973项目结题报告

1 / 20 973 项目结题报告 973 课题结题报告 课题名称：大豆重要新基因的发掘与有效利用研究 课题编号： TG1998010206 负责人：喻德跃 承担单位：南京农业大学、中国农科院品资所、吉林省农科院 协作单位：中国科学院遗传发育所 XX 年 10 月 15 日 一、计划任务完成情况 计划任务 本课题的任务： 发掘大豆抗花叶病毒、抗食叶性害虫、产量有关性状、育性恢复系等新基因，明确遗传规律，并进行标记和 定位。具体指标如下： 、抗大豆花叶病基因方面： 标记到2 3 个抗性基因 , 纳入遗传图谱 ; 育成抗性品系个 ,作为育种新种质。 、抗食叶性害虫基因方面： 标记到个抗性主基因 ,纳入遗传图谱 ; 育成抗性品系个 ,作为育种新种质。 3、产量有关性状基因方面： 标记到 3 4 个产量有关性状的基因位点 ,纳入遗传图谱 ; 育成具 2-4 种特异性状的优良共同遗传背景家系 ,用2 / 20 于聚 合重组。 4、质核互作雄性不育恢复基因方面 筛选与恢复基因紧密 连锁的分子标记 10cM，对恢复基因进行定位。 5、发表 SCI 引用论文五篇以上。 完成情况 本课题鉴定出一批新的基因资源，包括：抗 SMV、感SMV、抗食叶性害虫、感食叶性抗虫、产量性状、恢复系，建立了重组近交家系群体 8 个。定位了 9 个新基因，获得分子标记 10 个，培育一批有育种价值的中间材料。共计发表论文 25 篇，其中 SCI 收录 6 篇，国际特邀报告 5 篇 ,专著 1部 ,培养研究生 11 人。总体上超额完成了任务目标。 主要进展 1、资源鉴定与群体培育 抗大豆花叶病毒 方面 鉴于国内大豆 SMV 株系鉴别寄主体系的混乱，在已经使用过的 25 个鉴别寄主中选拔出 8 个代表性寄主组成一套新的鉴别体系。在长江中下游地区广泛采集病样，以寄主鉴定为主、结合 SMV 的组织印迹检测技术和 RT-PCR 检测技术，发现自 20 世纪 80 年代至今， SMV 群体已经产生根本改变，尚未发现原先鉴定过的株系。根据新鉴别体系的鉴定结果，确定了 10 个新株系，其中 SC-8 为强毒性株系群。发现：3 / 20 SMV 株系群组成复杂，同一株系 群在不同地区的流行存在差异，同时不同株系群在同一地区的分布也有所不同。综合 1998-2002 年的分析结果，认为：在株系组成上，黄淮地区以 SC-3 和 SC-7 为主。长江中下游地区以 SC-9 为主。 测定了 106 份大豆品种对 SC-7 、 SC-8、 SC-9 三个株系群的抗性反应，筛选出 17 份对三个株系均表现高抗的材料； 18 份能兼抗三个株系中的两个株系的材料。 构建了抗 X 感杂交组合衍生的 RIL 群体：科丰 1 号 X南农 1138-2， F7： 12， 206 个家系 。 用东北 3 号株系对 355 份大豆种质资源进行了 SMV抗性鉴定。共筛选出 116 份高抗资源， 117 份中抗材料， 122份高感资源。 抗食叶性害虫基因方面 综合 1993-2002 年的田间鉴定结果，获得一批高抗食叶性害虫和高感食叶性害虫的大豆种质。高抗的品种 9 份：黄皮小青豆、日本、 Larmar、 PI227687、矮杆黄、 York、阜阳 170、 SP26、早 16 号，抗的品种 15 份，表现中间的品种17 份，感的品种 7 份，高感的品种 10 份：大浦大粒黄、中豆 19、南农 86-4、南农 86-4、江宁中老鼠豆、监利牛毛黄、花柒黄毛豆、沔阳白毛豆、吴江青豆、 PI229358。 合成重组近交家系群体 2 个，包括： 先进 2 号 X 赶4 / 20 泰 -2-2 已推进到 F7： 9 世代，含 162 个家系；和 皖 82-178X 通山薄皮黄豆甲也推进到 F7： 9 代，含 159 个家系 。 产量性状基因方面 获得了与提高产量潜力有关的资源 8 份，包括百粒重高、主茎节数多、短叶柄、曲茎、顶生长花序等。 