毕业设计（论文）-多穗柯甜茶的质量标准研究.doc

学科分类号 0710 本科生毕业论文题目（中文）：多穗柯甜茶的质量标准研究 （英文）：The Study to the Quality Standard ofLithocarpus litseifolius (Hance) Chun 学生姓名： 学号：系别：生命科学系专业：生物科学专业指导教师： 起止日期：2014.32015.4 年 月 日怀化学院本科毕业论文诚信声明作者郑重声明：所呈交的本科毕业论文，是在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，论文不含任何其他个入或集体已经发表或撰写过的成果。对论文的研究做出重要贡献的个入和集体均已在文中以明确的方式标明。本声明的法律结果由作者承担。本科毕业论文作者签名：年 月 日目 录摘 要I关键词IKey wordsII1 前言11.1 多穗柯的作用11.2 主要化学成分12.3 本实验目的及意义22 材料与方法22.1实验材料22.1.1多穗柯样品采集与处理22.1.2 仪器与设备32.1.3 试剂与药品32.2 实验方法32.2.1 黄酮含量的考察32.2.2 总多酚含量的考察32.2.3 总灰分考察42.2.4 水不溶性灰分考察42.2.5酸不溶性灰分考察43.1总黄酮含量分析53.2总多酚含量分析53.3总灰分含量分析53.4水不溶性灰分含量分析63.5酸不溶性灰分含量分析64讨论7参考文献7致 谢10多穗柯甜茶的质量标准研究摘 要目的：研究多穗柯甜茶的质量标准，为穗柯甜茶的质量控制提供依据。方法：用茶烘焙法处理的新鲜多穗柯成年叶和嫩叶为材料，采用氯化铝比色法以芦丁为标准品测定多穗柯甜茶中的总黄酮含量；参照GB/T 8313规定测定总多酚含量；参照GB/T8306规定测定总灰分含量、参照GB/T 8307测定水不溶性灰分、参照GB/T 8308测定酸不溶性灰分含量。结果：不同时间采集于湖南芷江野生甜茶厂栽培基地的三批成年叶制成的甜茶黄酮含量不低于8.52%，多酚含量不低于10.10%，总灰分、水不溶性灰分、酸不溶性灰分含量分别不高于4.96%、1.98%、0.29%；嫩叶制成的甜茶黄酮含量不低于9.24%，多酚含量不低于10.21%，总灰分、水不溶性灰分、酸不溶性灰分含量分别不高于4.99%、2.24%、0.19%。结论：所研究的质量标准能为多穗柯甜茶质量控制提供有效的依据。关键词多穗柯；质量标准；总黄酮；总多酚；灰分The Study to the Quality Standard of Lithocarpus litseifolius (Hance) ChunAbstractObjective: To study the quality standard of Lithocarpus litseifolius (Hance) Chun and provide basis for controlling the quality standard of litseifolius. Methods: Taking the fresh adult leaves and tender leaves witch is treated by curing as materials, ussd rutin as standard to determine the total flavonoids content with Aluminum chloride colorimetry; content of total polyphenol were determined referred to the rules of GB/T 8313; determined the content of total ash referred to the rules of GB/T8306, determined the content of insoluble ash referred to the rules of GB/T8307, determined the content of acid-insoluble ash referred to the rules of GB/T8308. Results: Three bathes sweet tea