芳酸类非甾体抗炎药物的分析

,TianjinMedicalUniversity,天津医科大学药学院药物分析第六章,芳酸类非甾体抗炎药物的分析,1芳酸类药物概述：分类与共性,内容：,2芳酸类药物分析方法简介,3总结与练习,炎症（inflammation）是具有血管系统的活体组织对外源性或内源性损伤因子所发生的一种机体的防御性反应。病理变化为局部组织的变质（alteration）、渗出（exudation）和增生（proliferation），临床表现为红、肿、热、痛和功能障碍。抗炎药物通过抑制炎症因子产生或释放，降低过于强烈的炎症反应，减轻发热疼痛症状，防止功能障碍等不良反应的发生。,临床常用的抗炎药物分为两大类：甾体类抗炎免疫药（steroidanti-inflammatory-immunitydrugs，SAIDs）：主要作用于皮质激素受体（cortisolreceptors），但长期使用可产生依赖性和严重的副作用。非甾体抗炎药（nonsterodialanti-inflammatorydrugs，NSAIDs）：无皮质激素样副作用，是临床上广泛使用的治疗各种急慢性炎症的基础用药。其作用机理主要通过抑制环氧化酶（cyclooxygenase，COX）活性，阻断花生四烯酸（arachidonicacid，AA）代谢形成前列腺素（PGs），抑制由前列腺素引起的炎症反应，从而发挥解热、镇痛和抗炎的作用。,公元前400年，希波克拉底Hippcrates，描述了从柳树干提取的某种物质可以用来治疗发热、疼痛以及由于劳损引起的剧痛。,公元前1500年，古埃及人便发现“柳树皮可以止痛（风湿，关节炎）”。,1897年，霍夫曼研制了高纯度乙酰水杨酸，并为自己父亲治好了多年的风湿病。(艾兴格林),1899年，阿司匹林（aspirin）问世。此后被广泛用于解热、镇痛及抗风湿治疗。,in是拜耳公司特有的在一种药名上加的后缀，代表该公司为这个药物的唯一生产商。,ASPIRIN,A,SPIR,IN,Acetyl,Spiraea(绣线菊，水杨酸提取物）,乙酰水杨酸,乙酰水杨酸,药物化学药剂学,全面质量控制,药物分析,阿司匹林，1898年首次合成。阿司匹林类非甾体抗炎药的作用机制，1971年Vane团队发现。COX-1,1976年首次提纯。COX-2,1991年被发现。根据作用机制分为传统非甾体抗炎药物（水杨酸类、吡唑酮类、芳基烷酸类、苯并噻嗪类）、选择性COX-2抑制剂、新型非甾体抗炎药三部分。,1.1水杨酸类,1芳酸类药物概述：分类与共性,水杨酸SalicylicAcid,阿司匹林Aspirin,双水杨酯Salsalate,二氟尼柳Diflunisal,羧基与COX的精氨酸120（Arg-120）的胍基形成离子对，是保持活性的必要结构。羧基与羟基的位置若从邻位移到间位或对位，活性则消失。,1.2芳基烷酸类,芳基乙酸类,吲哚乙酸类,吲哚美辛Indometacin,芳基丙酸类,布洛芬Ibuprofen,酮洛芬Ketoprofen,萘普生Naproxen,邻氨基苯甲酸类（灭酸类）,甲酚那酸MefenamicAcid,双氯芬酸钠DiclofenacSodium,邻氨基苯乙酸类,1.酸性：SA(PKa2.95)、ASA(PKa3.49)、双水杨酯均有酸性。布洛芬等由于羧基并未与苯环相连，结构上属于芳环取代的脂肪酸，酸性较弱。多数有游离的羧基，可用NaOH直接滴定测定其含量。2.溶解性:均为白色结晶粉末。除钠盐略溶于水，其余几乎不溶或微溶。3.UV和IR光谱特性：分子结构中具有苯环,有UV和IR特征吸收。4.邻羟基苯甲酸特性：与FeCl3生成紫色配合物。5.水解特性：酯键易水解。ASA、双水杨酯及其制剂应检查游离水杨酸。6.基团或元素特征：双氯芬酸钠含有Cl，可用于鉴别反应。酮洛芬的二苯甲酮结构可与苯肼缩合显色。