不确定度.doc

LaPO4:Eu3+-BSA中BSA含量测定的不确定度评定1 实验目的采用荧光分光光度计对系列LaPO4:Eu3+标记的BSA标准溶液进行测定，绘制校准曲线，然后对未知BSA含量的溶液进行测量，根据校准曲线从而确定该物质中BSA的含量。2 测量方法采用荧光分光光度法进行测定:量取一定量的LaPO4:Eu3+溶液，加入pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液稀释，然后加入一定量的EDC和NHSS，在振荡器中振荡15min，然后加入不同体积的BSA, 溶液最终体积为2.5mL，再放入振荡器中振荡30min。如此得到一系列LaPO4:Eu3+标记的BSA溶液，然后用荧光分光光度法在波长253nm处测定溶液的荧光强度, 根据工作曲线从而确定该物质中BSA的含量。2.1 工作原理 荧光分光光度计由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以激发单色器变成单色光，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后，照射于测试样品用的光电倍增器上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅固定在最适当的激发波长上，所记录的光谱即为发射光谱，简称荧光光谱。当用荧光分光光度计进行标准溶液测量时，将激发光单色器固定在所选择的激发波长处，将荧光单色器调节到所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号即是标准溶液的荧光强度。2.2 数学模型w（BSA） = 10-6 (1 - 0) V /m 式中w(BSA)LaPO4:Eu3+-BSA中BSA的质量分数，%;1 工作曲线上查得的LaPO4:Eu3+-BSA样品中BSA的质量浓度，gmL-1 ; 0 工作曲线上查得的空白溶液中BSA的质量浓度，gmL-1 ; V 定容体积，mL ; m 合成LaPO4:Eu3+-BSA样品的质量，g。3 确定不确定度来源在测定溶液中BSA的质量浓度为012 gmL-1范围内, 该方法测量结果的偏差与影响测定结果的参数的控制有关。影响测定结果的参数主要包括质量、体积、温度、时间、仪器等。另外, 本次评定中要绘制BSA含量的工作曲线, 因此附加参数有荧光强度( I )、溶液中BSA的质量浓度() 以及溶液的体积（V）。通过分析, 测量影响因素的因果图如图1。 称样重复性线性工作曲线透透射比波长称样移液管校准比色皿容量瓶透射比校准线性波长校准移液管容量瓶体积温度工作曲线荧光强度图1 测量结果不确定度因果图4 量化不确定度分量 4.1 称量引入的相对标准不确定度称样引起的不确度来源有: 重复性、可读性、天平的灵敏度和线性产生的不确定度分量。(1) 天平制造商技术标准要求其重复性为0.0002g , 按三角形分布, 由重复性带来的标准不确定度为：0.0002 /= 0.0000816g(2) 天平制造商技术标准要求其可读性为0.0001g , 按三角形分布, 由可读性带来的标准不确定度为：0.0001/= 0.0000408g(3) 同一台天平因称量范围很小, 灵敏度带来的不确定度忽略不计。(4) 天平制造商提供的技术标准要求线性为0.00015g , 按均匀分布, 由线性引起的标准不确定度为：0.00015/= 0.000087g综上, 由天平称样所引起的标准不确定度：u ( m) = 0.000126g。4.2 体积引入的相对标准不确定度容量瓶量取体积有3个主要影响因素: 校准、重复性和温度。(1) 校准误差引入的不确定度根据JJ G19621990的规定, A级100mL容量瓶的最大允许误差为0.10mL ,按均匀分布, 包含因子k=，由校准引起的标准不确定度为： V1=0.10/=0.0577mL (2) 重复性引入的不确定度重复实验测得的标准偏差为0.02mL ,按均匀分布, 由重复性引起的标准不确定度为：V2=0.02/= 0.0115mL(3) 温度变化引入的不确定度由于实验室温度在(20 4) 波动,水的膨胀系数为2.1 10 - 4 /，量器玻璃的膨胀系数为9.7510-6/（可忽略），因此由温度引起的体积变化区间为10042.110-4 =0.0840mL，按均匀分布，则温度变化引起的标准不确定度为：V3=0.0840/= 0.0485mL由于移液管移取的溶液经过稀释后对吸光度的影响可忽略不计, 因此其带来的不确定度不计入, 所以由体积引起的标准不确定度由以上三部分组成：uV100 = = = 0.0762mL4.3 合成温度和时间引入的相对标准不确定度严格按照产品标准和操作规程进行测定, 环境温度、水浴温度和水浴时间带来的不确定度可忽略不计。