微生物检验总结

1 / 42 微生物检验总结 1. 食品微生物检验是应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律、对人 和动物健康的影响及其检验方法与指标的一门学科。 2. 食品微生物检验指标：菌落总数：指食品检样经过处理，在一定条件下培养后 1g1ml 或 1cm2检样中 所含细菌菌落的总数。大肠菌群：指一群在 37 摄氏度培养24小时能发酵乳糖、产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。致病菌：即能够引起人们发病的细菌。 3. ICMSF 取样方案： A.三级法 用做菌落总数和大肠菌群；B.二级法 用做致病菌。根据食品危害程度和 指标严重程度划 分。 2 / 42 4. 美国 FDA 取样方案 P69 自已画图 5. 样品可分为大样、中样、小样。要准确区分。大样指一整批；中样是从样品各部分取的混合样，一般为 200g;小样又称 为检样，一般以 25g为准，用于检样 . 6. 食品常用的采样方法：液体食品：充分混匀，用无菌操作拆开包装，用 100ml无菌注射器抽取，注入无菌盛样容 器。半固体食品：用无菌操作拆开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样 品，放入无菌盛样容器。固体样品：大块整体食的代表性，小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌盛样容器冷冻食品：大包装小块冷冻食品按小块个体采取，大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冻快上锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品，放入无菌盛样容品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取，割取时应兼顾表面与深部，注意样品器若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应取深部样品。 3 / 42 7. 样品的制备是指对所采集的样品再进行分取、粉碎以及混匀等过程。制备的方法可以根据被检食品的性状和检验要求， 采取剪碎振摇法、捣碎均质法、胃蠕动均质法、研磨法等。 8. 检样处理： 25+225 做成一个均匀的 1： 10 的 10 倍递增稀释液。 9. 菌落总数的测定：自已画示意图 菌落总数检验程序 水样 做几个适当倍数的稀释度 选择 3个适宜稀释度，各取 1ml加入到灭菌平皿内 每个平皿内加入 45摄氏度左右的适量琼脂 摄氏度 h 菌落计数 4 / 42 报告 10. 大肠菌群的检验 :自已画示意图 大肠杆菌为革兰氏阴性菌 检样的处理初发酵分离培养 (4）证实实验报告：查 MPN表 11. 致病菌的检验：自已画示意图 沙门氏菌的检验：沙门氏菌为革兰氏阴性菌 A.增菌：冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。鲜肉、 鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。B 选择性增菌 C分离 D生化实验 E 血清学检验 金黄色葡萄球菌的检验： 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌 A 检样的处理 B增菌 C分离培养 D 证实实验 微生物检验技术总结 5 / 42 一名词解释 1. 微生物：一群肉眼看不见的微小生物，如细菌、真菌、病毒。必须借助于光学显微镜或 电子显微镜放大数百倍，千倍，甚至数万倍才能观察到的低等生物体。 2. 细菌：是一类体积微小，结构简单，以二分裂的方式繁殖，对抗生素敏感的原核细胞型 单细胞微生物。 3. 细菌的生化反应：利用生化试验检测细菌对各类基质的代谢作用及其代谢产物的试验方 法。 4. 内毒素：是革兰阴性菌细胞壁的脂多糖，当菌体死亡崩解后，才可释放到菌体外。 6 / 42 5. 外毒素：是由革兰阳性菌及部分革兰阴性在生活过程中合成并可释放到菌体外的毒性蛋 白质，毒性强而且有高度的选择性。 6. 抗生素：是由某些微生物在代谢过程中产生的、能抑制或杀灭某些其他微生物和肿瘤细 胞的微量生物活性物质。 