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薄层色谱法标准操作规程单位：北京阳光医药科技有限公司部门：阳光医药合成部文件编号：SOP-HC-101118版本：1.0编写者：,薄层色谱原理薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。等点样、展开(吸附、解吸附的过程)后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。,薄层色谱分类在薄层色谱分析中，主要是动相溶剂（展开剂）带动混合物组分流经静相（即薄层板）的过程。根据静相的性质，使被分离的组分基于以下的一种或几种因素，在动相与静相间进行分配，从而达到分离的目的（1）在静相的表面或内部所持有的液体中进行溶解分配-分配薄层色谱（2）在静相的表面或孔隙中进行吸附分配。-吸附薄层色谱-凝胶过滤薄层色谱（3）与静相的离子组分形成极性键-离子交换色谱,色谱条件,1静相物质（吸附剂、粘合剂、附加剂）的选择。,常用静相物质的一般性质,常用吸附剂及其特性,硅胶是由硅胶酸脱水而成，是薄层色谱中应用最多的一种吸附剂。硅胶颗粒表面有大量的OH基，带有一定的酸性（pH45），故适于酸性或中性物质的分离。硅胶又有很强烈的吸湿性，故相对来说，硅胶更适于分离疏水性物质，而分离亲水性物质的效果较差。,（1）硅胶,常见的商品硅胶有以下几种规格：1）不加粘合剂的纯硅胶粉：商品称硅胶H或硅胶N。2）加粘合剂的硅胶：加有15%石膏的硅粉胶，商品称为硅胶G。加有15%淀粉的硅胶，商品称硅胶S。3）含荧光指示剂的硅胶：这类硅胶粉含有无机荧光性物质，如硫化镉等，在短波紫外线照射下，产生绿色荧光，商品称为硅胶GF254、硅胶Guv254或硅胶HF254。4）高纯薄层硅胶：商品称硅胶GHR及硅胶HFHR。,氧化铝为应用范围仅次于硅胶的一种薄层吸附剂，吸附力很强。商品氧化铝多为碱性（约pH9），但也有中性（约pH7）、酸性（约pH4）氧化铝。氧化铝薄层板主要用来分离碱性和中性的弱极性化合物常用的氧化铝有：1）不加粘合剂的氧化铝：商品称氧化铝H，或氧化铝N。2）加粘合剂的氧化铝：加有石膏的氧化铝商品称为氧化铝G。3）含有荧光指示剂的氧化铝：商品称氧化铝GF254，氧化铝HF254亦有称氧化铝Guv254,（2）氧化铝,硅藻土为粗二氧化硅的水合物，由硅藻类的遗骸在海底堆积而成。它的吸附力极弱，但有大量的空腔，因此可以作分配薄层色谱中的惰性支持剂（担体），用来分离亲水化合物。,（3）硅藻土,（4）聚酰胺粉：聚酰胺为内酰胺的多聚体，其分子内存在着很多酰胺键，可与酚类、酸类等化合物形成氢键，酰胺键内的胺基又可与芳香硝基及醌式化合物中的醌基形成氢键，因此对这些化合物产生了一定的吸附作用，这些化合物与聚酰胺形成氢键能力各不相同，故用聚酰胺薄层板可达到分离效果。聚酰胺的粘着能力比其它吸附剂差，故需加入纤维素或淀粉等粘合剂,含有大量的1，4葡萄糖甙链连接的纤维二糖，由於它含有大量的羟基，使得纤维素有良好的亲水性，因此适用于分离亲水性化合物。纤维素薄层板属于分配色谱。,（5）纤维素,（6）离子交换纤维素在离子交换薄层色谱中，常用的静相物质为离子交换树脂及离子交换纤维素，后者是将天然纤维素经过酯化、醚化，使纤维中的羟基与一些酸性或碱性基团作用，形成有离子交换性质的纤维素，这些物质对於高分子量化合物的分离效果很好,（7）亲水性凝胶多聚葡萄糖凝胶为这一类物质的代表，为一种多联多聚葡萄糖，广为应用在凝胶过滤薄层色谱,动相溶剂薄层色谱中展开溶剂的选择，对於成功地进行薄层分离是非常重要的。一般说来，中等极性的被分离物质，需用中等活性的吸附剂及中等极性的展开溶剂；非极性的被分离物质，需要用高度活性的吸附剂及非极性展开溶剂；极性的被分离物质，用低活性的吸附剂及强极性的展开溶剂。展开溶剂的选择要考虑到被分离物质极性的强弱，而这种极性与化合物结构有相当密切的关系。各种官能团的极性，按下列顺序递增。