大的突破 1 2 1 1 光受体 在拟南芥开花诱导的光周期途径中，接受光信号是通过叶片中的光受体来感 受光信号的。而光受体在光周期途径中有两个重要的作用：一是有着复位生物节 律钟的作用，使得关键的调节组分能够产生昼夜振荡；二是能够对关键组分的活 性进行一定的调节与控制作用( I M A I Z U M I T 等，2 0 0 6 ) 。而根据吸收光谱的不同， 可以将植物体叶片中感受光信号的光受体分为三大类：光敏色素、隐花素和向光 素。光敏色素( p h y t o c l l r o m e ) 能够吸收红光和远红光；隐花色素( c 叮t o c l o m e ) 可以 吸收蓝光和紫外光；向光素( p h o t o t r o p i n ) 对蓝光依赖的向光性有一定的反应。而 在拟南芥体的中，至少存在三类中的九种光感受体( Y o os K 等，2 0 0 5 ) ，它们分别 是：五种光敏色素，即删P H Y B ，P H Y C P H Y D 柳扔僵；两种隐花色素， 即积w C R Y 2 ；两种向光素层F P h o t l 和P h o t 2 。这些光受体都能够调节植物感受 光信号的大部分光反应，其中光敏色素和隐花色素在调节植物的开花方面起着重 要的作用( 赵淑清等，2 0 0 9 ) 拟南芥中感受光受体的光敏色素中的P 日翻具有着 促进开花的作用；而它的突变体p 彬植株在长日照( L D ) 条件下比野生型的开花 要晚，但是在短日照的( S D ) 条件下，它是突变体却与野生型的开花时间基本一 致，这充分说明了长日照的条件反而抑制了p h y h 突变体的表达，从而抑制了它的 4 正常开花( B r i g g sWR 等，1 9 9 9 ) 。P H Y B 是在植物红光途径中起着调节的作用，对于 长日照和短日照条件下的开花启动起着抑制的作用( S u a r e z L o p e zP 等，2 0 0 1 ) 。但 是，p h y AJ p h y B 双突变体植物却比单基 p h y A 突变体开花的要早，而且在某些 条件下，这个双突变体的开花时间反而与p h y B 单基因突变体几乎保持同步，这就 意味着P H Y B 抑制了P H Y A 功能上的表达( L I NC 等，2 0 0 0 ) 而对于p 矗) ，D 和p 伽两 个单基因的突变体并没有出现明显的开花表型的异常性，但对- T - p h y B p h y D 和 p h y B p h y E 这两个双基因突变体在无论在长日照条件下还是在短日照条件下均 比p h y B 单基因的突变体要提前开花，这也说明引砚砂，腓与P 日】召一样也是属 于抑制植物开花的光敏色素( J O H N S O NE 等，1 9 9 4 ) 。而对于拟南芥