动物细胞培养PPT医学课件.ppt

1.动物细胞培养的发展史2.动物细胞的特征3.培养基4.动物细胞的获得与保存5.动物细胞培养方法6.动物细胞培养生物反应器7.动物细胞培养过程参数的控制与检测,动物细胞培养,.,动物细胞培养的发展史,1、动物细胞培养技术的建立1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志；1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。1914年，Thomson建立了器官培养技术。1940年，1951年，Earle和Gay分别建立了c3H小鼠结缔组织细胞系的L系和人体细胞系人体宫颈癌Hela细胞系。,动物细胞培养的发展史,2、细胞融合现象的发现19世纪30年代，Muller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象；1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在；1855年1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞；1859年，A.Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。,动物细胞培养的发展史,3、细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生1958年,Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。,动物细胞培养的发展史,4、动物克隆技术的建立首例克隆动物成功的报道是在1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质。,动物细胞的特征,1.结构特征,与微生物相比，动物细胞体积较大，对环境因素敏感，营养需求高，倍增时间长，没有细胞壁但对损伤更敏感。,动物细胞的特征,细胞膜,动物细胞的特征,2.动物细胞的代谢特征在其培养过程中，葡萄糖和谷氨酸为主要营养物质，乳酸和氨是主要的代谢副产物,葡萄糖的代谢途径在人体内，葡萄糖代谢除了无氧酵解途径以外还有很多其他方式，比如有氧氧化、磷酸戊糖途径、糖原的合成与分解途径、糖异生、糖醛酸途径等。（一）糖的有氧氧化途径：1.概念：葡萄糖在有氧条件下彻底氧化成水和二氧化碳的过程2.过程有氧氧化可分为两个阶段：第一阶段：胞液反应阶段：从葡萄糖到丙酮酸，反应过程同糖酵解。糖酵解产物NADH不用于还原丙酮酸生成乳酸，二者进入线粒体氧化。第二阶段：线粒体中的反应阶段：（1）丙酮酸经丙酮酸脱氢酶复合体氧化脱羧生成乙酰CoA，是关键性的不可逆反应。其特征是丙酮酸氧化释放的能量以高能硫酯键的形式储存于乙酰CoA中，这是进入三羧酸循环的开端。,动物细胞的特征,（2）三羧酸循环：三羧酸循环是在线粒体内进行的一系列酶促连续反应，从乙酰CoA和草酰乙酸缩合成柠檬酸到草酰乙酸的再生，构成一次循环过程，其间共进行四次脱氢，脱下的4对氢，经氧化磷酸化生成H20和ATP。2次脱羧产生2分CO2。三羧酸循环的特点是：从柠檬酸的合成到-酮戊二酸的氧化阶段为不可逆反应，故整个循环是不可逆的；在循环转运时，其中每一成分既无净分解，也无净合成。但如移去或增加某一成分，则将影响循环速度；三羧酸循环氧化乙酰CoA的效率取决于草酰乙酸的浓度；每次循环所产生的NADH和FADH2都可通过与之密切联系的呼吸链进行氧化磷酸化以产生ATP；该循环的限速步骤是异柠檬酸脱氢酶催化的反应，该酶是变构酶，ADP是其激活剂，ATP和NADH是其抑制剂。（2）（3）氧化磷酸化：线粒体内膜上分布有紧密相连的两种呼吸链，即NADH呼吸链和琥珀酸呼吸链。呼吸链的功能是把代谢物脱下的氢氧化成水，同时产生大量能量以驱动ATP合成。1个分子的葡萄糖彻底氧化为CO2和H2O，可生成36或38个分子的ATP。3.生理意义：有氧氧化是糖氧化提供能量的主要方式。,动物细胞的特征,（二）磷酸戊糖途径：在胞浆中进行，存在于肝脏、乳腺、红细胞等组织。生理意义：1.提供5-磷酸核糖，用于核苷酸和核酸的生物合成。2.提供NADPH，参与多种代谢反应，维持谷胱甘肽的还原状态等。（三）糖原的合成分解途径：糖原是动物体内糖的储存形式，是葡萄糖通过-1，4糖苷键和-1，6糖苷键相连而成的具有高度分枝的聚合物。机体摄入的糖大部分转变成脂肪（甘油三酯）后储存于脂肪组织内，只有一小部分以糖原形式储存。糖原主要分为肝糖原和肌糖原，糖原是可以迅速动用的葡萄糖储备。糖原合成酶是糖原合成中的关键酶，受G-6-P等多种因素调控。葡萄糖合成糖原是耗能的过程，合成1分子糖原需要消耗2个ATP。肝脏存在葡萄糖-6-磷酸酶，可使肝糖原分解成葡萄糖补充血糖。肌肉组织无葡萄糖-6-磷酸酶，不能直接分解成葡萄糖，肌糖原分解产能可供肌肉收缩需要。（四）糖异生：1.概念：由非糖物质转变为葡萄糖的过程称为糖异生。是体内单糖生物合成的唯一途径。肝脏是糖异生的主要器官，长期饥饿、酸中毒时肾脏的异生作用增强。2.过程：糖异生的途径基本上是糖酵解的逆向过程，但不是完全可逆过程。酵解过程中三个关键酶催化的反应是不可逆的，故需通过糖异生的4个关键酶（葡萄糖-6-磷酸酶、果糖-1，6-二磷酸酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶）绕过糖酵解的三个能障生成葡萄糖。3.生理意义：补充血糖，维持血糖水平恒定。防止乳酸中毒。协助氨基酸代谢。,动物细胞的特征,（五）糖醛酸途径：生理意义：生成有活性的葡萄糖醛酸，它是生物转化中重要的结合剂；葡萄糖醛酸还是蛋白聚糖的重要组成成分，如硫酸软骨素、透明质酸、肝素等。,动物细胞的特征,细胞内两个主要的谷氨酰胺代谢酶是谷氨酰胺分解酶和谷氨酰胺合成酶，前者将谷氨酰胺分解成谷氨酸和氨，后者将谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，人体不同组织有不同的反应方向。例如，在肌肉、肝脏、大脑、肺和脂肪细胞，谷氨酰胺的合成反应占明显优势;而在肠细胞和免疫细胞(淋巴细胞和巨嗜细胞)内，谷氨酰胺则被大量用来提供细胞能量和供应细胞内DNA和RNA的合成。,培养基,动物细胞培养必需的溶液平衡盐水（BSS）：Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液。PH调整液：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸）细胞消化液:胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液。抗生素溶液：1)青、链霉素，每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素。2)卡那霉素：终浓度为50ug/ml培养液。3）制霉菌素：浓度25U/ml，小瓶分装，每瓶一次用完。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子(IGFl、IGF2)等。水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成05%溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。,培养基,1.天然培养基,天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是成分复杂，来源受限。天然培养基/液的种类很多，包括生物性液体(如血清);组织浸液(如胚胎浸液);凝固剂(如血浆)等。天然培养基的特点及存在的问题:组织培养技术建立的早期，体外培养细胞都是利用天然培养基，如蛋白水解物、血清等。其优点是含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、pH等也与体内环境相似，缺点是其为成分不明确的混合物，受其来源及法规等问题的限制，制作过程复杂，批次间差异大，并逐渐被合成培养基所取代。