海绵共附生微生物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性菌株的筛选与初步鉴定.pdf

第3 l卷第3 期 2 叭2 年8 月 台湾海峡 J O U R N A L0 F0 C E A N O G R A P H YI NT A I W A NS T R A I T V 0 1 3 1 N o 3 A u g ，2 0 1 2 海绵共附生微生物中具有0 ( 一葡萄糖苷酶 抑制活性菌株的筛选与初步鉴定 查鑫壶1 ，靳翠丽1 2 ，陈毓遒1 ，缪莉1 2 ，朱晓雯1 ，周晓见1 2 ( 1 扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州2 2 5 1 2 7 ；2 扬州大学海洋科学与技术研究所，江苏扬州2 2 5 1 2 7 ； 3 上海药物研究所新药研究国家重点实验室，上海2 0 1 2 0 3 ) 摘要：通过建立仅一葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，对美国圣璜岛海域海绵共附生微生物发酵产物进行 活性筛选其中，仪葡萄糖苷酶活性测试反应体系是在9 6 孔酶标板中进行，在Q 一葡萄糖苷酶浓度 为0 0 0 8U c m 3 ，p H 值为6 8 ，反应温度为3 7 c C 及测定生成物波长为4 0 5n m 的基础上，优化筛选模 型结果表明，模型的最佳筛选条件：底物P N P G 的浓度为1 0m m o ld m 3 、活性测试反应时间为2 5 m in ，样品溶剂D M s O 含量为2 ( y ) 以d 一葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖作为阳性对照样品，根据 优化后的抑制活性筛选模型对2 1 2 株海绵共附生微生物的粗提物样品进行筛选结果表明：1 9 株 微生物的粗提物抑制率大于5 0 ；其中，抑制活性最高的5 株菌株的粗提物，在浓度为0 4 、0 6 、 0 8m g c m 3 时，其抑制活性均在7 0 以上，远远高于阿卡波糖的最高抑制率5 8 ( 1 6m g c m ) 其中菌株H Y 。娟粗提物浓度在0 4m g c m 3 时，仍具有很高的仪一葡萄糖苷酶抑制率7 9 3 通过1 6 s r D N A 序列测定与分析，鉴定该菌株为坚强芽孢杆菌( 日o c 珊瑚声r m 眦) 坚强芽孢杆菌代谢产物能显 著抑制仅一葡萄糖苷酶活性，这为研制新型d 一葡萄糖苷酶抑制剂提供了有力的线索，对坚强芽孢杆 菌有待作进一步的研究 关键词：海洋微生物学；海绵共附生微生物；仅一葡萄糖苷酶抑制剂；抑制活性；菌株鉴定 D O l：1 0 3 9 6 9 J I S SN 1 0 0 0 8 1 6 0 2 0 1 2 0 3 0 1 2 中图分类号：P 7 3 5文献标识码：A文章编号：1 0 0 0 8 1 6 0 ( 2 0 1 2 ) 0 3 - 0 3 8 0 旬7 在广阔的海洋里生存着数以万计的生物，海洋 生物的种类和多样性远远超出陆地生物由于海洋 生态环境的特殊性，使得海洋生物拥有与陆生生物 不同的生理和代谢功能近几十年，人们通过对海洋 生物的不断探讨，从海洋动植物及微生物中分离鉴 定出上万种天然活性物质。1 七J 其中，海绵是最原始 的多孔形无脊椎生物，是海洋天然产物的重要来源 近年来，从海绵中分离的结构新颖、药理活性显著的 天然产物有萜类、生物碱类、聚醚类、大环内酯类、多 肽类等旧J 海绵体内有着非常复杂的微生物生态系 统，其共附生微生物群落占海绵干重的4 0 左右， 最高可达，7 0 研究发现，从海绵中所获得的活性 物质实际上是由海绵共附生的微生物所产生的，每 年有上百种的新化合物及其新功能被发现和研究， 并且这些活性化合物都被证明与海绵共附生微生物 有关 4 - 5 。 仅葡萄糖苷酶( d g lu c o s id a s e ) 是存在于人体小 肠粘膜细胞刷状缘上的酶，它对生物体内新陈代谢 的生化反应起着关键作用人们从食物中摄取淀粉 等多糖，通过体内代谢最终以仪一葡萄糖苷酶的作用 变成葡萄糖，进入血液形成血糖，但血糖过高会增加 糖尿病的发病率，在研制抗糖尿病的药物过程中，人 们发现仅一葡萄糖苷酶抑制剂具有可逆地占据仅一葡 萄糖苷酶与糖结合位点的特点，从而能够抑制葡 收稿日期：2 0 1 2 旬1 旬4 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 4 1 0 7 6 0 9 7 ，4 l0 0 6 0 9 7 ，4 l1 0 6 1 1 3 ) ；教育部科学技术研究重点项目资助项目( 2 l1 0 6 5 ) ；江苏省自然科学 