基因的体外重组和转化.ppt

,外源DNA,载体DNA,重组分子,原核细胞,真核细胞,扩增或表达,表达,连接,转化或转导,电穿孔或显微注射,受体细胞,7基因的体外重组与转化,7基因的体外重组与转化,1DNA片段的体外连接,2重组体导入细菌细胞,3重组噬菌体DNA的体外包装与转导,4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染,重组过程中，需要考虑的因素：（1）连接效率高、易于筛选；（2）便于回收外源基因；（3）在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。,基因的重组是依赖于限制性内切酶、DNA连接酶和修饰酶的作用，分别对外源基因和载体进行适当切割和修饰后，将外源基因和载体巧妙地连接在一起。,1DNA片段的体外连接,一、粘性末端的连接,二、平末端的连接,三、PCR产物的连接,四、体外连接应注意的事项,五、体外连接的结果,体外连接,DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应用广泛。,连接酶,一、粘性末端的连接,利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。,1.两段DNA的连接,依靠粘性末端,2.DNA片断与载体的连接,依靠粘性末端,3.载体与载体的连接,二、平末端（bluntend）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1.直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。,（1）同聚物加尾法,2.人工加尾形成“粘性末端”,末端脱氧核苷酸转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接,linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCCCCTTAAGG,EcoRIlinker：,linker的作用,缺点：,1）可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylinker:,优点：,（3）DNA接头(adapter)连接法,1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。,5p-GATCCCGG-OH3GGCC-p5,BamHIadapter,用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。,adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。,adapter的作用,Blunt-endedDNA,5p-GATCCCGG-OH3HO-GGCC-p5,BamHIadapter,P-,-P,5p-GATCCCGG-GGCC-,-CCGG-GGCCCTAG-P5,5p-GATCCCGG-GGCC-,CCGGGGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5,接头自我连接,接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,防止自我连接,碱性磷酸酶处理质粒载体,为了提高连接效率，一般采取提高的浓度，增加重组子比例。这样就会出现自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。,载体自连及去磷酸化示意图,常用碱性磷酸酶,5p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P,P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5,接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！,5GATCCCGG-OHHO-GGCC5,5CCGG-OHHO-GGCCCTAG5,CIP处理,-OH,HO-,Blunt-endedDNA,5p-GATCCCGG-OH3HO-GGCC-p5,BamHIadapter,P-,-P,5GATCCCGG-HO-GGCC,CCGG-OH-GGCCCTAG5,5HO-GATCCCGG-OH3HO-GGCC5,缺口,缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。,连接体系,1.载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。2.平末端连接在22保温4-16小时，粘性末端在22保温3小时，或16保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。3.载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。,连接反应中值得注意的几个问题,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,3端1520bp与模板互补；5端610bp是某个内切酶的识别序列。,（5端多余的35bp属保护碱基）,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamHI位点,-5,3-,5,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAGCCGG,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,CGATCGGCC,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAG,PCR产物,-5,3-,G,C,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,2.与T载体直接连接,（1）PCR产物两个3端一般都有一个A,TaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。,（2）T载体的两个3端人为地各加一个T,利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,TaqDNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,四、DNA体外连接应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接。,尽量避免平端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都产生GATC4个碱基的粘性末端。,2.DNA插入的方向正确,（1）用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确,（1）DNA定向插入,（2）起始密码,尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTCT,重组,但移码突变！,4.防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,五、载体和外源DNA插入片段的连接结果,1.载体自身环化连接,2.载体之间互相连接,3.插入片段互相连接,4.一个载体与几个插入片段重组,五、载体和外源DNA插入片段的连接结果,5.几个载体与一个插入片段重组,7,（能存活）,（能存活）,（不能存活）,（能存活）,（能存活）,1972年，美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。,美国总统国家科学奖,中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利科恩(StanleyN.Cohen),StanleyCohen教授发明该专利时的笔记照片-重组DNA专利,从批准该专利到该专利1997年12月2日失效的17年中，该专利一共许可了468家公司，两所大学共获得了许可费收入约2.55亿美元。,2重组体导入细菌细胞,一、感受态大肠杆菌的制备,二、重组DNA导入大肠杆菌,1.热休克法,2.电转化法,4.体外包装的噬菌体的转导,重组体导入细菌细胞,3.农杆菌介导法,重组体的转化,受体细胞,重组体的转化,由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型,黑膜试验,不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层,1.目的,增加受体菌细胞膜的通透性。