色谱技术在药物分析的应用反相HPLC在药物分析中的应用.ppt

反相HPLC在药物分析中的应用（成都2019/09）曾伟杰leogzflmtechnicgzflm,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,方法开发前要确定的基本问题色谱柱的选择流动相的选择样品前处理的新方法色谱柱使用维护的建议,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,方法开发前要确定的基本问题2、混合分析物的主要差异疏水性差异-用疏水性选择性强的色谱柱极性差异-用具有极性选择性的色谱柱芳香性差异-用芳香选择性色谱柱混合差异-用多种选择型色谱柱分子量差异-GPC、GFC,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,方法开发前要确定的基本问题3、选用何种分析方法HPLC-UVHPLC-IRHPLC-MSHPLC-ELSDEtc.,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,色谱柱的选择1、色谱柱的基本技术参数固定相-决定选择性硅胶纯度（金属含量）-影响峰形粒径-影响柱效、柱压碳载量-影响保留时间孔径-孔径大，比表面积小比表面积-影响载样量pH范围-决定灵活性封尾基团-影响峰形、保留,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,硅胶纯度（金属含量）Columns:A型硅胶(=旧型号)B型硅胶(Gemini5mC18)Mobilephase:10mM甲酸铵pH3.5:乙腈:甲醇（35:15:50）Flowrate:1.0mL/minComponents:1.Rhodamine1232.Rhodamine6G3.RhodamineBBase玫瑰精,若丹明(一种红色荧光染料),广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,色谱图,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,A型硅胶C18化合物被吸收B型硅胶（GeminiC18)峰形、峰高、分离正常,金属的影响（1）,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,金属的影响（2）,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,Phenomenex典型B型硅胶色谱柱,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,2、疏水选择性色谱柱-广泛应用于各类药物分析经典C18-LunaC18GeminiC18(pH112)其他：C12、C8、C6、C5、C4,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,LunaC18（2）-亚甲基选择性,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,世界#1色谱柱（1）、反相方法开发的理想色谱柱*高纯硅胶基质，金属含量55.0ppm*反相键合固定相pH稳定范围1.5-10,112*反相键合固定相TMS封尾，自由硅醇基极低*多种固定相可以选择,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,（2）、GMP认证企业QC首选色谱柱*世界上首次具有MVD(MaterialValidationDocument)证明文件的色谱柱*每支色谱柱都有唯一的检测证书，每支色谱柱都可以溯源*出色的柱-柱、批-批重现性,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,应用实例：注射用头孢唑林钠色谱柱：GeminiC185u250 x4.6mm方法：ChP2019图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,1.（1-唑基-1-）醋酸2.头孢唑林烷酸水解物3.5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-巯基(MMTD)4.溶剂峰7.未知杂质8.头孢唑林9.头孢唑林烷酸,应用实例：注射用氨苄西林钠相关物质检查色谱柱：GeminiC185u250 x4.6mm方法：ChP2019图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,3、极性选择性色谱柱代表：SynergiPolar-RP,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,Columns:Luna5mC18(2)YMC-Pack5mProC18Synergi4mPolar-RP150 x4.6mmMobilephase:75:25Methanol:waterFlowrate:1mL/minComponents:1.Estrone(雌激素酮)2.Estradiol(雌二醇),广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,色谱图,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,4、芳香性选择性,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,Columns:Luna5mC18(2)150 x4.6mmLuna5mPhenyl-Hexyl150 x4.6mmSynergi4mmPolar-RP150 x4.6mmMobilephase:50:50Acetonitrile:20mMPotassiumphosphatepH2.5Flowrate:1.0mL/minComponents:Acidic,aromaticcompounds1.Indoprofen2.Ethylparaben3.Naproxen4.Diflunisal5.Indomethacin6.Ibuprofen,C18(2)Phenyl-HexylPolar-RP,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,5、混合选择性(1)强疏水性+强极性选择性SynergiHydro-RPcolumn推荐用于中药分析,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,SynergiHydro-RP,SynergiMax-RP（C12),MobilePhase:A:20mMKH2PO4,pH4.6B:AcetonitrileGradient:A/B(95:5)toA/B(65:35)in15minFlowrate:1.5mL/minSample:1.