构建了 RIL 群体 2 个，包括：南农 87-23 X NG94-156；波高 X NG94-156。 恢复基因方面 获得利于大豆杂种优势应用的恢复系： 10 个。 阐明了细胞质不育的遗传模式：以栽培大豆不育系YA、保持 系 YB 和含有不育细胞质的原始母本 167 为基础材料，配制了二个单交组合，四个三交组合，根据后代的育性和分离比例判断遗传模式。试验结果表明： S 基因型 F1 花粉为半不育， F2 可育与半不育分离比例为 1： 1；母本为不育细胞质 S 时，携带 rf 的雌配子有生活力，能传给后代，而携带 rf 的雄配子无生活力， 不能传给后代。母本为正常可育细胞质 N 时，携带 rf的雌、雄配子均有生活力，可传给后代。分离比例是单基因遗传模式。因此该不育系属“单基因配子体不育”，即不育性由不育细胞质基因 S 和一对隐性基因 rfrf 控制，一个显性基因 Rf 的存在即可恢复育性。 明确了育性的稳定性： 利用人工气候箱，设不同温5 / 20 度和光照长度处理，研究野生型大豆细胞质雄性不育系 OA和保持系 OB 的育性稳定性。鉴于试材原产于高温短日照的夏大豆区，本试验以 14 小时光照和昼夜温度 30 /20为对照处理，在 14 小时不变光照条件下，温度处理为 35 /25，30 /20， 25 /15；在昼夜温度固定为 30 /20条件下，光照处理为小时， 14 小时，小时。在上述所有处理中，不育系 OA 花粉败育率均保持在 99%以上。只有保持系在小时光照时，花粉败育率上升到 %，这一结 果表明，不育系 OA 在温度与光照大幅度变化的情况下，不育性极为稳定。 从细胞学方面明确了不育发生的时期：细胞学观察发现该不育系小孢子减数分裂正常，绒毡层亦无明显异常，不育发生的时期是在单核期以后。 表 1 本课题培育的 RIL 群体 2、新基因发掘与分子标记 抗大豆花叶病毒基因方面通过对 P、 P、 12 F1 和 F7： 11 184 个家系的田间抗性鉴定和遗传分析，发现科丰 1 号对 SMV 株系群 SC-7、 SC-8、 SC-9 的抗性分别由一对显性基因控制，并将 Rsc-7、 Rsc-8、 Rsc-9 基因定位于 N8D1b+W 连锁群上，与已经定位的三个抗性基因位于同一连锁群，成簇排列。此外，筛选到与抗性基因连锁的 SCAR标记和 RAPD 标记，距 Rsa 和 Rsc 的距离分别为和。 由于 SC-7、 SC-8、 SC-9 是新鉴定的 SMV 株系群，而6 / 20 鉴定的抗性基因位点与已经发现的 SMV 抗性位点位置不同，因而初步认为： Rsc-7、 Rsc-8、 Rsc-9 是新的抗 SMV 基因。 此外，选育出 NJR25-8、 NJR32-8、 NJR-44-1 等综合性状优良、抗性好的中间材料。 利用高抗 SMV3 号株系的大豆品系 95-5383 与感病品种 HB1，铁丰 21， Amsoy， Williams，和抗病品种 PI486355配制杂交组合，对各组合的 F1、 F2 代接种 SMV3 号株系进行抗性鉴定，结果表明， 95-5383 与各感病品种的杂交组合 F1代表现为感病，抗病为隐性， F2 群体分离比例为 1R： 3，表明 95-5383 对 SMV3 号株系的抗性是受一对隐性基因控制。PI486355X95-5383 的 F2 代有感病植株分离， 95-5383 的抗病基因与 PI486355 不在同一位点。 利用 BSA 法对 95-5383?HB1 的 99 株 F2 个体进行鉴定，筛选出与 SMV 抗病基因紧密连锁的共显性 RAPD 标记OPN11980/1070。 RAPD 引物 OPN11 在 95-5383 和抗池扩增出OPN11980 片段，在 HB1 和感池扩增出 OPN111070 片段，在F1 同时扩增出 OPN11980 和 OPN111070。 用该引物分析95-5383?HB1 的 F2 个体，共显性的 RAPD 标记 OPN11980/1070与抗病基因的遗传距离为。 