发酵工程制药技术

第四章发酵工程制药技术,微生物制药技术,概述,发酵的定义：利用微生物细胞中酶的作用发酵工程制药技术又称为微生物制药技术微生物发酵制药:是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括:微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺等。研究范围:微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物发酵、微生物转化发酵,微生物菌体发酵：即以获得具有药用菌体为目的发酵。如：帮助消化的酵母菌片和具有整肠作用的乳酸菌制剂等；药用真菌，如香菇类、灵芝、金针菇、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌以及与天麻共生的密环菌等药用真菌；一些具有致病能力的微生物菌体，经发酵培养，再减毒或灭活后，可以制成用于自动免疫的生物制品。微生物酶发酵：目前许多医药用酶制剂是通过微生物发酵制得的，如用于抗癌的天冬酰胺酶和用于治疗血栓的纳豆激酶和链激酶等。微生物代谢产物发酵：微生物在其生产和代谢的过程中，产生的各种初级代谢产物和次级代谢产物中许多是可以用于制作药物的。如初级代谢产物：氨基酸、蛋白质、核苷酸、类脂、糖类以及维生素等；次级代谢产物：抗生素、生物碱、细菌素等。,微生物转化发酵：微生物的转化就是利用微生物细胞中的一种酶或多种酶将一种化合物转变成结构相关的另一种产物的生化反应。包括脱氢反应、氧化反应(羟基化反应)、脱水反应、缩合反应、脱羧反应、氨化反应、脱氨反应和异构化反应等，这些转化反应特异性强，反应条件温和，对环境无污染，微生物转化制药最突出的例子则是甾族化合物的转化和抗生素的生物转化等。基因工程菌发酵：近年来，随着生物工程的发展，尤其是基因工程和细胞工程技术的发展，使得发酵制药所用的微生物菌种不仅仅局限在天然微生物的范围内，已建立起了新型的工程菌株，以生产天然菌株所不能产生或产量很低的生理活性物质，拓宽了微生物制药的研究范围。,本章主要内容：微生物药物的分类药源微生物及微生物药物的筛选技术微生物药物的发酵生产技术微生物药物的分离、精制和鉴别,微生物发酵药物的分类(第二章内容),(1)抗生素类(2)氨基酸类药物：个别氨基酸制剂、复方氨基酸制剂(3)核苷酸类药(4)维生素类药(5)甾体类激素。(6)治疗酶及酶抑制剂,第一节微生物细胞的培养概述,工业生产常用微生物当前发酵工业所用菌种的总趋势是从野生菌转向变异菌，从自然选育转向代谢控制育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物。,1、细菌细菌是自然界中分布最广、数量最多的一类微生物。发酵工业生产中常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌和短杆菌等。主要用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等。,工业生产常用微生物,工业生产常用微生物,2、放线菌放线菌因其菌落呈放射状而得名，在自然界中分布很广。目前，工业发酵生产中主要采用放线菌生产各种抗生素，如：链霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素等。从微生物中发现的抗生素有60%以上是由放线菌产生的。3、霉菌霉菌在自然界中分布很广，发酵工业常用的霉菌有：根霉、毛霉、曲霉、青霉等，主要用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。,工业生产常用微生物,4、酵母菌酵母菌为单细胞真核生物，在自然界中普遍存在。发酵工业常用的酵母菌有：酿酒酵母、假丝酵母和类酵母等，主要用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油和生产脂肪酶，以及生产可食用、药用和饲料用的酵母菌体蛋白等。,工业生产常用微生物,4、霉菌：霉菌在自然界中分布很广，发酵工业常用的霉菌有：根霉、毛霉、曲霉、青霉等，主要用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。5、担子菌：担子菌就是人们常说的菇类。担子菌资源的利用越来越引起人们的重视，如多糖、橡胶物质、抗癌药物的开发等。6、藻类：许多国家已把藻类用作人类保健食品和饲料，如：螺旋藻；此外，某些藻类还能利用光能将CO2转变为石油，如：单胞藻。,黑曲霉,是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,青霉,可用于生产抗生素、苯氧甲基青霉素酰化酶等。,链霉菌,是放线菌，生产葡萄糖异构酶、抗生素等。,酵母菌,主要用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶；作为基因工程的宿主菌，表述真核生物的外源基因。,大肠杆菌,细菌，可生产多种酶类，一般属于胞内酶，需要经过细胞破碎才能分离得到。作为基因工程的宿主菌,枯草芽孢杆菌,细菌，是应用最广泛的产酶微生物之一，可用于生产-淀粉酶、蛋白酶、-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等；作为基因工程的宿主菌,第四章4.1微生物细胞培养概述,4.1.1培养基1、培养基的种类。（1）孢子培养基：孢子培养基是供制备孢子用的。要求此培养基能使微生物形成大量的优质孢子，但不能引起菌种变异。