何水林版基因工程第五章__基因的转移与重组体的筛选和.ppt

,第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定,一、粘性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起单酶切、双酶切,第一节DNA的体外重组,DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。,（一）直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的110%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,二、平末端（bluntend）的连接,（1）同聚加尾法,（二）人工加尾形成“粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。,非酶切位点,（2）衔接物（linker）连接,Linker：,用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸,GGAATTCCCCTTAAGG,EcoRIlinker：,（二）人工加尾形成“粘性末端”,（1）多核苷酸激酶处理,（2）T4连接酶连接,（3）限制性内切酶消化,（4）目的片段与载体连接,（二）人工加尾形成“粘性末端”,（3）DNA接头（adapter）连接法,adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）,Blunt-endedDNA,5p-GATCCCGG-OH33HO-GGCC-p5,BamHIadapter,P-,-P,5p-GATCCCGG-GGCC-,-CCGG-GGCCCTAG-P5,接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。,防止自我连接,5p-GATCCCGG-GGCC-,CCGGGGCCCTAG-p5,Blunt-endedDNA,5p-GATCCCGG-3GGCC-p5,BamHIadapter,P-,-P,5HO-GATCCCGG-GGCC,CCGG-GGCCCTAG-OH5,5HO-GATCCCGG3GGCC-OH5,nick缺口,nick缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5磷酸化,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,3端1520bp与模板互补；5端内切酶识别序列保护碱基,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。写出P1和P2的引物序列。,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,CCTAGGCGC,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,GGATCCGCG,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,CCTAG,PCR产物,-5,3-,G,G,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,TaqDNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,三、PCR产物的连接,2.与T载体直接连接,三、Gateway载体构建系统,噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。,入门克隆,改造过的各种表达载体,三、Gateway载体构建系统,（1）创建入门克隆BP反应：attB+attPattL+attR，产物：入门克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,三、Gateway载体构建系统,（2）构建表达克隆LR反应：attL+attRattB+attP，产物：表达克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,第二节重组体导入受体细胞,一、重组DNA导入大肠杆菌,（一）转化（transformation）,大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（三）转染（transfection）,受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。,（二）转导（transduction）,借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,（一）转化（transformation）,（1）热激法（heatshock）,（2）电转化法（electronporation）,（3）PEG介导的原生质体转化,（4）接合转化,制备感受态细胞,增加受体菌细胞膜的通透性,（1）热激法,目的,感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞,制备感受态细胞,1、将处于对数生长期的细菌置于0的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态；2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；3、经42短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。,（1）热激法,CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理,10ng载体DNA,100L感受态细胞,冰浴30min,4212min,加入1mLLB培养基（Amp-）,37振荡培养1h,10-100L转化液涂Amp平板,吸附DNA,摄入DNA,操作步骤：（p140）,转化率：106-108/gDNA,（2）电转化法,原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞,“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。,转化率：1091010/gDNA,（二）转导,由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程,（三）转染,噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。,与转化无本质区别,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106个噬菌斑,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,体外包装过程,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,原生质体转化碱金属离子介导的完整细胞转化PEG1000转化法电击法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,1.利用原生质体进行转化,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2PEG,插入外源基因的载体,共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法,转化,转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%33%,酵母,0.1mol/LLiCl处理,感受态,2.碱金属离子介导的完整细胞转化,热激,涂布选择性平板，筛选转化子,吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个/gDNA；共转化现象极少,4.电击转化,（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/gDNA（3）单链转化率高于双链,3.PEG1000转化,PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,载体介导的转化（农杆菌介导）DNA直接导入（基因抢法、电击法等）种质系统法（花粉管通道法等）,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,（二）导入植物细胞,1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA,（二）导入植物细胞,1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌,（二）导入植物细胞,1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,通过农杆菌侵染植物外植体,（二）导入植物细胞,1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株,在饲养平皿的滤纸上培养2天,叶盘法的具体操作,又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。,金属微粒加速，进入受体细胞,2.基因枪法（genegun）,具体操作,植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,电击处理,愈伤组织,幼苗,分化,3.电击法（电穿孔法）,选择培养,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.显微注射法4.DEAE-葡萄糖转染法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,原理：,（三）导入动物细胞,1.磷酸钙沉淀法,通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞,依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。,操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。,2.脂质体介导法,脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。,应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。,3.显微注射法,1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植,二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。,4.DEAE-葡萄糖转染法,葡聚糖,葡聚糖,DEAE-dextran,外源DNA,细胞,混合,DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理,吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。,4.DEAE-葡萄糖转染法,三、转化率及影响因素,转化率（cfu/gDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。,（一）转化率的计算：,转化率产生菌落的总数/DNA的加入量,三、转化率及影响因素,例：取1l（0.1ng/l）完整的质粒转化100l的感受态细胞。向转化反应液中加入900l培养液，让细菌恢复一小段时间，取100l铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？,转化率1000/0.01ngDNA=108cfu/g,三、转化率及影响因素,例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107cfu/mg天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？,104107cfu/mg10-2a20%重组载体a=0.5mg,三、转化率及影响因素,普通的亚克隆实验：1106cfu/gDNA；更复杂的亚克隆：1107cfu/gDNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆；构建文库：1108cfu/gDNA。,1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度2）受体细胞3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率,（二）转化率的影响因素,三、转化率及影响因素,一、载体表型选择法二、根据插入基因的表型选择三、DNA电泳检测法四、PCR检测法五、核酸杂交检测法六、免疫化学检测法七、DNA序列分析,第三节重组子的筛选与鉴定,1.抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322质粒上有两个抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。,一、载体表型选择法,2.-半乳糖苷酶显色反应选择法,-半乳糖苷酶,X-gal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,+,深蓝色,-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,二、根据插入基因的表型选择,1.弥补缺陷,his-,his+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,例：抗生素抗性,抗性基因载体,外源DNA,连接,转化受体菌,抗生素培养基平板,含抗生素抗性基因的克隆才能生长,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2.增加新性状,有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,1.直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,三、DNA电泳检测法,Marker,载体,重组克隆,2.酶切电泳筛选法,根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。,一般用重组时的内切酶将外源DNA切出,单,双,四、PCR扩增检测法,应用PCR反应扩增出预期DNA片断,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）；,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR；,（3）凝胶电泳；,（4）是否有条带产生，条带大小是否正确。,五、核酸杂交检测法,1.Southernblotting,从宿主细胞中提取DNA，用探针杂交。,2.Northernblotting,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，用探针杂交。,3.Westernblotting,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（SDS-PAGE）,点样,电泳方向,检测,3.Westernblotting,4.原位杂交筛选,利用抗体作为“探针”，检测产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。,六、免疫化学检测法,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,放射性抗体检测,与菌落杂交相似,DNA测序是最为准确的重组子鉴定方法，可以鉴定重组克隆序列是否准确无误。,七、DNA序列分析,（1）大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（-D-glucuronidase，GUS）；（2）细菌和萤火虫的荧光素酶（Luciferase）；（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（G