were collected from the cultivation base of ZhiJiang wild sweet tea factory on different month. The total flaconoides content of sweet tea made by adult leaves were not under 8.52%, total polyphenol content were not under10.10%, the content of total ash, insoluble ash, acid-insoluble ash were not over 4.96%,1.98%,0.29% respectively. The total flaconoides content made by tender leaves were not under 9.24%, total polyphenol content were not under10.21%, the content of total ash, insoluble ash, acid-insoluble ash were not over 4.99%、2.24%、0.19% respectively. Conclusion: The study to quality standard can provide effective basis for the control of litseifolius quality.Key wordsLithocarpus litseifolius (Hance) Chun; Quality Standard; Total Flavonoid; Total Polyphenol ; AshII1 前言多穗柯(Lithocarpus polystachyus Rehd.)，又叫甜叶子树、胖稠、甜味菜、大叶稠子、甘茶、多穗石柯等，是壳斗科栎属的一种常绿乔木12。多穗柯主要以野生状态分布在我国长江以南省区的低山密林中，尤其以江西、广西、湖南、安徽等省资源丰富，在湖南主要分布于雪峰山一带3。1.1 多穗柯的作用多穗柯兼具茶、糖、药三种功能，嫩叶可采摘加工制成甜茶饮品，并且具有高甜、低热和无糖的特点。多穗柯甜茶在民间已有上千年的使用历史,在降血糖、调血脂及降血压方面也有独特的疗效。据文献报道,多穗柯叶有清热利湿的功能,可治湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮4;叶煎服可治高血压5。多穗柯具有明显的降血糖作用，其中的总黄酮具有改善链脲菌素或四氧嘧啶诱发的高血糖和糖耐量作用6 ，对型糖尿病和型糖尿病都有显著改善作用7。多穗柯乙酸乙酯、水相提取液都能降低小鼠血糖和小鼠血清中的丙二醛(MDA值)，可使小鼠血清中的过氧化氢酶（CAT值）恢复。多穗柯提取液具有降血糖功效，对糖尿病小鼠具有一定的调节保护作用8。有实验用多穗柯嫩叶提取的甜味剂进行大鼠降血脂实验证实有降胆固醇和甘油三脂的作用,并能延长凝血时间,减少血粘度作用9。有研究证明多穗柯中的总黄酮有一定的抑菌效果，且70%的乙醇提取液的抑菌效果最明显10。李晚谊11等发现多穗柯甜茶的醋酸乙酯组分抗过敏作用最强,对透明质酸酶的抑制率为70%，抗过敏的活性成分可能是黄酮。多穗柯叶片中的三个化合物三叶苷 2 醋酸盐，根皮苷和三叶苷，在体外有较弱的抗氧化活性12，其中根皮苷在体内能被水解脱去糖苷基生成根皮素，具有更好的抗氧化能力13。多穗柯中的根皮苷可以促进大小鼠的学习和记忆能力，并有拮抗胰岛素减弱记忆保持的能力14。曾宪彪15用多穗柯提取液对大鼠灌胃进行长期毒性研究发现大鼠除有可逆性肝中毒改变外，未见明显的其他毒性反应，可见多穗柯基本无毒副作用。1.2 主要化学成分近年来，全国各地的学者对多穗柯的化学成分进行了较深入的研究。王日为等16通过对湖南野生甜茶及初制品的水浸出物等常量成分测定表明，甜茶的甜味不是可溶性还原糖提供的。多穗柯的化学成分主要是黄酮类和三萜类化合物17，李胜华18等学者通过研究不同时间多穗柯中黄酮总含量动态变化表明其叶片中的黄酮类化合物的含量高达10.6 %左右。目前已有人鉴定出多穗柯中至少含22种黄酮类物质，而黄酮类中的根皮苷、三叶苷和 3 羟基根皮苷正是多穗柯的主要甜味成分11,1924。