7. 正常菌群：在正常情况下，人体的体表及其与外界相通的腔道，都有一定种类和数量的微生物寄生，这些微生物通常对人体是无害的，甚至有益， 8. 条件致病菌：在正常情况下不致病，但在特定条件下能引起疾病的菌群，称为条件致病 或机会致病菌。 9. 菌群失调：是指宿主某些部位正常菌群中各菌群之间的比例发生了大幅度的变化，由生 7 / 42 理性组合转变为病理性组合的状态。 10. 消毒 ;是指杀死物体上的病原微生物但不一定能杀死细菌芽孢的方 法。 11. 灭菌：是指杀灭物体上所有的微生物 的方法 12. 无菌：是指没有活的微生物存在。 13. 无菌操作：防止微生物进入机体或其他操作对象的方法， 二填空题 1. 微生物的类型：非细胞性微生物， 原核细胞型微生物， 真核细胞性微生物 2. 寄居于人类的微生物可分为：正常微生物群或正常菌群条件致病微生物 8 / 42 病源微生物 3. 革兰阳性菌细胞壁特有组分 a) 磷壁酸 ;由核糖醇和甘油残基经 磷酸二酯键交联而成的多聚物。 b) 磷壁酸功能：抗原性强，是阳性菌表面重要抗原，并与细菌的黏附 有关。 c) 表面蛋白：致病和抗原性有关。 4.革兰阴性菌细胞壁特殊组成 ? 外膜：位于肽聚糖层外，由内向外依次为： 脂蛋白、脂质双层、 脂多糖 5 革兰阴性菌细胞壁特殊组成 脂蛋白 :外膜最内层，连接肽聚糖和外膜层。 9 / 42 脂质双层：结构类似细胞膜，中间镶嵌有外膜蛋白 孔蛋白 6、革兰阴性菌细胞壁特殊组成 ? 脂多糖 :由脂质 A、核心多糖和 O-特异多糖组成，又称细菌内毒素。 外膜最外层 ? 周浆间隙 膜磷壁酸 菌细胞壁 壁磷壁酸 特殊结构 表面蛋白： SPA、 M 蛋白 脂质双分子层 特 殊 结 构 脂 蛋 白 类脂：毒性部分 (外膜 ) 脂多糖： 核心多糖：属和组特异 10 / 42 特异多糖：种和型特异 7.。革兰阴、阳性细菌细胞壁的比较 ? 特征 革兰阳性 革兰阴性 ? 肽 聚 糖 层 次 15 50 1 2 ? 化 学 组 成 肽聚糖 外膜 磷壁酸 肽聚糖 ? 厚度 厚 薄 (2080nm) (1015nm) ? 外膜 无 11 / 42 有 ? 周浆间隙 存在于某些菌种 存在于全部菌种 ? 孔 蛋 白 无 有 ? 分 子 渗 透 性 高 渗 透 性 低渗透性 8.细胞壁的功能 1.维持细菌细胞固有外形，保护细菌。 2.和细菌细胞膜共同完成物质的交换。 3.细胞壁上的多种抗原决定簇，决定了抗原性。 9.细菌 L 型 ? 即细胞壁缺陷细菌，细胞壁部分或完全缺陷的细12 / 42 菌 ? 革兰阳性菌的 L型细菌称为原生质体 ,必须在 高渗环境中才可存活。 ? 革兰阴性菌的 L型称原生质球 ,因其肽聚糖层受损后外膜仍存在，在低渗环境中仍有 一定的抵抗力。 10.细菌 L型特性 ? 染色性发生改变，多为革兰阴性。 ? 形态发生改变，呈多形性。 ? 仅能在高渗环境中存活 ? 菌落表现为：油煎蛋样、颗粒样、丝状 11.荚膜的功能 13 / 42 1、抗吞噬作用，与毒力有关。 2、抗有害物质损伤作用。 3、具有粘附作用，有助于细 菌的定植 (和致病有关 ) 4、鉴定细菌 5、免疫原性 6、抗干燥作用 12.细菌的特殊结构 ? 鞭毛 ? 附着于多种细菌菌体上的细 长而呈波状弯曲的丝状物。 14 / 42 ? 分为单毛菌、双毛菌、 丛毛菌、周毛菌 ? 菌毛 ? 比鞭毛更为纤细、短而直的丝状蛋白附属物。 ? 分为普通菌毛、性菌毛 13.芽胞的功能和作用 1.对热力、干燥、辐射、化学消毒剂等具有强大抵抗力； 2.可以是否杀死芽胞作为物品消毒灭菌判断效果的指标； 3.芽胞在菌体的位置和直径大小随菌种不同有 助于细菌鉴别。 14.细菌的菌毛 () (来自 : 海达范文网 :微生物检验总结 ) ? 化学成分：菌毛蛋白，具有抗原性。 15 / 42 ? 功能： 普通菌毛： 是一种粘附结构， 又称定植抗原， 与致病性有关。 性菌毛：接合时传递遗传物质 微生物实验总结 姓名 :赵叶锋 班级：食品科学 113 学号： 2016013522 大三的第二学期块结束了，这个学期操作了四个微生物实验，以及一个自主设计性实验。通过前阶段对四个实验的操作和认知的基础上，展开第五 个实验的自主设计。实验分别是菌落总数测定，霉菌和酵母的检查和计数，乳酸菌的检验，微生物药敏试验以及探讨环境因素对微生物生长的影响。 