,主要理化性质,1.3苯并噻嗪甲酸类（昔康类）,吡罗昔康Piroxicam,美洛昔康Meloxicam,对乙酰氨基酚Paracetamol,其他类,尼美舒利Nimesulide,磺酰苯胺类（选择性COX-2抑制剂）,主要理化性质,1.酸性：具有酰胺结构，无明显酸性。2.溶解性:均为结晶粉末。除对乙氨基酚略溶于水，其余几乎不溶。酚羟基特性：与FeCl3生成显色配合物。吡罗昔康与美洛昔康的烯醇式羟基也具有酚羟基性质。水解特性：酰胺键可发生水解反应，用于鉴别与含量测定。基团或元素特征：对乙氨基酚具有潜在芳伯胺基，可发生重氮偶合反应显色。美洛昔康含有二价硫，经高温生成硫化氢使醋酸铅试纸显黑色。,一、与三氯化铁反应含有酚羟基药物可与FeCl3反应；能与FeCl3反应不一定含酚羟基.,第二节鉴别试验,直接反应水杨酸在中性或弱酸性条件下，与FeCl3生成紫堇色配位化合物，强酸条件下配合物可分解。二氟尼柳溶于乙醇后，与FeCl3反应呈深紫色。,双水杨酯在NaOH中煮沸后FeCl3反应，成紫色。,2.水解或分解后与三氯化铁反应,ASA水解成SA后与FeCl3反应，成紫堇色。,对乙酰氨基酚水溶液与FeCl3生成蓝紫色配位化合物，吡罗昔康显玫瑰红色，美洛昔康显淡紫红色。,二、缩合反应,酮洛芬具有二苯甲酮结构，在酸性条件下可与二硝基苯肼缩合生成橙色偶氮化合物。,三、重氮化-偶合反应凡是分子结构中含有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物均可反应。,1.直接反应对氨基水杨酸钠2.水解后反应对乙酰氨基酚具有潜在芳伯氨基3.甲芬那酸与对-硝基苯重氮盐在NaOH介质中偶合产生橙红色。,+K2Cr2O7深蓝色棕绿色甲芬那酸+H2SO4黄色绿色荧光,四、氧化反应,+H2SO4+K2Cr2O7紫色吲哚美辛+HCl+NaNO2绿色黄色,双水杨酯在NaOH下煮沸水解后，加HCl生成SA沉淀，沉淀在醋酸铵试液中可溶解。,五、水解反应,1.测定max；min。（布洛芬及美洛昔康制剂）例如：布洛芬用0.4%NaOH溶液制备0.25mg/ml；max：265nm,273nm;min：245nm,271nm。2.测定max。例如：双氯芬酸钠，20g/mlmax=276nm；吡罗昔康片，max=243nm，334nm。3.在max处测定一定浓度供试液的吸收度A。例如：甲酚那酸，20g/ml在max=279nm，350nm;A=0.690.74与0.560.60。,六、紫外吸收光谱法,4.在规定的波长测定吸收度比值（即双波长吸收度比值法）例如：二氟尼柳20g/ml;A251/A315=4.24.6再例如：甲芬那酸14g/ml;A278280/A348352=1.151.30,七、红外吸收光谱法,水杨酸的红外吸收图谱,37002900cm-1,N-H、O-H,1660cm-1,C=O,1610,15701480,1440,C=C,775cm-1,Ar-H,33002300cm-1,O-H,1760,1690cm-1,Ar-H,1610,1570,1480,1460cm-1,C=C,775cm-1,1310,1230,1180cm-1,C-O,阿司匹林的红外吸收图谱,C=O,二氟尼柳胶囊的鉴别：以GF254为固定相，正己烷-二氧六环-冰醋酸（85:10:5）为展开剂，254nm检视。美洛昔康制剂：以三氯甲烷-甲醇-二乙胺（60:5:7.5）为展开剂。,七、薄层色谱法,八、HPLC法,离子对色谱法（pairedionchromatography，PIC）,RPIC是把离子对试剂加至极性流动相中，被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂生成不荷电的中性离子对，从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，改善分离效果。