周文华25从湖南甜茶中分离到二氢查尔酮-2-D葡萄糖甙和二氢查耳酮4-D葡萄糖甙这两种含量极高的天然甜素，总含量达到12.6%。李胜华等人对多穗柯醇提物进行分离纯化，鉴定出其中含有根皮苷、根皮素、二氢查尔酮-2-D -吡喃葡萄糖苷、胡萝卜苷、-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、槲皮苷及齐墩果酸等9种化合物。Henry.R.Arthur等26在上世纪七十年代研究发现，多穗柯茎和叶中含有结构类型主要为齐墩果烷和达玛烷环菠萝蜜烷等的三萜类化合物。廖晓峰27对多穗柯甜茶浸提液进行全面分析，证明了其富含多种人体必需的微量元素、维生素及16种氨基酸，并发现了多穗柯甜茶中咖啡碱含量比普通绿茶低，总多酚和黄酮的含量都要高于绿茶。1.3 本实验目的及意义多穗柯在我国民间作为茶、药使用已有上千年的历史，随着入们生活水平的提高，像多穗柯甜茶这类高甜、低热、无糖的天然健康食品日益受到广大消费者的青睐。近年来，多穗柯甜茶的应用范围日渐扩大，除茶、药两用外，还被加工制成甜味剂、色素等食品添加剂和各种保健食品。据初步考察，我国年产多穗柯干嫩叶1000吨左右9。我国对多穗柯甜茶的科学研究起步较晚，发展缓慢，近几年才呈现出增长趋势28，在食用和药用价值两方面的开发及利用上取得了很大的进展。如今我国多穗柯甜茶产量日益增加，但对多穗柯的研究多集中于多穗柯的化学成分及药理作用分析两大方面，质量控制方面的研究太少，只有黄松等学者曾对采摘于湖南的六批多穗柯甜茶的总黄酮和根皮苷质量进行研究，通过紫外分光光度计测得其总黄酮含量在103.12183.54 mgg- 1之间，用高效液相色谱法测得根皮苷含量在0.09981.1976g范围内与峰面积积分值呈良好线性关系29；廖晓峰27等曾通过对江西野生多穗柯甜茶成分的分析,证明了其总灰分含量为42.4 mg/g，水不溶性灰分含量有26.8 mg/g，富含多种营养物质及入体必需的微量元素和维生素,并因富含二氢查耳酮新型甜味剂而有独特的甜茶特色。这些学者的研究为大力开发的天然野生植物多穗柯资源的质量标准建立提供了一定的科学依据，但不足以作为建立多穗柯甜茶的质量标准的充分依据。黄酮是带给多穗柯甜茶特色的一类化合物，多穗柯所具有的多种药理功效都是黄酮类化合物所起的作用。甜茶也是一种别样茶，而多酚是茶叶色香味的主要成分之一，也是茶叶中保健功能的主要成分之一。灰分反映的是食品或药品本身的无机盐含量，灰分检测是对产品纯度检测的一种方法。本文对湖南芷江产甜茶的总黄酮，总多酚，总灰分，水不溶性灰分和酸不溶性灰分含量进行了研究，为多穗柯甜茶的质量标准建立提供更多的理论依据，也为甜茶开发利用提供更多的保证。2 材料与方法2.1实验材料2.1.1多穗柯样品采集与处理本实验采用的3批怀化多穗柯样品分别于2014年7月、10月、2015年4月采集于湖南怀化芷江，每次采摘有嫩叶（多穗柯茎尖24 cm新芽）和成年叶（新芽以下1-3片新叶，叶长1012 cm）两种样品。采摘后用流水洗净茶叶表面的泥沙，自然风干表面水分后在110 干燥箱内嫩叶杀青6 min，成年叶杀青10min，再置于65干燥箱中烘干至恒重，得到多穗柯成年叶和嫩叶制成的两种茶叶（后文分别用成年叶与嫩叶指代）。将烘干的茶叶粉碎，过60目筛，得到多穗柯甜茶磨碎样品，保存在干燥器中。2.1.2 仪器与设备UV-2450分光光度计；KA-1000离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；0.45 um滤膜（津腾实验设备有限公司）SX12-10型马弗炉（河北省黄骅市综合电器厂）；定量滤纸（杭州 特种纸业有限公司）FA2004N型分析天平；XT-1000A型粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）；420型恒温水箱（江苏金坛市中大仪器厂）。2.1.3 试剂与药品芦丁对照品（上海如吉生物科技发展有限公司，批号：140702）；没食子酸（天津市光复精细化工研究所）；福林酚试剂（上海如吉生物科技发展有限公司，批号：75260）；甲醇；乙醇；亚硝酸钠；氯化钠；氢氧化钠；碳酸钠；盐酸；水为蒸馏水。