从 95-5383和 HB1中分别回收 OPN11980和 OPN111070特异片段，序列分析 结果表明 OPN11980 和 OPN111070 的实际长度分别为 986bp 和 1084bp，同源性为 %，主要差别是在7 / 20 两个不同区段插入 54bp 和 35bp 的碱基。用克隆的 RAPD 片段 OPN11980 作探针对亲本基因组 DNA 进行 Southern 杂交，结果表明 OPN11980 和 OPN111070 在大豆基因组中是以低拷贝形式存在。根据克隆片段 OPN11980 和 OPN111070 的序列设计合成了一对 SCAR 引物 SCN11， SCN11 在 95-5383、 HB1和 95-5383 HB1 的 F2 群体扩增结果与 RAPD 引物 OPN11 完全吻合。 用 RAPD引物 OPN11和 RFLP探针 SOPN11分析科丰 1?南农 1138-2 重组近交群体，将 OPN11 和 SOPN11 定位于 F 连锁群的抗病基因簇上。由于 95-5383?PI486355 的 F2 代接种后有感病植株分离且抗病基因位于 F 连锁群上与 Rsv1 不等位，表明可能定位的是新的抗病基因。 此外，用 OPN11 分析了 68 份抗性资源，其中有 25份扩增出 OPN11980，表明这些品种可能携带与 95-5383 相同的抗性基因，而其它扩增出 OPN11980/1070 和 国家重点 基础发展规划项目 课题结题总结报告 项目编号： G1998010200 项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究 首席科学家：贾继增 张启发 课题编号： G1998010207 课题名称：水稻抗病基因克隆 8 / 20 课题负责人：翟文学 子课题负责人：翟文学 彭开蔓 承 担 单 位：中国科学院遗传所，华中农业大学 电子信箱： wxzhai, XX 年 9 月 30 日 一、计 划任务完成情况 本课题的预期目标是分离克隆 2 个水稻抗病基因。我们已经按计划开展了研究工作，分别对水稻抗白叶枯病基因 Xa3、 Xa4、 xa5、 xa13、 Xa25 和 Xa26 以及抗稻瘟病相关基因进行了克隆研究。目前已克隆并证实了 Xa26 基因；已克隆 Xa4 和 xa5 基因，即将证实其功能；精细定位了 Xa3、xa13 和 Xa25 基因；获得了 3 个抗稻瘟病相关基因。基本达到预期研究目标。 具体工作与取得的进展如下 : 1. 精细定位了水稻抗白叶枯病基因 Xa4 和 Xa26 我们利用 F2大 群体，分别对水稻抗白叶枯病基因 Xa4和 Xa26 进行了遗传分析和精细遗传定位。这两个基因都位于第 11 号染色体的长臂末端并紧密连锁。涉及 Xa4 基因和Xa26 基因遗传分析的工作已发表。 2. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因 Xa26 我们采用图位克隆法从水稻品种明恢 63中分离克隆了 Xa26 基因。序列分析发现这该基因编码 LRR 受体激酶类9 / 20 蛋白质。研究还发现，无论是在苗期还是成株期携带 Xa26基因的转基因水稻的抗谱比 Xa26 基因的供体水稻品种的抗谱显著增宽，抗性明显增强，说明遗传背景可能影响抗病主效 基因的作用。分离克隆 Xa26 基因的工作正在发表印刷之中。另外，研究还发现携带抗白叶枯病基因 Xa3 的近等基因系 IRBB3 和携带抗白叶枯病基因 Xa22 的云南地方稻品种扎昌龙也携带 Xa26 基因。因为 Xa3 和 Xa22 基因也被他人定位于第 11 号染色体长臂末端，推测 Xa26、 Xa3 和 Xa22 是同一个基因，这部分验证工作正在进行之中。 3. 分离克隆了水稻抗白叶枯病基因 Xa4 我们采用图位克隆法从水稻近等基因系 IRBB4 中分离克隆了 Xa4 基因。序列分析发现这该基因也编码 LRR 受体激酶类蛋白质。 