2015年分子生物学--2基因重组和转座.ppt

分子生物学MolecularBiology生命科学与农学学院王雪芹Email:wangxueqin0218Tel周口师范学院生命科学与农学学院,第六章DNA的重组与转座DNArecombinationandTransposition,同源重组（homologousrecombination)位点特异性重组(site-specificrecombination)转座作用(transposition),发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称普遍性重组、基本重组，是最基本的DNA重组方式。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,第一节同源重组,利用DNA序列同源性来识别重组对象蛋白质因子紧紧帮助它们同源识别。只要两条DNA序列相同或接近，就可以在序列中的任何一点发生同源重组。同源重组存在热点（hotspot）即某类型序列发生重组的概率高于其他序列。同源重组要求序列同源性的最低长度因不同机体而异，一般在25300bp之间。,同源重组的特征：,同源重组发生在减数分裂同源染色体非姊妹染色单体之间，是一种交互重组类型。但在细菌转化、结合和普遍性转导中，同源重组是一种单向重组类型，仅受体DNA发生改变，而供体DNA并未发生变化。,一、同源重组的分子机制1.同源重组的基本条件在交换区具有相同或相似序列双链DNA分子间互补配对重组酶同源重组需要一些蛋白质因子（如大肠杆菌的RecA、B、C、D）及酶（如DNA连接酶）等。异源双链区的形成,2.同源重组的分子模型Holliday模型此模型中，同源重组主要有4个关键步骤：,两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,Holliday中间体,Holiday重组模型(双链侵入模型）,片段重组体,拼接重组体,二、同源重组的酶学机制,大肠杆菌重组有关的酶：RecA：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(assimilation)。单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。,RecA蛋白介导的DNA链交换模型A:DNA链交换的侧面观:1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来;B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面,2.RecBCD酶：产生参与重组的DNA单链该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。RecBCD酶具有三种酶活性：依赖于ATP的核酸外切酶活性，可被ATP增强的核酸内切酶活性，ATP依赖的解螺旋酶活性。,当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5GCTGGTGG3)，在其3侧46个核苷酸处将链切开，产生具有3末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点。,3.RuvABC:产生促进异源双链的形成和切开Holliday联结体。RuvA蛋白能够识别Holliday联结体的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使分支点易于移动。RuvA帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上。RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开。,RuvAB复合物结合于Holliday联结体的模型,转化transformation接合conjugation转导transduction细胞融合cellfusion,三、细菌同源重组,1.细菌转化,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competentcell)。,有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。人工转化的机制目前还不十分清楚，可能与增加细胞通透性有关。,2.细菌接合,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,可接合质粒如F因子(Ffactor),质粒细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,3.细菌转导转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。普遍性转导:是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌；局限性转导:某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA。,在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷型，因为都有噬菌体基因被宿主基因所取代。缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入受体菌，前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA发生重组。,4.细菌的细胞融合在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜整合导致的基因转移和重组。在实验室中，可用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，使两菌株的DNA发生广泛的重组。,第二节位点特异性重组,位点特异性重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短的(20200bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助因子对其识别和作用。,1.重组结果整合,1.重组结果缺失,1.重组结果倒位,DNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性状态。一般位点专一性重组都具有整合作用的两个基本特征：交换是相互的和保存原先的DNA，是典型的保守性重组（conservativerecombination）；它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列中的专一性核苷酸上。,2.噬菌体的整合与切除噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择，其DNA在不同生活型之间的转换包括两种状态：进入溶源状态需要DNA整合（integrate）进宿主DNA，噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分；由溶源状态进入裂解状态需要DNA从宿主DNA上切除下来。,这里，整合和切除均通过细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组而实现。这些特定位点叫附着位点（attachmentsite或att）。因此，位点专一性重组反应的定向特征取决于重组位点的识别。尽管重组反应是可逆的，但反应导向则由不同条件决定，这是噬菌体生活过程的重要特征，因为它保证了整合反应不会立即被切除反应所逆转。反之亦然。,转座遗传因子：简称转座子。细胞中能改变自身位置的一段DNA序列。转座因子、跳跃基因、移动基因、转座子。跳跃基因：一种可以在染色体基因组上移动，甚至在不同染色体之间或是在染色体、噬菌体及质粒DNA之间跃迁的DNA短片段。,第三节转座遗传因子,在20世纪40年代，美国遗传学家芭芭拉.麦克林托克(McClintockB)在研究玉米的遗传因子时发现，某些基因活性受到早一些能在不同染色体间转移的控制因子(controllingelement)所决定。,BarbaraMcClintock,转座子的分类,1.插入序列(insertionalsequenceIS)，是简单的转座子。特征：两端都有短的4-15bp的正向重复序列(directrepeats,DR)(靶序列)末端有略长的15-25bp的反向重复序列(invertedrepeats,IR)1kb左右的编码区，它仅编码和转座有关的转座酶。,2.复合转座子(compositetransposon)复合转座子是一类带有某些抗药性或其他标记基因的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。特征：末端有反向重复序列，为转座酶所必需中间有ORF作为标记基因转座后，靶位点大都成为正向重复序列,转座过程转座酶催化IS的转座，它由IS编码。首先转座酶交错切开宿主靶位点，然后IS插入，与宿主单链末端相连接，余下的缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，最终插入的IS两端形成了DR或靶重复。,IS或Tn插入到靶子位点后，两侧出现少数核苷酸重复,转座机制1.复制型转座：在相互作用时，转座子被复制，转座实体是原转座子的一个拷贝。转座子中作为移动的部分被拷贝。一个拷贝保留在原位点，而另一个则插入到新的新点。,2.非复制型转座：转座子做物理性运动，直接从一个位点转移到另一个位点。该过程涉及到转座子从供体DNA的释放，需要一个转座酶。非复制型转座导致转座子插入到靶位点以及供体位点丢失。,3.保守型转座：另一种非复制型转座，转座元件从供体位点上切除，然后插到靶位点上。在这一过程中，碱基是保守的。运用这一机制的转座子较大，不仅可以转移转座子本身而且还可以将供体菌的DNA转移到另一个细菌。,转座子插入基因后，使基因突变失活。当转座因子自发插入细菌的操纵子时，即可阻止它所在基因的转录和翻译；并且由于转座因子带有终止子，它的插入将影响到操纵子中其后基因的表达，因而表现出极性(polarity)，也即方向性。,转座的遗传学效应,3.转座因子的存在，往往会引起宿主染色体DNA重组，造成染色体断裂、重复、缺失、倒位及易位等，是基因突变和重排的重要原因。4.转座因子也可通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或转座因子本身的作用而影响邻近基因的表达，从而改变宿主的表型。,3.真核生物转座子,玉米的控制元件果蝇的转座元件,玉米中的控制因子,玉米基因组中含有几个控制元件家庭。每个家族的成员可分为两类：1.自主控制元件特点：具剪切和转座的功能。2.非自主控制元件特点：单独存在时是稳定的，可被自主控制元件激活。,玉米的Ac-Ds系统：(activator-dissociatiorsystem)激活-解离系统，通过非复制型机制进行转座。,McClintock发现玉米的籽粒颜色不稳定，有时出现斑点。是由于转座因子的存在。玉米的控制因子可以在基因组内移动。包括：*Ac：含有5个外显子的单个基因，其产物是转座酶。Ac的存在可以解除Ds对C的抑制作用，从而使色素基因C得以表达。*Ds：为Ac缺失之后的序列。经常变动在染色体上的位置，当插入到色素基因C的近旁或中间时，玉米籽粒不能形成色素。,在胚乳发育期间：*Ac