2.2 实验方法2.2.1 黄酮含量的考察制备标准曲线：称取干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，置 50 ml 容量瓶中，加 85 % 乙醇 30 ml，置于水浴上微热使溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，使之成为浓度为0.2 mg/ml 的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。精密吸取此对照液 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 分别置于25 ml量瓶中，加5 %亚硝酸钠溶液1.0 ml，摇匀放6 min 后，加 10 % 氯化铝溶液 1.0 ml，摇匀，放置6 min 后，加1.0 mol/L 氢氧化钠10 ml，最后各用 85 %乙醇稀释至刻度，摇匀，放置 15 min 。用第一瓶作空白，在510 nm 处测吸光度，以吸光度(y)作纵坐标，芦丁浓度(x)作横坐标绘制标准曲线，得出回归方程。样品中总黄酮提取18,30及含量的测定：索氏提取法，称取粉碎甜茶样品 2 g ，滤纸包好，用100 ml甲醇在80水浴中提取至提取器中液体近无色，旋转蒸发回收甲醇，滤纸过滤，用85 %乙醇将提取液定容至100 ml容量瓶中，得到待测液。精密量取3份1 ml 样品溶液至25 ml 的定量管，加5 % 亚硝酸钠1.0 ml，混匀，放置6 min，加5 % 的氯化铝1.0 ml，混匀，放置 6 min，加 1 mol/L 的氢氧化钠 10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，用分光光度法在 510 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算样品中总黄酮含量。2.2.2 总多酚含量的考察参照GB/T8313-2008茶多酚含量测定方法 31。标准曲线制备：精密称取没食子酸标准品0.110 g溶解于100 ml容量瓶中，再从100 ml容量瓶中取10 ml溶液溶于100 ml容量瓶中，制成浓度为100 g/ml的标准储备液。分别精密吸取标准储备液0 ml，0.4 ml，0.8 ml，1.2 ml，1.6 ml，2.0 ml，2.4 ml于25 ml刻度试管中，在每个试管内分别加入5 ml福林酚试剂，摇匀，反应3 min8 min内，加入4 ml 7.5 %碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀。室温下（25 左右）放置60 min。用10 mm比色皿在765 nm波长条件下用分光光度计测定吸光度，以吸光度(y)作纵坐标，没食子酸浓度(x)作横坐标绘制标准曲线，得出回归方程。样品中总多酚提取及含量测定：称取0.2 g均匀磨碎的试样于10 ml离心管中，加入在70 中预热过的70 %甲醇溶液5 ml，用玻璃棒充分搅拌均匀湿润，立即移入70 水浴中，浸提10 min（每5 min搅拌一次），浸提后冷却至室温，转入离心机在3500 rpm转速条件下离心10 min，将上清液转移至10 ml容量瓶。残渣再用5 ml 70%的甲醇溶液提取一次，重复以上操作。合并以上提取液并用甲醇定容至10 ml，摇匀，过0.45 um虑膜，得到母液。吸取三份0.1 ml的母液至25 ml刻度试管中，用蒸馏水做空白对照，在每个试管内分别加入5 ml福林酚试剂，摇匀，反应3 min8 min内，加入4 ml浓度为7.5%的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀。室温下放置60 min。用10 mm比色皿在765 nm波长条件下用分光光度计测定吸光度，根据标准曲线计算总多酚含量。2.2.3 总灰分考察参照GB/T8306-2013总灰分含量测定方法32。将三个50 ml和三个30 ml洁净的坩埚置于525 25 高温炉内灼烧 1 h，待炉温降至300 左右时，取出坩埚，于干燥器内冷却至室温，称量。分别称取三份5 g和三份2 g的干燥样品于50 ml和30 ml的坩埚内，在电热板上徐徐加热，使试样充分炭化至无烟。