基金资助项目( B K 2 0 1 0 3 2 2 ) ；上海药物研究所新药研究国家重点实验室开放课题资助项目( S I M M l1 0 6 K F _ 0 9 ) ；江苏省教育厅高校 自然科学基金资助项目( 1 1 K J B l7 0 0 1 1 ) 作者简介：查鑫矗( 1 9 8 6 ) ，女，硕士研究生；E m a il：c h a x j n y a o 1 6 3 c o m 通讯作者：周晓见( 1 9 7 6 ) ，男，副教授；E m a il：z h o u x ia o iia n y z u e d u c n 3 期查鑫壶，等：海绵共附生微生物中具有d 一葡萄糖苷酶抑制活性菌株的筛选与初步鉴定 萄糖苷酶催化多糖降解为单糖，限制或延缓多糖在 消化道内分解7J 仪一葡萄糖苷酶抑制剂作为降糖药 物，最初是从细菌( 放线菌属、链酶菌属) 中提取获 得哺J 随着研究的深入，人们从天然动植物及海洋 生物中分离出一系列的仅一葡萄糖苷酶抑制剂，主要 类型有生物碱类、类黄酮类、萜类和多酚类等化合物 及其衍生物一。 其中，理葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡 波糖、伏格列波糖、米格列醇在临床上已得到广泛应 用1 。1 3J 另外，研究发现，d 一葡萄糖苷酶抑制剂除了 具有治疗糖尿病的独特疗效，在生物学中还可以作 为调整细胞代谢功能的重要分子工具，是治疗艾滋 病、恶性肿瘤、溶酶体贮积症等潜在疾病的良性药 物4 | 近年来，从海绵中已分离出很多具有抑制仪一 葡萄糖苷酶活性的天然产物，对海绵共附生微生物 的研究是目前研制新型仅一葡萄糖苷酶抑制剂的重 要课题和研究热点 本研究对选自美国圣璜岛海域的海绵共附生微 生物，研究其药理活性物质实验以仪一葡萄糖苷酶 抑制剂阿卡波糖作为阳性对照组，建立仪一葡萄糖苷 酶活性抑制剂筛选模型，从海绵共附生微生物代谢 产物中筛选出具有抑制一葡萄糖苷酶活性的菌株， 并对活性菌株进行种属鉴定 1 材料与方法 1 1 实验材料 美国圣璜岛海域的8 种海绵共附生微生物，经 分离纯化得到的2 1 2 株菌株 1 2 培养基 海洋微生物培养基( m a r in eb r o t h ，M B ) ，ld m 3 培 养基中含5 0 0g 蛋白胨、3 。0 0g 酵母膏、0 1 0g 柠 檬酸铁、1 9 4 5gN a c I 、5 9 0 9M g c l2 、3 2 4 9M g s 0 4 、 1 8 0 9c a C l2 、o 5 5 9K C l，p H 值为7 4 7 6 ，于 1 2 0 灭菌2 0m in 1 3 实验试剂 d 一葡萄糖苷酶( d D 9 1 u c o s id a s e ) 和4 一硝基苯基一 值一D 一吡喃葡萄糖苷( 4 一N it r o p h e y l Q - D g lu e o p y r a n o s id e ，P N P G ) 购自S 培m a 公司；阿卡波糖( a c a r b o s e ) 、 对硝基苯酚( p a m N it r o p h e n o l，P N P ) 、磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、碳酸钠( N a ：C O ，) 、二甲基亚砜( d im e t h y ls u 怕x id e ，D M s 0 ) 、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等均为分 析纯试剂 1 4 实验方法 1 4 1海绵共附生微生物代谢产物的提取将海 绵共附生微生物分离纯化的2 1 2 株菌株，接人装有 M B 培养基的试管中过夜培养2 4h ，以5 ( 矽y ，下 同) 接种量转接入装有5 0c m 3 无菌培养基的1 5 0 c m 3 锥形瓶中，培养4 8h 后，再以5 的接种量接入 装有8 0 0 c m 3 无菌培养基的2 d m 3 锥形瓶中，放置摇 床上，于2 8 发酵培养4d 将培养好的菌液用乙酸 乙酯和丙酮的混合液 丙酮含量5 ( I I ) 分离葶 取，其菌液0 混合液的比例为1 ：1 1 t 唆上层有机 相，浓缩吹干后的物质即为海绵共附乍微生物代谢 产物( 粗提物) 1 4 2 仅葡萄糖苷酶活性测定方法参照T r e m b la y 等的方法5 | ，以P N P G 为底物，测定仪一葡萄糖苷 酶活性，测试体系在9 6 孔酶标板中进行，整个反应 过程：P N P G ! 