水产品快检技术在兽药残留方面的研究进展.pdf

分析与检测 November 2017 CHINA FOOD SAFETY 29 我国是世界上水产品产量最大的国 家之一，作为餐桌上的佳肴，伴随水产 品需求量的不断增长，安全问题也日 趋严峻。水产品的安全风险主要来源 于水体中的消毒剂、重金属及饲料中 的农药和兽药残留，其中，兽药残留 问题较为突出。为避免水产品安全事故 的发生，有效的兽药残留检测技术必不 可少。 快速检测技术 目前，常规的检测方法多为仪器分 析法，其灵敏度和准确度都比较高，但 存在费用高、检测周期长等问题，无法 满足现场快速检测的需求，因此，简单 快速的检测技术具有广阔的应用前景。 本文对化学比色法、酶联免疫法、胶体 金免疫层析法和量子点荧光免疫分析法 等多种快检技术在水产品兽药残留检测 方面的研究进展作一综述。 放射免疫测定法 1959 年，Yelow 等建立了放射免 疫测定法（RIA），其基本原理是标记 抗原和非标记抗原对专一抗体的竞争抑 制作用，利用了放射性示踪的灵敏度和 抗原 - 抗体反应的特异性。李佐卿等利 用放射免疫法来检测鱼肉和鸡肉中磺胺 类药物的残留量，其中对鱼肉样品加标 10g/kg 进行了 18 次测定，精密度为 5.4%，测定低限能达到 10g/kg。陈 键等研究了放射免疫法检测鳗鱼中磺胺 类药物残留，验证了磺胺类药物在最大 残留限量 50g/kg 时的检测稳定性， 并且 90min 即可得到检测结果。陈小 雪等采用放射免疫法对水产品中氯霉素残 留进行了分析，检测低限为0.15g/kg。 郑晶等利用放射免疫法快速筛检烤鳗中 四环素类药物残留，检测限为50g/kg。 目前，放射免疫测定法以其高灵敏度已 被广泛应用于多个领域。 酶联免疫吸附法 1971 年， 瑞 典 学 者 Engvail 和 Perlman 与 荷 兰 学 者 Van Weerman 和 Schuurs 几乎同时建立了检测体液中微 量物质的固相免疫测定方法，即酶联免 疫法（ELISA），其基本原理是酶与抗 体或抗抗体共价结合，形成酶标记复合 物，再与相应的抗原形成酶标记的抗原 抗体复合物，然后相应的底物在酶的催 化下反应生成另一种有色产物。 周大勇建立了诺氟沙星的竞争 性酶联免疫吸附测定法，其检测范围 为 10500ng/mL， 最 小 检 测 浓 度 为 4.6ng/mL。同时，周大勇测定了 9 种 诺氟沙星类似物和一些抗菌素的交叉反 应率， 其中洛美沙星的交叉反应率最高， 达到了 64.18%，其余 8 种类似物的交 叉反应率均小于 10%。采用这种方法 测定草鱼鱼肉中的诺氟沙星含量，回收 率为 82.06%。李雅丽建立了基于多克 水产品快检技术在兽药残留方面 的研究进展 李云 石家庄市畜产品质量监测中心 陈笑笑 王伟萍 杭州南开日新生物技术有限公司 水产品是人们生活中的重要食物来源，它的安全问题备受关注，其兽药残留问题更是敏感， 目前已有多种快检技术应用于水产品兽药残留领域的检测。本文主要概述了化学比色法、酶 联免疫法、胶体金免疫层析法和量子点荧光免疫分析法等多种快检技术在水产品兽药残留检 测方面的研究进展。 分析与检测T echnology 科技 30 食品安全导刊 2017年11月 隆抗体的间接ELISA方法来检测喹诺酮， 该法可用于猪肉和鱼肉组织中 19 种喹 诺酮类药物的检测，效果良好。 Umaporn 等 利 用 ELISA 法 测 定 虾 中 5- 甲 基 吗 啉 -3- 氨 基 -2- 唑 烷 基 酮（AMOZ）的残留，检出限为 0.16g/ kg。Jester Edward 等使用 R-Biopharm 公司生产的 ELISA 试剂盒检测了鱼肉 样品中的硝基呋喃药物残留，与使用 LC-MS-MS 检 测 的 结 果 吻 合 度 较 高。 李亚楠等建立了测定呋喃妥因代谢物的 直接竞争酶联免疫法，线性检测范围为 0.17711.508ng/mL，其中鱼肉的最低 检测限为 0.109g/kg。 郑晶利用酶联免疫法来测定鳗鱼中 恩诺沙星的残留量，当样品浓度为 0.3 10g/kg 时，最低检测限为 3g/kg； 当样品浓度增加至 25100g/kg 时， 回 收 率 为 66.5%76.6%， 灵 敏 度 为 0.3g/kg。