这学期的微生物实验是在上学期微生物实验的基础上的累16 / 42 积和扩展延伸：以培养基的制备与灭菌，玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌，微生物接种技术和细菌的革兰氏染色为技术基础进行的，以加强学生基础理论知识和基本技能的培养为目的。 下面我来谈谈我在实验中的心得体会。 第一个实验是菌落总数测定。让我重新认识了一下这个名词：菌落形成单位，我现在的理解就是： 1ml或者 1g待测样品中菌落的个数，一定要注意的是单位是 CFU/ml或 CFU/g。还有就是要掌握好对高压蒸汽灭菌锅的操作。实验之前要充分做好预习工作，以便实验的进行。由于是测定微生物实验，就要尤其小心其他杂菌的混入影 响实验结果。因此要做好实验仪器和各种试剂的灭菌，有培养皿，试管，移液枪头，按要求配置好的琼脂培养基和生理盐水，按各自要求用纱布和报纸包扎好，送入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。玻璃仪器在包扎前要进行清洗，并烘干，以免水分沾湿报纸。灭完菌后取出物品进入超净工作台，超近工作台的紫外灯在进入 20 分钟前开启，并在进入时关闭，以免影响人体。要对台面进行消毒处理，用酒精擦拭。可以在等待琼脂培养基冷却到 50摄氏度左右前对待测样品进行 10倍系列稀释至需要的浓度。要注意的是一定要标记好浓度或者按顺序排列在试管架上17 / 42 以免弄混，同一个试管 里吸取样品才能用同一个枪头进行移液。再进行平板接种。待琼脂培养基冷却好后，用右手打开纱布并将锥形瓶拿住，将瓶口靠近酒精灯再进行灭菌，左手拿培养皿用大拇指和食指稍微打开培养皿盖，将琼脂培养基倒入培养皿中心内，不用倒很多，使琼脂培养基没过培养皿表面即可。培养皿一定是平拿在手上的，倒好后轻轻盖上培养皿盖，缓慢地平方在超净工作台台面边缘处，再推至中间。再用移液枪取 1ml样品快速打入培养皿中央，盖上培养皿盖，然后用手轻轻摇晃，千外不要太大力。然后贴上标签记号，静置。如此依次操作下去。静置一段时间待培养基凝固后倒置放入 恒温培养箱培养一段时间再取出进行观察计数。 我们组的实验结果不甚理想，培养皿中的微生物都是连成一片的，或者是培养皿壁上也都长着，主要是由于待测样品打入培养皿后，摇晃不均匀或者太大力了，以至于菌液没分散开来或是跑到培养皿壁上去了。 第五个实验是自主设计实验环境因素对微生物生长的影响。选 取 3个环境因素物理、化学和生物因素均可进行设计。根据前四个实验的基础，通过小组探讨和交流设计出实验方案。并加以验证。通过自主设计实验可以结合小组的智慧，加强团队协作精神和创新思维，通过实验可以验证理论，增18 / 42 加感性认识，培养独立工作能力和思考能力，并使具有过硬的专业技术水平。 通过这次的实验，我明白了任何事情丢不是一蹴而就的，而是一个慢慢积累的过程。虽然实验结果不是很理想，但是我参与了过程，通过小组 讨论我们也分析了失败的原因，找到了解决的方法，避免了下一次失误。并且从中理解了团队讨论和合作的重要性。以上即是我的全部感想。 1 食品微生物检验定义： 应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响。 2 食品微生物检验的特点： 1.研究对象及范围广 2.涉及学科多样 3.实用性及应用性强 4.采用标准化 3 食品微生物检验的意义： 食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。 19 / 42 首先，它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。 其次，通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细 菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施 。 再次，食品微生物检验是以贯彻 “ 预防为主 ” 的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重大意义。 总之，食品微生物检验的目的：为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。 4 食品微生物检验的范围： 5 食品微生物检验的指标 我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌。 