鱼堕墼P N P + G ，在温度为3 7 ， p H = 6 8 的条件下，待反应完全后测定产物P N P 在 波长4 0 5n m 下的D D 值用0 1m o ld m 3 磷酸盐缓 冲液( p H = 6 8 ) 配制0 0 0 8u c m 3 的d - 葡萄糖苷酶 溶液和一定浓度的P N P G ，反应中止液为1m o L d m 3 N a ，c o ，溶液，为确保仅一葡萄糖苷酶活性测试的准 确性，以0 。0 0 8 u c m 3 的d 一葡萄糖苷酶溶液与1 2 5 、 2 5 、5 、1 0 、2 0m m 0 1 d m 3 的P N P G 反应，测定生成物 P N P 的D D 。值，选择合适的P N P c 浓度 1 4 3 仪葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的建立根 据d 一葡萄糖苷酶活性测定方法，对海绵共附生微生 物2 1 2 株菌株的粗提物进行活性筛选将粗提物用 D M S O 溶解成浓度为o 8m c m 3 的待测溶液，即为 待测样品实验组是在9 6 孔酶标板中加入8 2m m 3 磷酸盐缓冲液、4 0m m 3 P N P G 溶液、3m m 3 待测样 品，于3 7 保温5m in ，然后加入2 5m m 3 一葡萄糖苷 酶溶液，反应2 5m in 后，向其中加入5 0m m 3 中止剂 N a ? C O ，溶液中止反应，测定生成物在波长为4 0 5 n m 的D D 值阴性对照组是以3m m 3D M s O 代替待 测样品，其余操作同上为了扣除粗提物自身颜色对 D D 值的影响，用空白组来测定磷酸盐缓冲液1 4 7 m m 3 和3m m 3 待测样品的D D 值以上每个样品重 复3 次 1 4 4 阳性对照样品的前处理将1 片阿卡波糖 片剂悬浮溶解在2c m 3 的甲醇溶剂中，在高速离心 机上离心，弃去不溶物，蒸干上清液，从而得到纯化 的阿卡波糖( H P L c 纯度 8 5 ) 用D M s 0 将纯化 后的阿卡波糖溶解，将其作为阳性对照样品 1 4 5 实验数据的处理d 葡萄糖苷酶活性抑制 率计算公式： 抑制率( ) ：垡生塑盟云等里塑二旦生止1 0 0 L 儿，阴性对照 酶活力单位定义：在3 7 和p H 值为6 8 的条 件下，每分钟水解底物所产生lm o lP N P 的酶量， 台湾海峡 规定为1 个酶活力单位( u ) “ 1 4 61 6 Sr D N A 分析取活性菌株的新鲜培养 液，根据u N I Q 一1 0 柱式细菌基因组D N A 抽提试剂盒 提取D N A 1 6 sr D N A 的P c R 扩增引：以细菌的总 D N A 为模板，利用细菌1 6 sr D N A 通用引物8 f ( 5 A G A G I 丫r G A T C C T C G C T C A G 3 ) 和1 4 9 2 R ( 57 一G G T T A C C lT GT T A C G A C T T 一37 ) 进行P C R 扩增，从而得 到1 6 sr D N A 碱基序列P c R 体系建立( 5 0m m 3 ) ： D N A 模板1m m 3 ，1 0 T a qr e a c t io nB u f f e r5m m ，正 向引物5 f 和反向引物1 4 9 2 R 各1m m ，T a q 酶0 2 5 m m 3 ，d N T P1m m 3 ；P c R 程序设定为：9 8 预变性5 m in ；9 5 变性3 5s ，5 5 复性3 5s ，7 2 ，延伸3 0s ， 循环3 5 次，最后7 2 延伸8m in 将1 6 Sr D N A 序列 与G e n B a n k 数据库序列比对，对获得的同源序列进 行序列分析，采用M E G A 5 0 5 软件构建进化树，由 系统发育树确定该活性菌株的分类学地位 2 结果与分析 2 1P N P G 浓度的选择 在筛选模型中，底物P N P G 的浓度关系到测试 体系的灵敏度实验以不同浓度的P N P G 测定其在 相同浓度的仅一葡萄糖苷酶的催化水解速度，图1 表 示P N P G 浓度对生成物D D 值的影响 图1P N P G 含量对生成物0 D 值的影响 F ig 1 E f k c t so fP N P Gc o n c e n t r a t io n so nI s u lt a n t s0 Dv a lu e s 从图1 可以看出，在0 0 0 8U c m 3 旺葡萄糖苷 酶的作用下，不同浓度的P N P G 随着反应时问的延 长，生成物P N P 的p D 值均有不同程度的升高反应 时间在2m in 内，不同浓度的P N P G 水解反应产生 的P N P 均不多，表现为生成物D D 值均很小当 P N P G 浓度为2 0m m o L d m 3 时，反应1 0m in ，生成 物的D D 值迅速增加，之后随着时间的延长+ D