-CH2-CH2-CH=CH-OCH3-COOR=C=O-CHOSH-NH2-OH-COOH,2动相物质（展开剂）的选择,正己烷环己烷四氯化碳甲苯氯仿正丁醇乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水,溶剂的洗脱能力随溶剂的极性增大而增强,在一块薄层板上进行试验：若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强；若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂的极性过弱。,理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大。各组分理想的比移值在0.2-0.8之间。,当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。,薄层色谱中展开溶剂的选择，可采用以下两种简单的预试法：（一）微薄层法：用普通薄层板，在展缸中展开约5厘米，取出吹干后显色。若混合物能分离为各个单独的色斑，则展开溶剂可用。（二）微量圆环法：将样品溶液点在薄层板上，可同时点数点，每点间距2-3厘米。再用毛细管分别吸取待试展开溶剂，依次滴加在各样品原点中，干后显色。如某种溶剂将待分离混合物形成一个个分离明显的同心圆环，则为较合适的展开溶剂。,常用仪器1）硅胶板（市场购买，不自己铺板，以前用的是GF254，现在买的是HSGF254）2）点样器：定性：内径为0.3mm管口平整的普通毛细管定量：微量注射剂。点样直径不超过5mm，点样距离一般为1.52.0cm即可，应能使点样位置正确集中。3）展开室：应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。,4）显色剂：可采用喷雾显色，浸渍显色或置适宜试剂的蒸气中熏蒸显色，用以检出斑点。5）显色装置：喷雾显色喷雾器用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器皿或用适宜的玻璃缸代替；蒸气熏蒸显色可用玻璃缸或适宜大小的干燥器代替。6）检视装置：为装有可见光、短波紫外光（254nm）、长波紫外光（365nm）光源及相应滤片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄用,暗箱内光源应有足够的光照度。,三薄层色谱操作,1薄层板的制备,吸附剂硅胶,玻璃板,调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105-115左右烘干40-50min。冷却后使用。,2点样,样品溶液的配制,点样,斑点在薄层板上的位置通常用比移值（Rf）表示。Rf值为斑点中心距原点的距离与溶剂展开前沿距原点距离的比值：斑点中心至原点的距离Rf=-溶剂前沿至原点的距离Rf值是与物质在两相中分配系数相关的数值，因此，在特定条件下为一常数。不同的物质由于在特定色谱条件下的两相间分配系数的差异，而有着不同的Rf值，这样就达到薄层色谱分离的目的。,图1薄层色谱展开示意图,被分离混合物,组分一,组分二,展开可以单行展开：向一个方向进行；也可以进行双行展开：先向一个方向展开，取出，待展开剂完全挥发后，将薄层板转动90再用原展开剂或另一种展开剂进行展开。还可以多次展开：一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止,双行展开,1-2cm,展开示意图,3展开,展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子，展开。观察展开情况。取出薄层板,上升法,倾斜上行法,下降法,图展开方式示意图,画溶剂前沿线,观察斑点,记录Rf值,薄层色谱展开示意图,1h反应混合液样,原料样,结论：反应结束,4显色A光学检出法a自然光（400800nm）b紫外光（254nm或365nm）c荧光一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在薄层上显出不同颜色的荧光斑点（灵敏度高、专属性高）,B蒸汽显色法多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况，前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。