,一、感受态大肠杆菌的制备,原核细胞的转化（细菌转化）,1)受体细胞的选择,限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染实验中使用的受体细胞为大肠杆菌DH5alpha菌株。,使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。,2.菌种,用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。,3.制备原理,CaCl2诱导转化,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,CaCl2处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细菌,重组体转入细菌,4.制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.5,Onice5-10min,4离心3000g10min收集菌,用冰冷的50mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70冻存,用冰冷的50mMCaCl2重悬,Onice30min,用冰冷的50mMCaCl2重悬（15%甘油）,3离心3重悬2冰浴,CaCl2法制备感受态细胞流程,将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37培养1620小时。挑取单菌落转入10mlLB培养基（100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl1g，dH2O）中，37振荡培养过夜。从中吸取1ml转入50mlLB培养基中37振荡培养，测OD600达0.40.6。培养物在冰浴中放置10分钟。取1.5ml加入预冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室温离心2-5分钟。弃上清，加入1ml用冰预冷的0.05MCaCl2，混匀，置冰上10分钟。5000rpm4离心10分钟，弃上清，加100ul0.05MCaCl2重悬，置冰浴备用或于4短期保存。若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有15甘油的0.05MCaCl2中，放入-80冰箱或液氮中冻存。,转化-热激发,取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min；将连接体系放入42水浴中热激90sec；迅速转入冰浴2min；加入0.8mlLB培养基，37振荡培养45min；取适量培养物涂布于Amp+LB固体培养基，放入37培养箱中培养。,转化示意图,1.0的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2.加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3.经短暂的42热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。,二、重组DNA导入大肠杆菌,（1）转化（transformation),大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（2）转染（transfection),大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。,1.外源DNA导入细菌的几种方法,（3）转导（transduction),借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。,每gDNA转化成功的细菌克隆数。,3.转化方法,2.转化率,简单，但转化效率不高,（1）热休克法（heatshock）,转化效率高,（2）电转化法,10ng载体DNA,100L感受态菌,Onice混合，静置10分钟,42C1分钟,加入1mLLB培养基,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,（1）热休克法,电击法(Genetransferbyelectroporation),（2）高压电穿孔转化法,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟，2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2C离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,Onice混合,加入1mLSOC培养液,37C中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,电转化法步骤：,4.平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,用氯化钙化学转化,环形重组质粒质粒自我连接:干扰因素,线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。,环形质粒数,（1）重组质粒,5.影响转化率的因素,生长状态,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。,必须在冰冷的条件下制备。,要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。,储存感受态菌要在-70以下,CaCl2处理,使用感受态菌时必须迅速融化,融化后一般不能再次冻存使用。,（2）感受态细胞（competentcells),把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,（1）体外包装（invitropackaging）,（2）转导（transduction）,通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。,3重组噬菌体DNA的体外包装与转导,cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到4445时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。,（3）cI857基因突变的噬菌体,但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。,cI857,其它基因,溶源状态（DNA不转录、不翻译）,DNA,阻遏蛋白,阻遏蛋白,4445,DNA转录、翻译合成外壳蛋白,32,噬菌体1,外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。,在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。,（4）互补型噬菌体,外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。,噬菌体2,(5)体外包装过程,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。,（6）转导,7,4重组克隆载体导入真核细胞,一、导入酵母细胞,二、导入植物细胞,三、导入哺乳动物细胞,外源基因导入真核细胞,转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。,一、导入酵母细胞,1.菌株选择,如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31,（1）利用原生质球进行转化,2.酵母的转化方法,酵母,原生质球,感受态,酶去壁,CaCl2、PEG,插入外源基因的酵母载体,PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,转化,原生质球(Spheroplast)指细胞壁未被全部去掉的细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地通过溶菌酶或青霉素处理革兰氏阴性细菌而获得。该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中脂多糖、脂蛋白仍然保留，外壁的结构尚存。所以，原生质球较之原生质体对外界环境具一定抗性，并能在普通培养基上生长。,酵母,0.1mol/LLiCl处理,插入外源基因的酵母载体,感受态,40%PEG4000,（2）利用Li+盐进行转化,叶盘,消毒,切取,土壤农杆菌浸泡,看护培养基,愈伤组织,分化幼苗,二、导入植物细胞,1.叶盘法（leafdisk),植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合