20 / 42 、菌落总数 菌落总数是指食品检样经过处理， 在一定条件下培养后，所得每 g检样中形成的微生物菌落总数。 、大肠菌群 包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。寄居于人及温血动物肠道内随大便排出体外。大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。 、致病菌 、霉菌及其毒素 有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应检验。 6 食品微生物检验的发展： (一 )致病菌检测阶段 指示菌检测阶段 微 生态制剂检测阶段 现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测 7 微生物检验实验室 21 / 42 微生物检验室基本条件 总要求：对各室的共同要求是高度的清洁卫生，也就是要尽可能地创造无菌条件。 基本条件：微生物检验实验室必须具备显微镜工作，微生物分离培养工作及基本化学工作顺利进行的基本 条件。 具体要求： 1、光线明亮，但避免阳光直射室内； 2、洁净无菌，地面与四壁平滑，便于清洁和消毒； 3、空气清新，应有防风、防尘设备； 4、要有安全，适宜的电源和充足 的水源； 5、具备整洁、稳固、适用的实验台，台面最好有耐酸碱、耐腐蚀的黑胶板； 6、显微镜及实验室常用的工具、药品应设有存放橱柜。 微生物检验室实验守则 22 / 42 在进行微生物检验时要时刻记住：我们实验的许多对象可能是 病原微生物，如果不慎发生意外，不仅自身招致感染，而且可能造成病原微生物的传播。 检验实验室必须遵守以下守则： 1、 包、衣物等勿带入实验室 2、应戴口罩、帽子，换用专用鞋。 3、保持安静、有秩序，禁止饮食、吸烟等。 4、检验前应登记日期、批号，详记检验序号，日期，程序和结果5、室内保持整洁，完毕后清理桌面。 6、无菌室应备有专用开瓶器、金属勺、接种针等，使用前后应灼烧灭菌。 7、无菌室内应备有盛放 3来苏水或 5石炭酸溶液的玻璃缸，内浸纱布数块；备有 75酒精棉球；无菌室每 次使用前后，用紫外灯照射。 8、吸过菌液的 吸管，投入上述玻璃筒中，不得放桌上；菌液流洒桌面，用抹布浸沾上述溶液泡在污染部位，半小时后可抹去。若手上沾有活菌，也应在上诉消毒液中浸泡 10 20min，再以肥皂及水洗刷。 9、遇火险，应立即关闭电门、煤气门，如果酒精、乙醚、汽油23 / 42 等着火，切勿用水，应以沙土等灭火。 10、离开前用肥皂将手洗净，脱去工作服、帽、专用鞋。关闭门窗以及水电煤气等开关。 几种意外情况的处理： 皮肤破伤：先除尽异物，用蒸馏水和生理盐水洗净后，涂以2碘酒。 灼烧伤：涂以凡士林、 5的鞣酸或 2的苦味酸。 化学药品腐蚀伤：若为强酸腐蚀，先用大量清水冲洗后，再用 50g/L碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和；若为强碱腐蚀，也先用大量清水冲洗后，再用 5醋酸或 5硼酸溶液洗涤中和。若受伤的是眼部，经上述处理后，最后滴 入橄榄油或液体石蜡 1 2滴。 使用前准备： 用紫外线杀菌灯进行空气消毒，开 灯照射 30min后关灯，间隔 30min 后方可进入室内工作； 霉菌较多时，先用 5石炭酸全面喷洒室内，再用甲醛熏蒸；24 / 42 细菌较多时，可采用甲醛与乳酸交替熏蒸。一般情况下，可酌情间隔一定时间用 2ml/m3 甲醛溶液或 20 ml/m3 丙二醇溶液熏蒸消毒。 无菌室的熏蒸消毒主要采用甲醛熏蒸消毒法。 1、加热熏蒸 2、氧化熏蒸 无菌室无菌程度测定 测定无菌室无菌程度一般采用平板法： 灭菌的 15ml 营养琼脂培养基盖暴露于无菌室内不同地方，10min后，盖好皿盖。倒置于 37摄氏度培养 24h后，观察菌落情况，统计菌落数。每皿内菌落数不超过 4个，则可认为无菌程度良好，若菌落数很多，则应对无菌室进一步灭菌，灭菌后再检验。 常用仪器 超净工作台是箱式微生物无菌操作工作台，占地面积小，使用方便。其工作原理是借助箱内鼓风机将外界空气强行通过一组过滤器，净化的 无菌空气连续不断地进入操作台面，并且台内设有紫外线杀菌灯，可对环境进行杀菌，保证了超净工作台面的正压无菌状态。 25 / 42 高压蒸汽灭菌锅是应用最广、效果最好的湿热灭菌器，可用于培养基、生理盐水、废弃的培养物以及耐高热药品、纱布、采样器械等的灭菌。