D 值 基本稳定，说明反应底物P N P G 浓度过大；当 P N P G 浓度为1 2 5 5 0 0m m o ld m 3 时，反应3 5 m in 内的生成物D D 值均很小，显色反应速度较 慢，说明反应底物P N P G 浓度不足；当P N P G 浓度 为1 0m m o L d m 3 时，生成物的D D 值在2 5m in 内持 续稳定上升，2 5m in 后，其0 D 值较高，继续延长反 应时问，对D D 值的增加影响不大，说明在该时问 段的测试反应已达到饱和状态结果表明，在旺一葡 萄糖苷酶活性测试体系中，选择1 0m m o L d m 3 为 P N P G 的最适浓度 2 2D M S O 浓度对生成物D D 值的影响 在反应体系中，D M S O 浓度对生成物D D 值有 一定的影响实验以D M s 0 含量分别为o 、1 、2 、 4 、6 、8 、1 0 ( y ，下同) 的反应体系进行比 较，结果如表1 在D M s 0 含量不同而其他成分相同 的各反应体系中，高含量的D M s O 有利于提高生成 物的D D 值，其酶促反应速度在高浓度D M s o 存在 时得到增强，也即说明，较高浓度的D M S O 在一定 程度上阻碍了样品对d 一葡萄糖苷酶的抑制活性所 以，在对仪一葡萄糖苷酶抑制剂活性测试的筛选体系 中，样品溶剂D M s 0 的含量在总反应体系中不宜过 多但为了保证待测样品的溶解性，反应体系中必然 存在一定浓度的D M S 0 从表1 中数据可以看出， 1 含量的D M s 0 对终点0 D 值的影响很小，D D 值 仅升高了1 8 2 ；2 含量的D M S 0 使反应终点o D 值升高了4 ，2 ；其余含量的D M s o 对o D 值的影响 都很大在本实验中，在用1 含量的D M s O 溶解样 品时，发现部分样品液中含有未溶物，给n 葡萄糖 苷酶活性测试结果带来很大误差即1 含量的 D M S O 不能将样品充分溶解，导致测试反应未能正 常进行为了确保实验的准确性，选择2 的D M s O 样品液进行仪葡萄糖苷酶活性测试反应。 表1D M S O 浓度对生成物o D 值的影响 T a b 1E f k c to fD M S 0c o n c e n t r a t io no nr e s u lt a n tD Dv a lu e s D M S 0 含量D D 4 0 5 值 1 6 5 0 2 7 1 6 8 0 3 9 1 7 2 0 2 3 1 7 7 O 5 6 1 8 0 0 2 5 1 9 2 O 0 7 1 9 9 O 0 9 2 3 阳性对照样品对a 一葡萄糖苷酶的抑制效果 为了确保筛选体系的可靠性和准确性，本实 验以阿卡波糖浓度分别为0 2 、0 ，4 、0 8 、1 6 、2 4 、 3 2m g c m 3 对d 葡萄糖苷酶进行活性测试，测试 O ， 2 4 6 8 K 3 期查鑫毒，等：海绵共附生微生物中具有仪一葡萄糖苷酶抑制活性菌株的筛选与初步鉴定 3 8 3 结果如图2 从图2 中可以看出：在不加阿卡波糖 的反应体系中，反应2 5m in 后，因反应完全生成 P N P ，此时的O D 值约为1 7 ，抑制率为0 ；随着阿 卡波糖浓度的升高，其生成物P N P 含量相应降低， 反应体系颜色也随之变浅，表现为生成物的D D 值 不断地减少，说明阿卡波糖浓度越高，对d 一葡萄糖 苷酶的抑制率越大；当阿卡波糖浓度在0 8m g c m 3 时，其抑制率的升高趋势减缓；继续增加阿卡波糖浓 2 O 16 12 霉 日 o 0 8 O 4 O O 度，当浓度超过1 6m g c m 3 时，D D 值不再降低， 抑制率稳定在5 8 左右，此时的抑制率为阿卡波 糖的最大抑制率本实验说明，阿卡波糖的存在抑 制了黄色生成物P N P 的产生速度，即抑制了仅葡 萄糖苷酶的活性，当有仅一葡萄糖苷酶抑制活性物 质存在的条件下，阿卡波糖的酶抑制活性值可以 作为阳性对照值对海绵共附生微生物代谢产物进 行活性筛选 O O0 20 4O 81 62 432 浓度m g c m 一3 7 0 6 0 5 0 4 0 鋈 得 3 0 器 罪 2 0 1 0 O 图2 阿卡波糖对d 一葡萄糖苷酶的抑制活性效果 F ig 2 E b c to fa c a r b o s ec o n c e n t r a t io no nt h ein h ib it o r ya c t iV it y o fc c g lu c o s id a s e 2 4 具有o 一葡萄糖苷酶抑制活性菌株的初步筛选 本实验根据已经验证的筛选体系，对2 1 2 株海 绵共附生微生物的代谢产物( 粗提物) 进行筛选，活 性测试使用的菌株粗提物浓度均为o 