将坩埚移入 525 250 高温炉内，灼烧至无炭粒。待炉温降至 300 左右时，取出，置于干燥器内冷却至室温，称量。再移入高温炉内以上述温度灼烧 1 h，取出，冷却，称量。再移入高温炉内，灼烧30 min，取出，冷却，称量。重复此操作，直至连续两次称量差不超过0.001 g为止。以最小称量为准。2.2.4 水不溶性灰分考察参照GB/T8307-2013水不溶性灰分含量测定方法 33。用25 ml沸蒸馏水,将三份30 ml坩埚内的总灰分从坩埚中分别洗入100 ml烧杯中，加热至微沸,趁热用无灰滤纸过滤,用热蒸馏水分次洗涤烧杯和滤纸上的残留物,直至滤液和洗涤液体积达150 ml。将滤纸连同残留物移入原坩埚中,在沸水浴上小心地蒸去水分。移入高温炉内,以52525 灼烧至灰中无炭粒。待炉温降至300 左右时,取出坩埚,于干燥器内冷却至室温,称量。再移入高温炉内灼烧30 min,冷却并称量。重复此操作,直至连续两次称量差不超过0.001 g为止,即为恒重。以最小称量为准。2.2.5 酸不溶性灰分考察参照GB/T8308-2013酸不溶性灰分含量测定方法 34。用25 ml浓度为l0%的盐酸将三份50 ml坩埚中的总灰分分次洗入三个100 ml烧杯中，盖上表面皿，在沸水浴上小心加热，至溶液由浑浊变透明时，继续加热5 min。趁热用无灰滤纸过滤，用沸蒸馏水少量反复洗涤烧杯和滤纸上的残留物，直至中性（约150 ml）。将滤纸连同残渣移入原坩埚内，在水浴上小心蒸去水分。移入高温炉内，以525 25 灼烧至无炭粒为止，待炉温降到300 左右时，取坩埚，于干燥器内冷却至室温，称量。再移入高温炉内灼烧30min，冷却并称量，重复此操作，直至连续两次称量差不超过0.001 g为止，以最小称量为准。3 结果分析3.1 总黄酮含量分析表3.1 不同采收时间多穗柯叶总黄酮含量Tab.3.1 The total flavonoid in Lithocarpus polystachyus witch was collected in different time样品采集时间叶的类型黄酮含量（占干重百分比%）201504成年叶8.64 嫩叶9.24 201407成年叶8.75 嫩叶10.68 201410成年叶8.52 嫩叶9.86 由表3.1可知成年叶总黄酮含量在8.52%8.75%之间，嫩叶总黄酮含量在9.24%10.68%之间，不同时间嫩叶平均总黄酮含量比成年叶高出1.29 %。成年叶总黄酮含量应不低于8.52%，嫩叶总黄酮含量应不低于9.24%。黄酮类化合物是多穗柯的主要化学成分，也是成就多穗柯独特风味的一大类化合物，具有多种药理作用，所以应将总黄酮含量作为质量控制的重要指标。3.2 总多酚含量分析表3.2 不同采收时间多穗柯叶中总多酚含量Tab. 3.2 The total polyphenol in Lithocarpus polystachyus witch was collected in different time样品采集时间叶的类型茶多酚含量（占干重百分比%）201504成年叶10.44 嫩叶10.38 201407成年叶19.24 嫩叶13.45 201410成年叶10.10 嫩叶10.21 由表3.2可知成年叶所含总多酚的量在10.10%19.24%之间，嫩叶所含总多酚含量在10.21%13.45%之间，成年叶总多酚平均含量比嫩叶高出1.91%，成年叶最低含量应不低于10.10%，嫩叶最低含量应该不低于10.21%。多酚是从茶中提取出来的最主要、最精华、对人体最有益的成分,是由茶叶中的黄烷醇类、黄酮、黄酮醇类、花青素类、茶白素类和酷酸及缩份酸类组成的化合物 35。具有很强的抗氧化作用，因此应作为重要的质量控制指标。3.3 总灰分含量分析表3.3 不同采收时间多穗柯叶中总灰分含量Tab. 3.3 The total ash in Lithocarpus polystachyus witch was collected in different time样品采集时间叶的类型总灰分含量（%）201504成年叶4.96 嫩叶4.99 201407成年叶3.23 嫩叶3.13 201410成年叶3.48 嫩叶3.70 由表3.3可知成年叶总灰分含量在3.23%4.96%之间，嫩叶总灰分含量在3.13%4.99%之间。