高压蒸汽灭菌锅的种类有手提式、直立式以及横卧式等多种，它们的构造和灭菌原理基本相同。 高压灭菌锅为一双层金属圆筒，两层之间盛水，外壁坚厚，其上方或前方有金属厚盖，盖上装有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而器内蒸汽压力可升高，其温度也相应增高。高压蒸汽灭菌锅上还装有排气阀、安全阀，用来调节灭菌锅内蒸汽压力与温度并保障安全；高压蒸汽灭菌锅上还装有温度压力表，指示内部温度与压力。 常用玻璃器皿 微生物检验室所用玻璃器皿，通常以中性硬质玻璃制成 。硬质玻璃能耐受高热、高压，同时，其中游离碱含量较低，不至于影响基质的酸碱度。 试管，培养皿，三角瓶，刻度吸管，试剂瓶，玻璃缸，玻璃棒，玻璃珠，滴瓶，玻璃漏斗，载玻片、凹玻片及盖玻片，发酵罐，注射器及其大小针头，量杯、量筒。 新玻璃器皿洗涤 26 / 42 新玻璃器皿因含有游离碱，应先在清洁液或 2%盐酸内浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。 温度计检查法 用一支 150 的水银温度计 ，使用前先将其水银柱甩到 0以下，插入灭菌物品内层，按常规灭菌，灭菌完毕后，取出观察，确定是否达到要求的温度 2.灭菌效果检验常用方法 将有芽孢的细菌放在培养皿内，用纱布包好，按常法灭菌。灭菌后取出培养皿，经培养后若无细菌生长，即表示灭菌效果良好。 玻璃器皿的灭菌 一般常用的玻璃器皿，在洗净晾干后，才能灭菌。试管、三角烧瓶等，在灭菌之前，管口和瓶口塞好棉塞，在干热灭菌器内 160 ， 2h灭菌。培养皿灭菌前，用牛皮纸或废报纸包好，每二对或五对为一包，排列在灭菌箱搁架上进行干热灭菌。吸移管灭菌前，口上塞一小棉球，每支用纸包扎好，或置于金属盒里，放在灭菌器内灭菌。 几个基本概念回顾： 27 / 42 一、灭菌 杀灭物体中或物体上所有微生物的繁殖体和芽孢的过程称为灭菌，即灭菌是杀灭或消灭一定环境中的所有微生物。灭菌的方法分为物理灭菌法和化学灭菌法两大类。 二、消毒 用物理的、化学的或生物学的方法杀灭病原微生物的过程称为消毒。具有消毒作用的药物称为消毒剂，一般消毒剂在 常用浓度下，只对细菌的繁殖体有效，对于细菌芽孢则无杀灭作用。 三、防腐 防止或抑制微生物生长繁殖的方法称为防腐。用于防腐的药物称为防腐剂。某些药物在低浓度时是防腐剂，在高浓度时则为消毒剂 四、无菌 无菌是不含有活的微生物的意思。防止微生物进入机体或物体的方法叫无菌技术活无菌操作。进行 微生物学实验操作时，须严格注意无菌操作。 8 食品微生物检验的一般步骤 9 采样的要求 28 / 42 1、严格遵守样品采集的操作规程。 2、所采样品必须具有代表性。 3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。 4、不得加入防腐剂、固定剂等。 5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。 10 食品微生物检验的取样方案 国际食品微生物学规范委员会取样方案； 美国 FDA微生物学取样方案； 世界粮农组织取样方案 ;4 其他方案。 一、 ICMSF 方法 根据危害度的分类，将取样方案分成二级法和三级法。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。 I 类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品； 类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变； 29 / 42 类危害：食用前经加热处理，危害减小的食品。 将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重三档 在进 行详细叙述之前，先解释四个代号： n：系指同一批次产品应采集的样品件数。 c：最大可允许超出 m值的样品数。 m：微生物指标可接受水平的限量值。 M：微生物指标的最高安全限量值。 二级法：设定取样数 n，指标值 m，允许有 c 个样品其相应微生物指标检验值大于 m值。 