8m g c m 3 筛选结果发现2 1 2 个样品中可以抑制Q 一葡萄糖苷 酶的样品较多，即筛选的样品的阳性率较高，具体 的阳性率分布情况：抑制率为o 1 0 的样品数占 总样品数的7 7 5 ，抑制率为1 0 2 0 的样品数 占总样品数的1 7 o O ，抑制率为3 0 5 0 占 4 1 0 4 ，抑制率5 0 占8 9 6 在上节实验中 阿卡波糖纯品最大抑制率为5 8 ( 1 6m c m 3 ) ， 说明抑制率大于5 0 的粗提物样品中含有对d 一葡 萄糖苷酶抑制活性较高的成分，具有进一步的研 究价值 2 5 具有o - 葡萄糖苷酶抑制活性菌株的复筛 为准确测定样品的抑制活性，从初筛结果中选 出抑制率值超过5 0 的1 9 株菌株的粗提物进行重 复活性测试，样品的测试浓度均为O 8m c m 3 ，得 到各样品的抑制率如表2 所示1 9 个粗提物样品的 抑制率值均高于阿卡波糖纯品( 4 9 1 6 ) ，其中有5 个样品的抑制活性高于7 5 表21 9 株菌粗提物的a 一葡萄糖苷酶的抑制效果 T a b 2 I n h ib it 0 1 了e f f e c t sa g a in s t 仪一g lu c o s id a s eb y 19m e t a b o lit e se x t r a c t s 注：1 9 株菌粗提物的测试含量为O ，8m g c m 3 对抑制活性最高的5 个样品( 编号分别为 H Y l6 0 、H Y 9 5 、H Y 9 3 6 、H Y 3 6 0 、H Y 9 4 ) ，降低它们的粗提 物浓度至0 4m g c m 3 和0 6m c m 3 进行o 【葡萄糖 苷酶活性测试，并与0 8m g c m 3 浓度下的测试结果 相比较结果如图3 所示 台湾海峡 阿卡波糖 H Y H Y 9 3 6H Y 3 6 。H Y 9 5H Y 9 4 样品 图35 个粗提物样品对d 一葡萄糖苷酶活性的抑制效果 n g ，3I n h ib it o r ye f f e c t sa g a in s td g lu c o s id a s eb y5m e t a b o lit e se x t r a c t s 从图3 中可以看出，在相同的浓度条件下，5 个样 品的抑制活性均大于阿卡波糖，当样品的浓度在0 6 m c m 3 时，它们的抑制活性仍大于6 0 ；当样品浓度 降至0 4m c m 。时，H Y 叭H Y 、H Y 姗、H Y 舛四个粗提 物样品的抑制效果均有明显的下降，其中H Y 9 5 、H Y 的抑制率下降趋势明显在活性最高的5 份粗提物中， 只有样品H Y 的抑制活性在测试浓度为0 4 、0 6 、0 8 m c m 3 时均高于7 0 ，说明该粗提物的活性成分可以 在较低浓度下维持较高的仪葡萄糖苷酶抑制活性 2 6 菌株H Y 9 3 6 的16 Sr D N A 测序 菌株H Y 。，。代谢产物对仅一葡萄糖苷酶有显著抑 制效果，将提取的菌株H Y 。娟基因组进行1 6 sr D N A 序列的P C R 扩增，并对扩增产物进行测序，结果得 到含有l3 5 8 个核苷酸的1 6 Sr D N A 序列将菌株 H Y ，。的序列与G e n B e n k 数据库序列比对，选取同源 性9 8 以上的8 株菌株进行序列分析，采用 M E G A 5 0 5 软件构建系统发育树，如图4 所示 I - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ J 0O 0 0 2 图4菌株H Y 。，。的1 6 sr D N A 核苷酸序列系统发育树 F ig 4 P h y lo g e n e t ict r e eo fs t r a in sH Y 9 3 6b a s e do n1 6 Sr D N An u c le o t id es e q u e n c e s 从菌株H Y 的1 6 sr D N A 核苷酸序列系统发 育树可以看出，所选取的相似度很高的8 种菌株都 是芽孢杆菌，且菌株H Y 。娟与芽孢杆菌属的坚强芽 孢杆菌( B n c 删淞芦r m w ) 同源性最高，相似性达到了 9 9 7 ，故确定菌株H Y 。，。为B o c 删w r m w 3 讨论 研制仪一葡萄糖苷酶抑制剂一直是人们关注的 焦点，近年来，新型仪一葡萄糖苷酶抑制剂的出现为 一些疾病的治疗带来有效途径，并且有很多从植物、 微生物代谢产物中筛选提纯出的仪葡萄糖苷酶抑 制剂已经得到人们的广泛应用本研究通过建立仅 葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，对2 1 2 株海绵共附生 微生物代谢产物进行仅葡萄糖苷酶活性测试，从中 筛选出具有抑制活性的菌株，结果发现菌株H Y 。