Xa4和 Xa26属于同一个基因家族的不同成员。抗性分析发现发现籼稻品种特青和 93-11 与 IRBB4 的抗谱相同，序列分析发现特青和 93-11 也携带 Xa4 基因。转基因初步实验结果显示遗传背景可能也影响 Xa4 基因的抗性。目前，这部分工作正在完善之中。 4. 分析了 Xa4 和 Xa26 所属基因家族的进化 Xa4 和 Xa26 基因所属家族包括 10 个成员。我们对水稻品种明恢 63 和特青包含 Xa26 基因家族的大约 100 kb 区段进行了测序，对比公共数据库中的水稻品种日本晴和93-11 的同源区段的序列，分析了抗病 基因的进化模式。涉10 / 20 及这部分工作的论文正在撰写之中。 5. 鉴定并精细定位了一个水稻抗白叶枯病新基因Xa25 在杂交水稻恢复系明恢 63中鉴定了一个新的抗白叶枯病显性基因 Xa25。该基因在苗期和成株期都能特异性的抗白叶枯病菌生理小种 PXO339。通过分析携带 Xa25 基因的重组自交系群体，将该基因定位于水稻第 12 号染色体的着丝粒区。在该着丝粒区段已经定位了多个水稻抗稻瘟病基因，推测 Xa25 基因与抗稻瘟病基因紧密连锁或等位。涉及 Xa25基因的研究工作已发表。 6. 构建了水稻全生育 期平衡化 cDNA 文库 利用水稻品种明恢 63，构建了全生育期平衡化 cDNA文库。该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的 15种不同组织的 cDNA 组成，包括白叶枯病菌和稻瘟病菌接种诱导后的组织。该文库包含大约 62,000 个克隆，平均插入片段为 kb 。对该文库中的大约 4 万个 cDNA 克隆进行了测序， 获得两万多个非重复 EST 序列。利用该文库我们建立了高效 cDNA 芯片分析体系。 7. 发展了一种新的 EST 聚类方法 我们发展了一种新的计算机分析方法，用于分析大规模 EST 测序中所产生的大量数据，以获得高质量、非重复表达序列。该方法在聚类过程中采用 MEGABLAST 工具对一致11 / 20 序列进行序列同源比较，并用 phrap 程序对每一 EST 簇进行拼接检验。这一聚类策略能降低测序错误带来的影响，有效识别基因家族成员，并避免选择性剪接的干扰。与 NCBI 的UniGene clustering 方法相比， ESTClustering 的聚类结果可以更好地反映表达序列的多样性。涉及这部分工作的论文已经发表。 8. 克隆获得了一批水稻抗性基因同源序列 利用植物 NBS LRR 类抗性基因 的高度保守区设计PCR 引物从水稻基因组中扩增同源序列，经克隆测序确定后获得了 23 个不同的 NBS 片段。将这些 RS 序列在窄叶青 /京系 17 的重组自交系构建的分子图谱上定位，定位结果表明它们分布在 1， 3， 4， 7， 8， 9， 10 和 11 染色体。其中 10个 RS 位于已知 R 基因所在的染色体区间。这些 RS 标记可以作为图位克隆同一位点上相应抗病基因的起点。有关结果已发表。 9构建了含 Xa4、 xa5和 xa13三个抗性基因的 IRBB56基因组 BAC 文库 利用含 Xa4、 xa5 和 xa13 三个水稻白叶枯病抗性基因的累加系 IRBB56 构建了一个水稻细菌人工染色体文库。该文库包含 55296 个克隆，平均插入片段为 132 kb。按水稻基因组为 450 Mb 计，该文库覆盖 14 倍基因组，筛选出任一水稻基因或序列的概率为。用均匀分布的 3 个叶绿体基因12 / 20 和 4 个线粒体基因克隆作探针 筛选文库，结果显示该文库中含细胞器基因组 DNA 同源序列的克隆数小于 1。用分布于水稻 3 条不同染色体、分别与 Xa4、 xa5 和 xa13 连锁的 DNA 标记筛选文库，分别检测出 11-106 个阳性克隆，为克隆这些基因打下了基础。该文库对水稻基因组的高度覆盖 率和较大的插入片段，非常适合于物理作图和基因的分离和克隆。