二级抽样方案 :自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准 m值，超过 m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过 m值的，来判定该批是否合格。 以生食海产品鱼的副溶血性弧菌为例， n=5， c=0， m=100，n=5即抽样 5个， c=0即意味着在该批检样中，不得有超过 m值的 检样，此批货物为合格品。如果 c 0 表明该批产品不合格。 30 / 42 三级法：设定取样数 n，指标值 m，附加指标值 M，介于 m与 M 之间的样品数 c。 按照三级采样方案设定的指标，在 n 个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于 m 值；允许有 c 个样品其相应微生物指标值在 m值和 M 值之间；不允许 有样品相应微生物指标检验值大于 M值。 例如：冷冻生虾的细菌数标准 n=5， c=3， m=10， M=100，其意义是从一批产品中，取 5 个检样，经检样结果，允许 3个检样的菌数是在 mM值之间，如果有 3 个以上检样的菌数是在 mM 值之间或一个检样菌数超过 M值者，则判定该批产品为不合格品。 11食品微生物检验采样原则 能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装 取样的应按无菌操作进行取样。 12样品的送检要求 1、要快速运送：不要超过 3小时； 31 / 42 2、若路途遥远，可在 15 低温下运送； 3、要注意防污染、防散漏、防变质； 4、要填写检验申请单。 13样品的保留 阴性样品：在发出报告可及时处理； 阳性样品：在发出报告以后 3天才能处理样品； 进口食品的阳性样品：要保留 6 个月才能处理。 微生物检验不进行复检 14 无菌技术 什么是无菌技术 指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。 无菌环境 无菌室；无菌柜；超净工作台 1、无菌室 无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间 无菌室的消毒和32 / 42 防污染 每日紫外线照射 . 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸 . 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。 2、超净工作台 超净台的使用与保养 : 风速保持在米 /秒 ; 使用前开启紫外灯照射 30分钟以上 ; 让超净台预工作 1015分钟 ; 使用完毕后，用 70%酒精将台面和台内四周擦拭干净 . 无菌操作 1、无菌操作目的： 保证待检物品不被环境中微生物的污染； 防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。 2、进入无菌室前的准备 33 / 42 定期检查无菌环境的空气是否符合规定； 用紫外线灭菌处理 3060 分钟； 检查无菌器材是否完备； 洗手消毒； 手部消毒后，再穿戴无菌工作服。 3、检验操作过程的无菌操作要求 在操作中不应有大幅度或快速的动作； 使用玻璃器皿应轻取轻放。 在正火焰上 方操作； 接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； 在接种培养物时，协作应轻、准。 不能用嘴直接吸吹吸管。 带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有 5%来苏尔溶液的消毒桶内消 毒。 34 / 42 15微生物的接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 常用的接种方法有以下几种： ）划线接种 ）三点接种 ）穿刺接种 ）浇混接种 ）涂布接种 ）液体接种 ）注射接种 ）活体接种 分离纯化方法： .倾注平板法 .涂布平板法 .平板划线法 16菌落形态学 Bacterial Colony Morphology ? 有荚膜的细菌菌落较大并且表面光滑，而没有荚膜的则表面较粗糙； ? 具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透明。 ? 