食品经灼烧后所残留的无机物质称为灰分，主要为食品中的矿物盐或无机盐类。食品除本身含有一定量的无机盐外，往往还粘附或夹杂有泥沙、尘土等，加工时时不易除尽，因此，应规定灰分限度。3.4 水不溶性灰分含量分析表3.4 不同采收时间多穗柯叶中水不溶性灰分含量Tab. 3.4 The insoluble ash in Lithocarpus polystachyus witch was collected in different time样品采集时间叶的类型水不溶性灰分含量（%）201504成年叶1.98 嫩叶2.24 201407成年叶1.35 嫩叶0.46 201410成年叶1.26 嫩叶1.53 由表3.4可知成年叶中水不溶性灰分的含量在1.26%1.98%之间，嫩叶的水不溶性灰分含量在0.46%2.24%之间。3.5 酸不溶性灰分含量分析表3.5不同采收时间多穗柯叶中酸不溶性灰分含量Tab. 3.5 The acid-insoluble ash in Lithocarpus polystachyus witch was collected in different time样品采集时间叶的类型酸不溶性灰分含量（%）201504成年叶0.29 嫩叶0.19 201407成年叶0.11 嫩叶0.05 201410成年叶0.12 嫩叶0.11 由表3.5可知成年叶酸不溶性灰分含量在0.11%0.29%之间，嫩叶的酸不溶性灰分含量在0.05%0.19%之间。4 讨论本研究表明，不同时间采摘的多穗柯甜茶夏季（7月）总黄酮含量最高，不同生长时间的叶中嫩叶的总黄酮的含量比成年叶的高，这与李胜华等学者对多穗柯总黄酮含量动态变化研究结果一致4。黄酮在植物体内合成代谢起源于光合产物，根据光合产物就近分配的特性，导致嫩叶中具有较高的黄酮含量，也导致夏季黄酮含量最高36。酚类物质的含量取决于植物的生长阶段和环境条件，李腾飞37等学者对四川王朗自然保护区缺苞箭竹总酚含量及变化规律研究发现其总酚含量多年生老叶当年生新叶笋，并认为这是因为笋组织幼嫩初级化合物刚刚形成,次生化合物含量相对较慢。莫燕霞38对不同生长期内茶叶中茶多酚含量的变化研究发现随着生长时期增长，茶叶中多酚的含量会逐渐增高，且不同季节以夏季含量较高。本实验得出了与上述研究类似的结果，成年叶中总多酚含量都比嫩叶中高，且夏季（7月）含量最高。植物生理灰分受生长环境、土质、水肥条件、种植习惯影响，样品洗净风干过程、碳化过程、灼烧后冷却的过程会对测量值产生影响。灰分反映的是食品和药品的纯度，灰分含量一般在一定范围内，超过一定范围说明有无机物污染甚至掺假。本实验中灰分含量没有呈现明显的变化趋势，但在国家标准规定的绿茶灰分含量范围内。本实验详细考察了多穗柯甜茶及其提取物的理化性质，不同时间采集于湖南芷江的三批样品成年叶总黄酮含量在8.52%8.75%之间，嫩叶总黄酮含量在9.24%10.68%之间；不同时间采集于湖南芷江的三批样品成年叶含10.10%19.24%的总多酚，嫩叶含总多酚10.21%13.45%；总灰分、水不溶性灰分、酸不溶性灰分含量成年叶分别在3.23%4.96、1.26%1.98%、0.11%0.29%之间，嫩叶分别在3.13%4.99%、0.46%2.24%、0.05%0.19%之间。实验最终得出怀化芷江产多穗柯甜茶成年叶质量标准为：总黄酮8.52%，总多酚10.10%，总灰分4.96%，水不溶性灰分1.98%，酸不溶性灰分0.29%；嫩叶质量标准为：总黄酮9.24%，总多酚10.21%，总灰分4.99%，水不溶性灰分2.24%，酸不溶性灰分0.19%。研究选择的材料采集时间是芷江多穗柯甜茶生产的主要季节。因多穗柯甜茶嫩叶与成年叶产量及其中黄酮、多酚等化学成分的含量与明显差别，嫩叶制成的甜茶经济价值比成年叶的高，因此本文针对多穗柯嫩叶与成年叶制成的两种甜茶研究了不同的质量标准。研究采用的总黄酮的提取方法及含量测定已有很多文献报道和研究，此方法简单、快速、高效，总多酚和灰分含量的测量都是参考绿茶的最新国家标准。因此本实验为湖南芷江产多穗柯甜茶的质量控制提供了有效的理论依据，但如需建立权威可行的质量标准，还需通过更多的实验来完善实验结果，本实验结果只适用于湖南芷江产多穗柯甜茶。参考文献1 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