，。 对d 一葡萄糖苷酶具有显著的抑制效果对菌株 加 如如 加m 0 摹、碍器嚣 3 期 查鑫轰，等：海绵共附生微生物中具有仅一葡萄糖苷酶抑制活性菌株的筛选与初步鉴定 3 8 5 H Y ，。进行1 6 sr D N A 测序，通过核苷酸序列对比，鉴 定出该菌株为日n c 跏u s m 嬲近年来，对B o c 泖w 丘卜 m w 的研究更多地体现在其对抗生现象的开发和利 用上 1 7 1 ，但具有仪葡萄糖苷酶抑制效果的相关报 道甚少在接下来的研究工作中，将重点研究口n c 沮 地r m 嬲代谢产物的分离活性化合物，希望得到活 性更高的仅一葡萄糖苷酶抑制剂纯品 参考文献： 1 M u n mMHG ，B lu n tJw ，D u m d e iEJ e ta 1 T h ed is c o v e r ya n dd e v e lo p m e n to fm a r in ec o m p o u n d sw it hp h a n n a e u t ic a l p o t e n t ia l J B io t e c h n o l，1 9 9 9 ，7 0 ( 1 3 ) ：5 2 5 2 F a n gJR B io a c t iv es u b s t a n c e sd e r iv e df 而ms p o n g e m ic r o o 唱a n is ms y m b io s is J c h in e s eJ o u m a lo fM a r in eD r u g s ，19 9 5 ，5 4 ( 2 ) ：5 2 5 4 3 M u I a k a m i Y ，T a k e iM ，s h in d oK ，e ta 1 c y c lo t h e o n a m id eE 4a n dE 5 ，n e wp o t e n tt r y p t a s ein h ib it o r sf r o ma nI r c in ias p e c ie so f s p o n g e J J o u m a l o f N a t u r a lP m d u c t s ，2 0 0 2 ，6 5 ( 3 ) ：2 5 9 2 6 1 4 H e n t s c h e l u ，u s h e rKM ，T a y lo rMw M a r in es p o n g e sa sm ic m b ia lf e 瑚e n t e r s J F E M sM ic m b io lE c o l，2 0 0 6 ，5 5 ( 2 ) ：1 6 7 1 7 7 5 L i x ，Q inI M e t a g e n o m ic s _ b a s e dd m gd is c o v e r ya n dm a r in em ic m b ia ld iv e r s it y J T r e n d sB io t e c h n o l，2 0 0 5 ，2 3 ( 11 ) ：5 3 9 5 4 3 6 V a nd eL a a rFA ，L u c a s s e nPL ，A k k e im a n sRP ，e ta 1 A lp h a g lu c o s id a s ein h ib it o r sf o rt y p e2d ia b e t e sm e llit u s J c o c h r a n e D a t a b a s eS y s tR e v ，2 0 0 5 ，1 8 ( 2 ) ：36 3 9 36 4 1 7 B a r o nAD P o s t p r a n d ia l h y p e r g ly c a e m iaa n do 【一g lu c o s id a s ein h ib it o r s J D ia b e t e sR e s e a r c ha n dc lin ic a lP r a c t ic e ，1 9 9 8 ，4 0 ： 1 5 5 8 c a m p b e ll RK ，c a m p b e LK ，w h it eJR I n s u linlis p m ：it sr o leint h et r e a t m e n to fd ia b e t e sm e llit u s J A n n a lso fP h a r m a c o t h e r a p y ，1 9 9 6 ，3 0 ( 1 1 ) ：12 6 3 1 2 7 1 9 G a oxP ，z h a n gw Y ，z o uwJ ，e ta 1 