生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基，大（小）米培养基，由葡萄糖（或淀粉）、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面培养基等。（2）种子培养基：种子培养基是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。培养基的组成随菌种的不同而改变。（3）发酵培养基：发酵培养基是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。,第四章4.1微生物细胞培养概述,2、发酵培养基的组成。（1）碳源：构成菌体及产物的碳架及能量来源。（2）氮源：构成菌体本身的含氮物及代谢产物中的含氮物。（3）无机盐：构成菌体原生质成分，酶的组分或维持酶的活性，调节细胞渗透压，参与产物生物合成等。,第四章4.1微生物细胞培养概述,（4）生长因子：菌体自身不能合成，但对维持其正常生长又不可缺少的物质，如：维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物、脂肪酸等。（5）水：构成菌体细胞的主要成分、营养物质的传递介质、参与许多代谢反应。（6）产物形成的诱导物、前体和促进剂：某些胞外酶的合成需要诱导物，前体被菌体直接用于合成产物，促进剂能刺激菌株生长，提高发酵产量，缩短发酵周期。,培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。,4.1.2微生物菌种的改良、筛选与保存,（一）微生物药物产生菌的菌种改良（二）新微生物药物的筛选（三）微生物药物产生菌的保藏,1、菌种的改良（1）从自然界中先分离出相应的菌种；（2）利用诱变筛选出符合生产要求的优良菌种；（3）利用基因工程、细胞工程的方法构建工程细胞或工程菌。,诱变育种凡是利用诱变剂处理分散而均匀的微生物群体，促进其基因发生突变的育种技术就称为诱变育种。其中诱变剂是指能诱致基因突变，明显提高基因突变频率的理化和生物因素。,目的将产生菌的一些有益变异，通过不断的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。,自然选育诱变育种杂交育种基因工程技术改良菌种,1）自然选育,在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。自然选育包括,（1）从自然界分离获得菌株,一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。,调查研究（包括资料查阅）试验方案设计采样第一次增殖培养第一次平板分离第二次增殖培养第二次平板分离第二次原种斜面初筛（1株1瓶）,增殖条件摸索,第一次原种斜面,定性或半定量测定,第三次平板分离第三次原种斜面复筛（1株3-5瓶）第四次平板分离第四次原种斜面再复筛较优化菌株1-3株,初步工艺条件摸索,第三次原种保藏,种子培养,不纯,保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株,某些必要试验和毒性试验等,（2）从自发突变体中获得菌株,变异是育种的基础。自然突变是指自然条件下出现的基因变化。自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株诱变育种。,2）、诱变选育,人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。,诱变育种的主要环节：,以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。,出发菌株的选择,菌悬液的制备,前培养,诱变,变异菌株的分离和筛选,（1）诱变剂,物理诱变剂化学诱变剂生物诱变剂,各种射线，如紫外线、X射线、射线、射线、射线和超声波等,乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。,噬菌体、转座因子,防护面罩,防护衣,防护罩,各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间,2）影响诱变效果的因素,出发菌株的遗传特性；诱变剂；菌种的生理状态；被处理菌株的预培养和后培养条件；诱变处理时的外界条件等。,选择合适的出发菌株采用分散状态的孢子悬浮液处理采用单核细胞（或核质体）处理注意微生物的生理状态适宜的诱变剂量,2、菌种的筛选：初筛-复筛,初筛：诱变结束后的筛选可以采用传统的随机筛选，也可以通过平板菌落筛选（推理筛选），即根据产生菌的生物合成途径或遗传机制来设计筛选有效突变型的方法,初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。,初筛方式：固体平板发酵液体振荡培养,便于大量筛选抗菌物质时采用。,放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。,（1）常规的筛选方法,琼脂扩散法利用多种微生物作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。,非致病菌抗生素耐药突变株和超敏菌株厌氧菌协同活性检测,（2）定靶筛选,从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。