本研究中建立的提取高质量水稻基因组 DNA方法和高效转化方法被成功地用于中国超级杂交稻测序。 10、克隆了一个 NBS-LRR 类抗性基因家族 用水稻抗白叶枯病基因 Xa4 的近等基因系和基因累加系对克隆的 NBS-LRR 同源序列 RS13 进行 RFLP 分析，发现序列 RS13来自 Xa4基因位点。利用克隆的抗病同源序列 RS13作为探针，从水稻 IR64 的 BAC 文库中筛选到 4 个阳性克隆，其中一个克隆 14E19 能够覆盖其余 3 个克隆。对 14E19 进行了 全序列测定和分析，获得了 73kb 的全长 DNA 序列，基因预测显示其上有 4 个编码 NBS-LRR 的基因，分别命名为 NL-A D。同时 ,对近等基因系 IRBB56 同一基因组位臵的 BAC 克隆 106P13 进行分析，发现其上有 10 个 NL 同源拷贝，其中有 4 个同 14E19 上的 NL 一样，说明 NL 是一个至少有 10 个成员的基因家族。搜索日本晴、 93-11、广陆矮 4 号的序列，发现三者也有多个高度同源的序列。对 NL 基因进行 RT-PCR13 / 20 和 cDNA库筛选分析，发现 NL-B能够在含抗白叶枯病基因 Xa4水稻品系 IRBB4 中特异表达，说明 NL-B 参与了白叶枯病抗性反应。把这些同源拷贝作为新的抗病基因进行研究，转基因实验正在证实这些同源拷贝的功能。 11、定位克隆了隐性抗白叶枯病基因 xa5 的候选基因 本研究利用 RFLP、 CAPS 等标记方法对 xa5 近等基因系 IR24 和 IRBB5 构建的 F2 群体共 5000 个单株进行群体连锁分析，构建了 xa5 的精细遗传图谱。在此基础上我们用 与xa5基因紧密连锁的标记筛查含有 xa5 的水稻累加系 IRBB56的 BAC 文库，构建了包含 xa5 基因位点的精细物理图谱。将xa5限定在 12kb的片段上，在此区间发 现唯一一个候选基因，与已知抗病基因具有不同的结构。该基因与显性等位基因编码的氨基酸序列有差异。目前功能互补实验已获得转基因植株。 12开展了抗白叶枯病基因 Xa3 和 xa13 的精细定位与图位克隆 本研究利用 IR24 与含 Xa3 基因的近等基因系 IRBB3组合构建了约 2000 单株的 F2 定位群体，并利用国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组计划所公布的第 11 染色体长臂上的序列设计出一系列 SSLP 和 CAPS 标记，对 Xa3 进行精细定位，将 Xa3 基因定位于 CAPS 标记 Y3 和 SSR 标记 RM14414 / 20 之间，距 Y3 约，距 RM144 约。目前，我们又利用日本晴和IRBB3 组合构建了约 5000 单株的 F2 群体，对 Xa3 基因作进一步精细定位。 利用 xa13 的近等基因系构建了包含 4000 单株的 F2群体，将 xa13 基因界定在第 8 染色体 80Kb 的区间。对这个区间进行 DNA 测序和基因预测，发现了可能的候选基因，正对这些候选基因进行共分离分析和功能互补分析，有望获得突破。 13、分离克隆了抗稻瘟病相关基因 本研究利用 cDNA-AFLP 和组池分离分析相结合的方法来检测稻瘟病抗池和感池中特异表达的基因。 在大约20162个检测到的位点中，一共获得了 12个差异表达的条带，8 个来自抗池， 4 个来自感池。利用水稻的 DH 群体对它们进行遗传定位结果表明其中的 5 个 DEBs， R1, R8, S9, S16 和S17被定位在第一染色体的一个抗稻瘟病的 QTL所在的区间。 序列分析和等位分析发现 R1 和 S16， R8 和 S9 分别来自二对等位基因位点，而且 R1， S17 和 R8 分别位于第一染色体上三个紧密相连的 BAC/PAC 克隆中，这更进一步证实了 R1， S17 和 R8 在第一染色体上 QTL 包含区间中的紧密连锁关系。