刘晓红等利用酶联免 疫法测定鲤鱼中恩诺 / 环丙沙星的残 留 量， 当 浓 度 为 10810mg/kg 时， 最 低 检 测 限 为 10g/kg； 当 样 品 添 加 浓 度 为 20500g/kg 时， 回 收 率 为 76.6%80.9%。 李 宗 妍 等 建 立 了 一步法酶联免疫法测定水产品中恩诺 沙星的残留，检测限为 10g/kg，在 1040g/kg 浓度范围内，检测回收率 可达 70以上，检测时间缩短至 2h 以 内。冯婷婷等利用抗恩诺沙星单克隆抗 体建立了酶联免疫吸附法用来检测动物 源性食品中恩诺沙星的残留，检测范围 为0.550g/L， 最低检测限为0.2g/L， 在鸡肉、鱼肉、虾和蜂蜜样品中的回收 率为 93.3%122.7%。 酶联免疫吸附法的特异性强，且简 便快速，在水产品兽药残留快速检测方 面应用广泛，许多公司已具有商品化产 品。酶联免疫吸附法作为目前研究较 为成熟的快检方法，在市场上占有较 大份额。 胶体金免疫层析法 1971 年，Faulk 和 Taylor 首次将胶 体金应用于免疫分析。此后，Osikowicz 和 Beggs 等将胶体金免疫层析技术应 用于人类绒毛腺激素的定性检测中，其 基本原理是以胶体金（红色）作为示踪 标记物，让其与蛋白质等多种大分子物 质结合，再利用抗原抗体反应达到检测 目的。 韩静等首次建立了同时检测猪肉、 鸡肉、鲫鱼中磺胺异噁唑、磺胺噻唑、 磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺氯 哒嗪的多残留免疫胶体金试纸条检测方 法，视觉检测限为 0.01mg/kg，检测时 间小于 10min。冯婷婷等建立了同时检 测 11 种喹诺酮类药物的胶体金免疫层 析方法，对猪肉和虾中恩诺沙星、环丙 沙星和氧氟沙星的检测限均为30ng/g， 整个检测过程（包括样品前处理）可在 20 min 内完成。吴茂生等利用胶体金 免疫层析法对水产品中呋喃妥因代谢物残 留进行检测，检测限为 1.0g/kg，假阳 性率低于 5，假阴性率为 0，且通过 液质联用法确证，两者结果一致。张敏 等研制出一种快速检测水产品中磺胺类 药物的胶体金免疫试纸条，该试纸条对水 产品中的磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺 胺二甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶的检出限 分别是 5g/kg、40g/kg、45g/kg 和 100g/kg，与四环素、盐酸克伦特罗、 环丙沙星、氯霉素等无交叉反应，说明 检测试剂的灵敏度和特异性都较高。檀 尊社等建立了一种用于快速检测水产样 品中四环素类药物残留量的胶体金免疫 层析法，最低检测限可达 100ng/mL， 检测仅需 510min，且与沙丁醇胺等 其他兽药之间无交叉反应。 胶体金免疫层析法是目前快检市场 上炙手可热的检测手段，其借助检测试 纸作为载体，操作简便，检测时间大大缩 短，在水产品兽药残留方面有极大的应 用， 而以此为基础的大量研究也在进行中。 化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法是 Halman 根 据放射免疫分析的基本原理将具有高灵 敏度的化学发光测定技术与高特异性的 免疫反应相结合的一种方法。其操作流 程是将发光物质或酶标记在抗原或抗体 上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶 底物而发光，通过测量发光强度，根据 标准曲线测定待测物的浓度。 高彬文等建立了一种检测鱼和虾 肌肉中氯霉素残留的化学发光酶联免疫 法，检测限为 5.810-4g/kg，与传 统的酶联免疫法相比其更加灵敏。刘邓 等研制出一种基于鲁米诺 - 辣根过氧化 物酶体系的化学发光免疫分析试剂盒， 用于检测食品中痕量恩诺沙星残留，检 测线性范围为 0.0242.76ng/mL，其中 对鱼肉和虾肉样本的添加回收率分别在 92%112% 和 86%112% 之间。谢 体波等研究了化学发光检测试剂盒对畜 禽及水产品中呋喃唑酮代谢物残留的检 测效果，发现试剂盒对猪肉、鸡肉、鱼 肉、虾肉 4 种样品的最低检测限分别为 0.097g/kg、0.098g/kg、0.097g/ kg、0.091g/kg，灵敏度很高，且检 测只需要 10min。 