没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等； 35 / 42 17细菌的生化反应检查法 由于细菌各自酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌，这种试验称为细菌的生化反应试验。 1. 在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的 PH 值变化。 2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。 生化试验的注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养 18-24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为 24 或 48小时。 4、应做必要的对照试验。 36 / 42 5、提高阳性检出率，至少挑取 2-3 个待检的疑似菌落分别进行试验。 生化试验分类 糖类代谢试验 氨基酸和蛋白质代谢试验 有机酸盐和铵盐代谢试验 酶类试验 18 糖 (醇 )发酵试验 原理 糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需的原料，由于细菌各自有不同的酶系统，故对糖 (醇 )类的分解能力不尽相同。有的能分解某些糖类，生 成酸又生成气体，有的虽能分解这些糖类但只能生成酸不能生成气体，有的则根本不能分解。借此特点，可作为鉴定细菌的依据 之一。该试验检查细菌对加在基础培养基中的特殊的糖发酵 (降解 )后产酸或产酸产气能力。 方法 37 / 42 (1)试剂：糖发酵培养基中，常用的指示剂主要有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等。前二者颜色反应较敏感，但稳定性较差。后二者比较稳定。特别是对发酵迟缓的细菌，培养时间较长，则以后二者为优。 (2)培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖 (或三糖 )高层斜面发酵管。 (3)操作：以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌接种到糖 (醇 )发酵培养基中，置温箱内，按各类菌所要求温度 (通常为 37) 经一定时间 (数小时至二周 )培养，然后观察结果。 记录： 产酸不产气，阳性，以 “+” 表示 产酸产气，阳性，以 “”表示 不产酸产气，阴性，以 “ -” 表示 19 甲基 红 (MR)试验 原理：某些细菌分解葡萄糖的过程中产生丙酮酸，丙酮酸进一步被代谢成为乳酸，乙酸，甲酸等。使培养基的 pH 下降至以下，加入甲基红指示剂出现红色为阳性；有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，最终38 / 42 的酸类较少，培养基 pH 较高，加入甲基红指示剂呈黄色为阴性反应。因此该试验是检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能够产生更 多的酸。 方法 (1)培养基：葡萄糖蛋白胨水 (MR/VP 培养基 )。 (2)试剂：甲基红指示剂。 (3)操作：待检菌 18 24h 纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中； 37 培养 2 3d，每2ml培养液加 2滴甲基红指示剂，立即观察。 结果 MR阳性：培养物有足够的酸，能使培养基表面甲基红试剂仍保持明显的红色 ()； MR阴性：培养基表面呈黄色 ()； 延迟反应：橙色，应继续孵育到 4 天，并重复试验。 20硫化氢试验 39 / 42 原理 ：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成 H2S， H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色硫化物。 方法与结果 (1)琼脂穿刺法： 培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁 (或醋酸铅 )的半固体培养基。 操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经 37 24