s c r e e in gf o rd g lu c o s id a s e in h it o r sf t o me x t r a c t so ft m d it io n a lc h in e s em e d ic in e J N a t u r a lP m d u c tR e s e a r c ha n dD e v e lo p m e n t ，2 0 0 3 15 ( 6 ) ：5 3 6 5 3 8 1 o Y e hGY ，E is e n b e r gD M ，K a p t c h u kTJ ，e ta 1 s y s t e m a t icr e v ie wo fh e r b sa n dd ie t a r ys u p p le m e n t sf o rg ly c e m icc o n t m l ind ia b e t e s J D ia b e t ec a r e ，2 0 0 3 ，2 6 ( 4 ) ：12 7 7 12 9 4 11 M a r t inAE ，M o n t g o m e r yPA A c a r b o s e ：a nd g lu c o s id a s e in h ib it o r J A m e r ic a nJ o u r n a l o fH e a lt h s y s t e m P h a n lla c y ，l9 9 6 ， 5 3 ( 9 ) ：22 7 7 - 22 9 0 1 2 s e if a r t hc ，B e r g m a n nJ ，H o ls tJ ，e ta 1 P r o lo n g e da n de n h a n c e ds e c r e t io no fg lu c a g o n 一1 ik ep e p t id e1 ( 7 3 6 a m id e ) a f t e ro r a ls u c I D s ed u et oa lp h a g lu c o s id a s e in h ib it io n ( a c a r b o s e ) int y p e 2d ia b e t icp a t ie n t s J D ia b e t icM e d ic in e ，1 9 9 8 ，1 5 ( 6 ) ：4 8 5 4 9 1 13 c h e r k a o u is ，D a a liY ，c h r is t e nP ，e ta 1 D e v e lo p m e n ta n dv a lid a t io no fliq u idc h m m a t o g r a p h ya n dc a p illa r ye le c t r o p h o r e s is m e t h o d sf o rA c a r b o s ed e t e r m in a t io ninp h a m a c e u t ic a l t a b le t s J J o u r n a l o fP h a r m a c e u t ic a la n dB io m e d ic a l A n a ly s is ，l9 9 8 ，18 ( 4 5 ) ：7 2 9 7 3 5 1 4 M e h t aA ，z it a m a n nN ，R u d dPM ，e ta 1 o l G lu c o s id a s ein h ib it o r sa sp o t e n t ia lb r o a db a s e da n t i v ir a l a g e n t s J F E B sL e t t e r s ，1 9 9 8 ，4 3 0 ( 1 ) ：1 7 2 2 1 5 P ie r r ec ，R o la n dR ，T r e m b la yD P N it m p h e n o l- o I - g lu c o p y r a m o s id ea ss u b s t r a t ef o rm e a s u r e m e n to fm a lt a s ea c t iv it yinh u m a n s e m e n J J o u r n a lo fc lin ic a lc h e m is t r y ，1 9 7 8 ，2 4 ( 2 ) ：2 0 8 2 1 1 1 6 M o r e n oC ，R o m e r oJ ，E s p e j oRT P o ly m o r p h is minr e p e a t e d16 sr R N Ag e n e sisac o