化学发光免疫分析法的推广应用速 度非常快，在快速检测方面拥有巨大的 潜力，同时化学发光检测技术与其他技 分析与检测 November 2017 CHINA FOOD SAFETY 31 术联用的研究也在不断进行，有望催生 出更好的食品安全检测方法。 量子点荧光免疫分析法 1998 年，Chan 等发现在牛血清白 蛋白中，多克隆抗体能够识别量子点标 记的免疫球蛋白， 使量子点聚集在一起。 由此，量子点开始应用于荧光免疫分析 中，其基本原理就是将量子点作为示踪 标记物应用于免疫层析法中。 Sai 等建立了基于小分子半抗原直 接包被方式和量子点荧光探针结合的新 型荧光免疫分析方法，并将其用于检 测虾仁中的氯霉素。该法的灵敏度为 30.2ng/mL，最低检出限为 1.2ng/mL， 与传统的酶联免疫法相比，灵敏度提高 约 5 倍，检测时间缩短了 1h。田玮研 究了用于检测鱼中氯霉素残留的量子点 荧光免疫分析法，其灵敏度高且检测时 间短。居莹制备出具有免疫活性的量子 点荧光探针，并组装成孔雀石绿量子点 免疫试纸条，其检测限为 1.5g/kg。 张蕾应用 CdTe 量子点研制出呋喃唑酮 快速荧光免疫层析试纸条，检测了水产 品虾肌肉组织中呋喃唑酮代谢物的残留 量，检测限为 10.0ng/g，假阴性率和假 阳性率均小于 5，且与呋喃西林代谢 物、呋喃它酮代谢物和呋喃妥因代谢物 的交叉反应率均小于 1。 量子点荧光免疫分析法是量子点在 食品领域的应用，弥补了传统快检方法 灵敏度不高、抗干扰能力不强的缺点， 促进了食品安全快速检测技术的发展。 化学比色法 化学比色法主要包括试纸、试剂盒 等，相对于其他快速检测方法，是一种 操作简单的检测手段，适用于大批量样 品的检测。 窦红建立了一种用于快速检测水 产品中孔雀石绿及其代谢物的化学比色 法，孔雀石绿及其代谢物的检出限分别 为 2g/kg 和 4g/kg。钱蓓蕾等研究 出了一种用于检测孔雀石绿残留的快速 检测试剂盒，检测限为1.010.0g/kg。 由于化学比色法的灵敏度较低，在 水产品兽药残留快速检测方面的应用前 景有限，目前不再着重于该法的研究， 而是寻找更好的方法。 表面增强拉曼光谱 1974 年，Fleischman 等发现吸附 在粗糙银电极表面上的吡啶分子可以得 到增强的拉曼信号。随后，Jeanmaire 等证实了该光谱现象，表面增强拉曼光 谱技术（SERS）由此产生，其基本原 理是拉曼散射效应产生的分子振动光 谱， 该光谱反映了分子的特征结构信息。 顾振华等研究了使用便携式拉曼光 谱仪对水产品水样中孔雀石绿进行快速 检测的方法，检测限为 5.0g/L，常见 物质对其测定无干扰，且从样品制备到 结果显示一般只需要 3min。Zhang 等 建立了一种鱼肉产品中恩诺沙星、呋喃 唑酮和孔雀石绿的 SERS 分析方法，可 以检出罗非鱼鱼片中 1.0g/g 的呋喃 唑酮和 200ng/g 的孔雀石绿。随后，该 研究小组又利用 SERS 检测鱼肉中的孔 雀石绿和结晶紫，检测最低浓度分别为 1.0g/kg 和 2.0g/kg。Fu 等也建立 了一种水产品中孔雀石绿的 SERS 分析方 法，其线性范围为2.5100mol/L，检测 限为 2.5mol/L。钟坚海等将表面增强 拉曼光谱与分子印迹和磁性纳米技术相 结合，实现了对养殖水和虾肉中孔雀石绿 的高效富集，检测限分别为 0.5ng/mL 和 6ng/g。 除了对孔雀石绿检测的研究，表面 增强拉曼光谱在抗生素检测方面也有 应用。赖克强等对磺胺类抗生素进行 了 SERS 探测，能够检测到的最低浓 度为 10ppb。随后，研究小组又结合 化学计量法快速检测了水产品中磺胺 甲基嘧啶的残留，结果表明 SERS 技 术对磺胺甲基嘧啶标准溶液的检出限 为 5ng/mL，鱼肉中磺胺甲基嘧啶的检 出限为 20ng/mL。马海宽等以银溶胶 为表面增强拉曼活性基底，检测出磺胺 甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低限度 均为 1ppm，检测限分别为 0.16ppm、 0.59ppm，实现了鱼肉中磺胺类抗生素 的痕量检测。 表面增强拉曼光谱无损样品、可用 于现场快速检测的特点使其具有广阔的 应用前景，但是其选择性