实际工作中往往将天然培养基与人工合成培养基结合使用。目前常见有水解乳蛋白和新生牛血清。一般的天然培养基都是属于不完全培养基。,培养基,2.合成培养基,1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。,培养基,成分,1细胞培养基组成及作用氨基酸组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡1。必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等。维生素维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源，但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。脂溶性维生素如：A、D、E、K。水溶性维生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰胺等。,培养基,许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。VD参与调节钙的吸收。VE是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。,培养基,无机离子钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子，这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素,细胞通常可耐受260mOsm/kg320mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液，细胞内K+的对于激活某些酶是必需的，它在调节细胞内环境的酸碱平衡也有极重要意义。Ca2+在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。Mg2+是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用是十分广泛而不可缺少。,培养基,2细胞培养基发展趋势无血清培养基用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。需要添加生长因子和/或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分。其主要优点：(1)增加确定性;(2)性能更一致;(3)容易进行纯化和下游加工;(4)提高制品安全性和/或产量。成分激素生长因子蛋白贴壁和扩展因子脂质其他营养物质,培养基,无蛋白培养基培养基中没有添加蛋白，但仍然可能包含一些动物或植物来源的成分(如低分子量肽的各种水解物)化学限定培养基培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。培养基的品质鉴定外观颜色、粉末细度须均匀。溶解性培养基完全溶解，可以避免培养基内营养成分的流失。pH值哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，同时pH值的测定也可以检查培养基的批间差异。水分培养基的营养成份很丰富，利于微生物的滋长，因此水分的含量控制可以延长有效期。冰点渗透压细胞必须生活在合适的渗透压环境中;同时渗透压值的测定也可以检查培养基的批间差异。菌落总数粉末培养基不是无菌制剂，培养基本身的营养成分很丰富，容易滋生微生物，因此菌落的控制可以延长有效期细胞生长试验可检查细胞培养基是否有促生长的能力，以及是否有不利细胞生长的毒素。细菌内毒素为满足生物制品细菌内毒素的控制要求，作为生物制品生产原料的培养基同样需要细菌内毒素控制。稳定性确定产品的储存、运输条件，产品的保质期限。一致性,动物细胞系的获得与保存,原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（CellLine），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。一般采用细胞冻存，利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。细胞冻存时向培养基中加入保护剂-终浓度515的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。若细胞只需要暂时保存，则可用悬浮培养，但要维持细胞的贴壁状态，尽量不出现接触抑制,动物细胞培养方法,贴壁培养(attachmentculture)是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养(瓶)器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。容易更换培养液;细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的;因细胞固定表面，不需过滤系统。当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞。3.贴壁培养的缺点:与悬浮培养法相比扩大培养比较困难，投资大;占地面积大;不能有效监测细胞的生长;,动物细胞培养方法,细胞悬浮于培养基中生长或维持。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模相对比较简单，只要增加体积就可以了。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第1825d时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。微载体培养：以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术。,一、微囊法（microencapsulation）:用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。,动物细胞的微囊化培养,动物细胞培养生物反应器,动物细胞体外培养时，生物反应器是整个培养过程的关键设备，为细胞提供了一个适宜的生长环境，使之快速增殖并形成所需的生物组织制品。由于动物细胞在其形态结构、培养方法以及所需的力学环境等方面均不同于微生物细胞，因而传统的微生物反应器显然已不适用于动物细胞大规模培养，特别是组织工程的需要，促使新型生物反应器的研究与开发。搅拌式生物反应器搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。,动物细胞培养生物反应器,供氧方式的改进一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触；反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器，整体呈梨形，搅拌置于反应器底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。搅拌桨的改进搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6106个/mL，成活率在98%以上。,动物细胞培养生物反应器,非搅拌式生物反应器折叠搅拌式生物反应器用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式反应器产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。（1）填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可