m m o np m p e r t yo ft y p es t m in sa n de n v i r o n m e n t a lis o la t e so f t h eg e n u sW 6 r io J M ic m b io lo g y ，2 0 0 2 ，1 4 8 ( 4 ) ：12 3 3 一l2 3 9 1 7 B u r k h o ld e rPR ，P 6 s t e rRM ，L e it zFH P m d u c t io no fap y H D lea n t ib io t icb yam a r in eb a c t e r iu m J A p p lie dM ic r o b io lo g y ， 1 9 6 6 ，1 4 ( 4 ) ：6 4 9 6 5 3 3 8 6 。 台湾海峡 3 1 卷 S c r e e n in ga n did e n t if y in gf o rs t r a in sw I t hin h ib it o r ya c t iv it ya g a in s t o g I u C O S id a S ef r O mm a r in eS p O n g ea S S O C j a t e dm iC r O O r g a n iS m S Z H A X in y a 0 1 ，J I NC u i lil ，C H E NY u q iu l，M I A 0L il2 一，Z H UX ia o w e n l，Z H O UX ia o - j ia n l- 2 ( 1 C o lle g eo fE n V ir o n m e n t a l S c ie n c e E r 坞in e e r in g ，Y a n g z h o uU n iv e r s it y ，Y a n 9 2 h o u2 2 5 】2 7 ，C h in a ； 2 。M a r in eS c ie n c e & T 宅c h n o lo g yI n s c it u t e ，Y a n g z h o uU n iv e r s it y ，Y a n g z h o u2 2 5 1 2 7 ，C h in a ；3 S t a t eK P y I r a t o r y o fD m gR e s e a r c h ，S h a n g h a jI n s t it u t eo fM a t e r iaM e d ic a ，C h in e s eA c a d e m yo fS c ie n c e s ，S h a n g h a i 2 0 1 2 0 3 ，C h in a ) A b s t r a c 土：M a r in es p o n g ea s s o e ia e dm ic r o o r g a n is m sa r eim p o n a n ts o u r e eo fn a t u r ep r ( d u c t sf o rp h a f m a c e u ic a ls I t isap o t e n t ia l w a yf 6 rd e V e lo p in gn e wd ia b e t e sd m g ( 仅一g ly c o s id a s e in h ib it o r ) I n t h iss t u d y ，t h eo 【g lu c o s id a s ein h ib it o r ya c t iV it ys c r e e llin gm o d e lisb u ilt u p t os e a r c hf o rt h ea c t iv ec n ld ee x t r a c tf 而mt h em ic r o o r g a n is mm e t a b o lit e s a m p le sp r e p a r e df b mm 撕n es p o n g e sinF r id a yh a r b o ro fU S T h er e a c f io ns y s t e mo ft h eo 一对1 】e o s id a s ein h ib it o r y a c t iV it ys c I | e e n in gisp e I f o H I le do na9 6w e llsp a n e lT h er e a c t io nc o n d it io n ，in c lu d in gt h ec o n c e n t r a t io no fe n z y m e s ， iss e ta