在规定的时间(30 min) 内完成测量, 则由测量时间带来的不确定度可忽略不计。4.4 荧光强度引入的相对标准不确定度(1) 比色皿的配套误差为0.5 % ,由比色皿配套性带来的误差为0.0010.0035 , 按均匀分布, 其引起的标准不确定度为：0.0035/= 0.00202(2) 波长的重复性为3 nm , 测得其吸光度最大误差为0.01 , 按均匀分布, 其引起的不确定度为：0.01/= 0.00577综上, 操作中吸光度测定所带来的不确定度为：u ( A ) = 0.006114.5 工作曲线引入的相对标准不确定度取11个10mL离心管中，分别加入150L的1.310-3 molL-1 LaPO4:Eu3+溶液，加入0.01 molL-1 pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液稀释，加入0.5mL 100 gmL-1的EDC和0.5mL 100 gmL-1的NHSS，在振荡器中振荡15 min。向以上离心管中分别加入0、5、10、25、50、100、150、200、250、350、400L 100 gmL-1的BSA, 溶液最终体积为2.5mL，再放入振荡器中振荡30 min。如此得到一系列LaPO4:Eu3+标记的BSA溶液。以未加BSA的LaPO4:Eu溶液吸光度为零的溶液作为参比溶液, 在波长253 nm处, 用荧光分光光度计测定系列标准溶液的荧光强度I, 结果见表1。分析实验点，利用BSA的浓度小于12 gmL-1的9个实验点作一元线性回归方程得到的回归方程为I=50.33c+160.0，相关系数R=0.9855。这说明，当BSA的浓度小于12 gmL-1时，复合物的荧光强度和BSA浓度存在较好的线性关系。 表1 系列标准溶液吸光度的测定结果BSA质量浓度i/g mL- 10.000.200.041.002.004.006.008.0010.0014.0016.00荧光强度I88.97160.08187.46214.34289.25370.54460.76534.56610.26749.23778.34假定横坐标(BSA质量浓度)的不确定度远小于纵坐标(荧光强度)的不确定度, 则本次评定中0、1不确定度仅仅与荧光强度不确定度有关, 而与标准溶液质量浓度的不确定度无关, 也不与溶液的转移和稀释必然相关。因此用线性最小二乘法拟合0、1 不确定度u (0)和u (1)。称取样品3 g配制样品试验溶液,按同样的方法测量未知溶液的荧光强度为268.82，从工作曲线上查得BSA质量浓度(1)为10.23gmL- 1。经计算, 样品中BSA质量分数w (BSA) =1.332 %; 按三角形分布，不确定度为：u (0 )=0.00245g/ L，u (1)= 0.00278g/ L则：u (1 - 0)= 0.003714.6 荧光分光光度计引入的相对标准不确定度 根据证书提供的扩展不确定度为0.3%，k=2，故仪器的相对标准不确定度为：u=0.00155 相对标准不确定度的合成由于各分项的不确定度来源彼此独立不相关, 故相对标准不确定度见表2。表2 不确定度汇总表名称1-0m V I数值2.16gmL- 12 g100ml179.85标准不确定度0.00371gmL- 10.000126 g0.0762ml0.00611相对标准不确定度0.001420.0000630.000760.000034由w (BSA) =10-6 (1 - 0) V /m , 以上各项不确定度分量相对独立，故得到的合成相对标准不确定度为：urel= urel2 (1 -0) + urel2 ( m) +urel2 ( V ) + urel2 ( I )+u2 1/ 2 =0.0161%6 扩展不确定度的合成当置信概率取95%, 即包含因子k=2 , 扩展不确