,C物理显色法用紫外照射后的薄层，使化合物产生光加成，光分解、光氧化还原及光异构等光化学反应，导致物质结构发生某些变化，如形成荧光发射功能团。发生荧光增强或淬灭及荧光物质的激发或发射波长发生移动等现象，从而提高了分析的灵敏度和选择性。,D试剂显色法显色方法a喷雾显色：显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在纸和薄层。b浸渍显色：挥去展开剂的薄层板，垂直的插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板及抽出速度和规定在显色剂中浸渍的时间。,显色试剂A通用显色剂1）重铬酸钾硫酸一般有机物均能显色，不同化合物显示不同颜色。喷洒剂：5克重铬酸钾溶于100ml40%硫酸中。喷洒后加热至150oC斑点出现。2）碘：检查一般有机物3）碘蒸气：在一个密闭玻璃皿先放入碘片，使缸内空气被碘蒸气饱和将薄层或纸层放入缸内数分钟即显色，有时在缸内放一盛水的小杯，增加缸内的湿度，可提高显色的灵敏度。0.5%碘的氯仿溶液，取出挥发散过量的碘再喷1%淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。4）碘碘化钾溶液：生物碱显棕褐色。5%磷钼酸乙醇溶液：喷后120oC烤，还原性物质显蓝色，再用氨气熏，则背景变为无色。,5）20%磷酸乙醇溶液：喷后120oC，还原性物质显蓝色。6）碱性高锰酸钾试剂：还原性物质在淡红背景上显黄色。溶液I:1%高锰酸钾溶液。溶液II：5%碳酸钠溶液。溶液I和溶液II等量混合使用。7）中性0.05%高锰酸钾溶液：易还原性物质在淡红背景上显黄色。8）硝酸银氢氧化铵（Tollens-zoffaronl）试剂，喷后105oC烤510分钟，还原性物质显黑色。溶液I：0.1N硝酸银溶液。溶液II：氢氧化铵溶液。临用前溶液I和溶液II以1：5混合。注意：放久则形成爆炸性的叠氦化银。,9）硝酸银高锰酸钾试剂：还原性物质在兰绿色背景上立即显黄色。溶液I：0.1N硝酸银溶液：2N氢氧化铵溶液：2N氢氧化钠（1：1：2）。临用前配制。溶液II：高锰酸钾0.5g，碳酸钠1g，加水成100ml溶液。临用前溶液I和溶液II等量混合。10）四唑试剂：还原性物质，在室温或微加热时显紫色。溶液I：0.5%四唑兰甲醇溶液。溶液II：6N氢氧化钠溶液。临用前溶液I和溶液II等量混合。11）铁氰化钾：三氯化铁试剂：还原性物质显兰色，再喷射2N/L盐酸溶液，则蓝色加深。溶液I：1%铁氰化钾溶液。溶液II：2%三氯化铁溶液。临用前溶液I和溶液II等量混合。12）浓硫酸：甲醇（1：1）溶液，或5%硫酸的乙醇溶液，喷后100oC烤15分钟，各种不同物质显不同颜色。,13）萤光显色剂溶液：试喷以下一溶液，不同的物质在萤光背景上可能显黑色或其他萤光斑点。A：0.2%2.7二氯萤光素乙醇溶液。B：0.01萤光素乙醇液C：0.1%桑色素乙醇溶液D：0.05罗丹明B乙醇溶液E：萤光素一溴，检不饱和化合物。（1）0.1%萤光素乙醇溶液（2）5%溴的CCL4溶液。喷洒（1）以后，放置（2）溶液的缸内，可在UV光下检查萤光，萤光素与溴化合成曙红（ensln）（无萤光），而光饱和化合物则与溴加成，保留了原来的萤光；若点样量较多，则成黄色斑点，底板成红色。,14）碱式醋酸铅试剂（可做喷洒或沉淀试剂，多种有机化合物均反应）。取Pbo14g置乳钵内，加蒸馏水10ml，研后成糊状后，倾入玻璃瓶中，乳钵用10ml蒸馏水洗净，洗液并入瓶中，加醋酸铅溶液（取醋酸铅22g，加蒸馏水70ml制成）70ml，用力振摇，放置七天，滤过，并自滤器中添加适量新沸过的冷蒸馏水使成100ml即得。,专属显色剂1）生物碱显色剂2）强心苷显色剂3）黄酮苷显色剂4）皂苷显色剂5）蒽醌苷显色剂6）香豆精苷显色剂7）挥发油显色剂8）氨基酸显色剂9）糖显色剂10）鞣质显色剂,5测定比移值在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。,6薄层扫描薄层扫描法指用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测层析谱。如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