吗啡2.氢吗啡酮3.可待因4.烯丙吗啡5.羟考酮,SynergiHydro-RP,SynergiHydro-RPVS.LunaC18(2)2.苯丙醇胺3.伪麻黄碱,SynergiHydro-RP,5、混合选择性（2）平衡极性、疏水性选择SynergiFusion-RPcolumn推荐用于药物代谢分析,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,RunningConditions,Mobilephase:75:2520mMPotassiumphosphatepH2.5:AcetonitrileFlowrate:1.5ml/minTemperature:AmbientDetection:210nmInjection:1.马来酸2.氯苯那敏3.曲普利啶4.本海拉明,SynergiFusion-RP480,一般的C18柱,极性增大,疏水性减少,应用实例：注射用阿莫西林克拉维酸钾相关物质检查色谱柱：SynergiFusion-RP250 x4.6mm方法：ChP2019图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,应用实例：头孢克洛胶囊相关物质检查色谱柱：SynergiFusion-RP250 x4.6mm方法：ChP2019图谱来源：中检所抗生素室,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,1.3-头孢克洛2.头孢克洛,（3）、极性+芳香性SynergiPolar-RPcolumn（4）、芳香性+疏水性Luna苯基柱(pH1.510)Gemini苯基柱（pH112),广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,流动相的选择1、流动相的基本组成*甲醇：洗脱能力较弱，压力较大；使用苯基柱时推荐使用。*乙腈：洗脱能力较强，压力较小；使用末端吸收时和梯度洗脱时推荐使用。*梯度时：,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,2、流动相pH值的选择酸性分析物：pHpKa-2单一碱性分析物：pH3.5或pHpKa+2复杂碱性混合物：pHpKa+2,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,GeminiC18双子星柱在pH1-12范围内很稳定，可以更有弹性的选择流动相，因此，对酸、碱、中性化合物的分离都有很好的性能,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,1.氯磺丙脲（pKa5.0)2.对羟基苯甲酸丁酯3.利多卡因（pKa7.9)4.苯丙烯啶（pKa6.5)5.右甲吗南(pKa9.2),广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,应用实例：苦参色谱柱：GeminiC185u250 x4.6mm流动相：0.01M醋酸铵-乙腈（梯度）图谱来源：北京市某研究所,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,样品前处理的新方法在中药分析领域，SPE技术应用越来越广泛。传统的SPE小柱如：C18、C8、硅胶、氧化铝等大多只能处理某一类物质，难以解决中药复杂成分的综合分析。现在，同时把酸性化合物、碱性化合物和中性化合物分离，不再成为难题,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,-专为中药分析研发的SPE小柱-StrataX-C小柱机理：反相作用+阳离子交换特点：载样量更大，专属性更强，回收率更高，操作更简单。,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,StrataX-C操作一般步骤活化（MeOH）平衡（H2O)*上样（中药提取液+酸溶液）清洗1（酸性水溶液+适量甲醇）-收集可得酸性成分（黄酮、香豆素、大黄素等）清洗2（MeOH)-收集可得中性成分洗脱(碱性水溶液有机溶剂）-收集可得碱性成分（生物碱）,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,色谱柱使用维护的建议1、对相关物质检查分析，中药材分析，中成药分析，药物代谢分析必须使用保护柱。原因：保护柱作用：拦截死吸附的各类不明杂质，保护色谱柱，改善分离。,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,一般的保护柱有何缺点增加系统的死体积峰变宽保留时间延长价格昂贵没有匹配的保护柱,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,特点：专利技术，消除您所有顾虑通用-适用于所有的柱子直接与柱子连接减少死体积生物兼容性材料，绝对不与流动相作用多种固定相可供选择不影响色谱行为,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentCo.,Ltd,工作原理：,广州菲罗门科学仪器有限公司GuangzhouFLMScientificInstrumentC