,以作用机理为依据的筛选方法以耐药机制为依据的筛选方法,-内酰胺酶抑制剂的筛选,-内酰胺酶是一类能够破坏具有-内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生-内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。-内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制-内酰胺酶，使酶失去活性，不能水解-内酰胺类抗生素，使抗生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。,耐药菌株平板法液体测定法联合使用-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株通过颜色变化来检测-内酰胺酶抑制剂诱导-内酰胺酶方法的应用,高通量筛选,高通量筛选（highthroughputscreening）技术是20世纪80年代后期形成的寻找新药的高新技术。将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，可以实现大规模的筛选。,高通量筛选的模型：细胞模型观察待测样品对细胞的作用，反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正常细胞和病理细胞。分子模型包括受体、酶等，药物作用的靶点明确。其他模型,3）筛选的方法,制定筛选方案,方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。,突变株的筛选方法,一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。,淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。,营养缺陷型菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。,影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫妇在1952年建立,根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。,摇瓶筛选法琼脂块筛选法筛选自动化和筛选工具微型化,随机筛选理性化筛选,运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。,理性化筛选,初级代谢产物高产菌株的筛选：降低终产物浓度筛选抗反馈突变菌株,次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选：利用营养缺陷型筛选筛选负变株的回复突变株筛选去磷酸盐调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株,降低终产物浓度,杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。,真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。,3）、杂交育种,（1）常规的杂交育种,遗传标记异核体形成杂合二倍体的形成染色体交换和单倍体,（2）原生质体融合（第二节内容）,A.标记菌株的筛选,供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。,B.原生质体的制备,在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。,（细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶）,溶菌酶,蜗牛酶,影响原生质体制备的因素：,菌体的预处理菌体的培养时间酶浓度酶解温度酶解时间渗透压稳定剂,用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。,一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。,一般控制在2040。,充足的酶解时间,对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和NaCl等。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。,C.原生质体的融合和再生,融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。,影响原生质体融合的因素：菌体的前处理；菌体的培养时间；融合剂的浓度；融合剂作用的时间；阳离子的浓度；融合的温度；融合体系的pH值等。,影响原生质体再生的因素：菌种自身的再生性能；原生质体制备的条件；再生培养基成分；再生培养条件等。,将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数A；将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理：,用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数B；用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和C。,D.融合子的选择,融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。