逆向 Northern Blotting 和定量 RT-PCR 分析表明 R1， S17和 R8 在接种稻瘟病菌后的表达水平都是上调的，这暗示它们都参与了稻瘟病抗性反应过程。有关结果已投送国际学术15 / 20 刊物。 二、研究水平与创新性 本研究是在基因的水平上发掘水稻的抗病种质，重点是克隆符合“基因对基因”假说的，以过敏性抗病反应为基础的水稻抗病基因。已克隆的多种植物的抗病基因在序列结构上分为五种类型，而迄今正式见诸于报导的克隆的水稻抗病基因只有 4 个，即抗白叶病基因 Xa21 和 Xa1，抗稻瘟病基因 Pib 和 Pi-ta。它们分属于二种不同的 结构类型。这对于全面深入了解水稻抗病基因的本质还是远远不够的，而且也不能满足育种上对抗病基因的需求，而这二个方面正是本研究重点解决的科学问题。 本研究特色在于应用水稻基因组研究的遗传作图和物理作图的综合技术以及在基因组测序基础上发展起来的基因预测方法，充分利用水稻基因组较小的特征，从多种途径发现抗病和感病的水稻材料的遗传差异，克隆水稻的抗病基因。本课题克隆 Xa26 和 Xa4 等显性抗病基因补充和发展了植物抗病基因的研究结果，而且克隆的几个抗病基因均有重要的实用价值，研究结果将促进水稻抗病分子育种的发展。 虽然近年来抗病基因研究取得许多突破，但是我们也发现已克隆的植物抗病基因多为显性基因，隐性抗病基因的研究进展不大。隐性抗病基因的研究成为目前植物抗病研16 / 20 究的新问题。为此我们在本课题后期启动了水稻隐性抗病基因 xa5 和 xa13 的克隆，这一研究具有很高的创新性。目前已将 xa5 限定在 12kb 的片段上，在此区间发现并分离出一个编码转录因子的候选基因，与已知抗病基因具有不同的结构。该基因一旦证实，将成为植物抗病基因研究的重要突破。对隐性抗病基因进行克隆和研究，有助于全面解析植物的抗病机制以及抗病新思路的提 出。 973 计划项目结题验收办法 973 计划项目实施期满应进行结题验收。若由于客观原因不能按期进行结题验收，项目首席科学家应商项目依托部门向科技部业务主管司提出延期结题验收的申请。项目结题验收只能延期 1 次，延期申请最迟在项目实施期满前 3个月提出。 结题验收工作包括课题验收和项目验收两个阶段，项目验收在课题验收的基础上进行。课题验收由项目首席科学家和项目依托部门负责，项目验收由科技部负责。 1. 课题验收 课题验收由项目首席科学家主持，会同项目 依托部门对项目及各课题实施情况进行全面总结与评估。课题验收应在项目结题后 1 个月内完成。课题负责人在课题验收前，应认真编制课题结题总结报告和课题经费决算报告。 项目首席科学家商项目依托部门组建课题验收专17 / 20 家组。课题验收专家组一般由 11 15 人组成，项目首席科学家任组长，成员包括不承担任务的项目专家组成员、领域专家咨询组责任专家、特邀同行专家以及项目依托部门管理专家等。 课题验收一般以会议方式进行。课题验收专家组在全面听取各课题负责人及学术骨干汇报和审议课题结题总结报告的基础上，对各课 题计划任务完成情况、研究成果的水平及创新性、课题对项目总体目标的贡献、研究队伍创新能力、人才培养情况以及数据共享与数据汇交情况、技术资料归档情况、经费使用情况等作出评价。课题验收既要总结成绩，又要分析存在的主要问题。要严格审核项目成果的真实性，必要时可有重点地进行现场调研和考察。 课题验收工作完成后，项目首席科学家应会同项目专家组编写项目结题总结报告，经依托部门审核后，向科技部提交项目结题验收材料。 项目首席科学家应在规定时间内完成经费决算报告，经项目依托部门签署意见后报送科技部条 件财务司。 课题验收工作所需经费在项目首席科学家活动经费中列支。 2. 项目验收 项目验收由科技部业务主管司负责，一般应在课题验收后 2 个月内完成。 18 / 20 项目验收的同时，科技部条件财务司负责对项目进行财务验收。各项目承担单位应积极配合财务验收和科技部委托的中介机构对专项