,原生质体融合与传统杂交方法相比有以下几个特点：1、重组频率高并可能有几个亲株同时进行杂交；2、可以进行种间甚至属间杂交并形成稳定的重组体，但重组的频率比较低；3、被灭活的原生质体进行融合后，仍可能活的重组体；4、原生质体的形成与再生本身就可作为链霉菌的一种育种方法。,4）、基因工程技术改良菌种,体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。,（1）DNA重组过程,基因的分离DNA分子的切割与连接载体引入宿主细胞重组体的选择和鉴定外源基因的表达,（2）重组DNA技术在微生物药物菌种改良研究中的应用,提高微生物药物的单位产量1.增加限速酶基因拷贝数,提高菌种的生产能力2.引入抗性基因和调节基因,增加微生物药物单位产量3.克隆抗生素的全部结构基因,改变表达体系提高产量,C.构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物经过化学修饰获得的，但是制备工艺较为复杂。例如半合成头孢菌素的中间体是头孢菌素C的衍生物7-ACA，或青霉素G和V的衍生物7-ADOCA。,B.阻断支路代谢，增加有效组分的含量抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建阿弗米丁是十六元大环内酯的齐墩果二糖衍生物，由除虫链霉菌产生，在发酵过程中还产生一种结构差别大的大环内酯类抗生素寡霉素。,D.构建产生新化合物的基因工程菌由于许多微生物次级代谢产物酶系的底物特异性不强，当某种抗生素的生物合成基因克隆至另一结构相似、生物合成途径有关的抗生素产生菌中，可使其产生不同于二亲株产物的具有生物活性的新化合物，即“杂合抗生素”。例如，将放线紫红素的生物合成基因导入紫红链霉菌，产生了新化合物二氢榴菌紫红素；聚酮类化合物（PK）。E.引入血红蛋白基因，改善微生物的工业性状充足的氧气供给是稳定和提高发酵工业生产水平、降低生产成本的关键，传统方法是改良生物反应器及增大通气量。专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白（VHb），能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下也能很好生长。,现阶段的微生物药物筛选主要研究方面：产生菌的来源微生物的初筛发酵新的筛选模型和方法,3、微生物药物产生菌的保藏,1）、菌种保藏的目的,按人们的不同要求，把从自然界分离到的野生型，或经过人工选育得到的变异型微生物纯种，使其存活，不丢失、不混乱、不污染、不发生或少发生变异，保持其优良性状或生理特性，使其处于休眠状态（一般使用多种方法保存）。,3、微生物药物产生菌的保藏,2）、菌种保藏的基本原理,微生物菌种保藏的基本原理使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。干燥、低温、隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。,有针对性的创造干燥、低温、缺氧的外界条件，是微生物菌种保藏的基本技术。保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽胞等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方法。由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。,3）、菌种保藏的技术,4）、菌种保藏方法,A.暂时保存（斜面传代保藏法）,把菌种接种到所需要的斜面培养基上，置最适温度下培养到出现丰满的菌体细胞或孢子后，放置于冰箱45保存，23个月转接一次，传代保藏。,4）、菌种保藏方法,最常用的微生物菌种保藏方法，作为菌种的暂时保藏之用。,葡萄球菌属、链球菌属等间隔2周；一般无芽胞细菌间隔36个月；放线菌间隔3个月；酵母菌和霉菌间隔46个月。,传代频率,B.长久保存,运用干燥、低温和隔绝空气等手段，降低微生物菌种的新陈代谢速率使菌种的生命活动处于半永久性的休眠状态，以达到长久保藏的目的。,矿油保藏法载体保藏法悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法干燥保藏法液氮超低温保藏法,矿油保藏法,冷冻干燥保藏,液氮超低温保藏法,菌种保藏在液氮超低温（-196）中，是目前比较理想的一种菌种保藏方法。适用于各种菌种的保藏，特别适于难以冷冻真空干燥等方法保藏的菌种。保藏期较长，菌种的变异较小。投资费用较大，并要一个可靠的氮源。,*用斜面或半固体穿刺培养物均可，一般置于4下。*对石油发酵微生物不适宜。,5）、菌种保藏的注意事项,菌种在保藏前所处的状态菌种保藏所用的基质操作过程对细胞结构的损害,第四章4.2微生物细胞培养技术,4.2.1微生物细胞的培养方法1发酵的操作方法2发酵工艺控制,第四章4.2微生物细胞培养技术,液体深层发酵的操作方式根据操作方式的不同，液体深层发酵主要有、和三种类型。,1)、分批发酵营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。特点：一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时期明显。应用：广泛。,2)、连续发酵。连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。稳定状态可以有效地