分配系数与离子对试剂的碳链长度及被分离组分的极性有关。分配系数越大，保留时间越长。,流动相固定相,B+HBH+RSO3NaRSO3-+Na+(PICB)中性离子对BH+.RSO3-BH+.RSO3-,常用离子对试剂,通常所选用离子对试剂的电荷应与被分离样品的电荷相反。PICB：用于分离碱类或带正电荷的物质，常用带负电荷的烷基磺酸钠，如庚烷磺酸钠（PICB7）。PICA：用于分离酸类或带负电荷的物质，常用带正电荷的季铵盐，如四丁基氢氧化铵、十六烷基三甲基溴化铵。,离子抑制色谱（ionsuppressionchromatography，ISC）,在反相色谱中，通过调节流动相的PH或利用同离子效应，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的的技术。适用于3.0-7.0的弱酸及7.0-8.0的弱碱，对于小于3.0的酸及大于8.0的碱，应采用离子对色谱或离子交换色谱。常用抑制剂：弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）、缓冲盐（磷酸盐、乙酸盐）,PIC与ISC区别,分离机制不同ISC使组分保持分子状态，抑制离子是组分自身离子；PIC是形成不荷电离子对，抑制离子是外来的。分离对象范围不同ISC适用有机弱酸、弱碱、两性化合物；PIC适用更广泛些。ISC简便，比PIC经济，但重复性较差。,第三节特殊杂质检查,阿司匹林及水杨酯合成路线,一、ASA中特殊杂质的检查1.游离水杨酸检查利用SA可与FeCl3呈色，用比色法检查。,Chp2010采用1%冰醋酸甲醇溶液制备供试品，防止阿司匹林水解，采用HPLC法，ODS反相色谱柱，以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20:5:5:70）为流动相，检测波长为303nm，外标法以峰面积计算SA不得过0.1%。药典规定ASA片、肠溶片、肠溶胶囊、泡腾片及栓剂限度检查SA，分别为0.3%、1.5%、1.0%、3.0%和3.0%。,一、ASA中特殊杂质的检查1.有关物质合成原料苯酚及其他合成副产物。,Chp采用HPLC法检查。使用ODS色谱柱，以检查游离水杨酸的流动相为A，乙腈为B，梯度洗脱，波长为276nm。,甲芬那酸是以邻-氯苯甲酸和2，3-二甲基苯胺在Cu的催化下缩合而成，因此成品药物中要检查铜盐及有关物质。分光光度法：利用Cu2+与Na-DDC呈色后测定A1.铜盐检查法原子吸收分光光度法：BP（2000）2.有关物质的检查主要检查的是2,3-二甲基苯胺，Chp采用GC法，限度为0.01%。,二、甲芬那酸中特殊杂质的检查,三、二氟尼柳中有关物质的检查,合成路线,Chp分别采用TLC（正相）和（反相）HPLC法，以自身对照法检查有关物质A和B。,四、萘普生中有关物质的检查,合成路线,Chp采用HPLC法。采用杂质对照品法。检出杂质峰面积不得大于对照杂质峰面积（0.1%），其他杂质峰面积不得大于对照杂质I峰面积的2倍，杂质总面积不得大于对照主成分面积（0.5%）。,五、对乙氨基酚中氨基酚和对氯苯乙酰胺的检查,取对氨基酚适量，精密称定，加溶剂甲醇-水4：6制成每1ml中含20mg的溶液，作为供试品溶液；另取对氨基酚对照品和对乙酰氨基酚对照品适量，精密称定，加上述溶剂溶解并制成每1ml中含对氨基酚1ug和对乙酰氨基酚20ug的混合溶液，作为对照品溶液。照HPLC法试验。用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠8.95g，磷酸二氢钠3.9g，加水溶解至1000ml，加10%四丁基氢氧化铵溶液12ml）-甲醇90：10为流动相。检测波长为245nm，柱温为40度，理论板数不低于2000，分离度应符合要求。L=VC/S,一、酸碱滴定法（一）直接滴定法基于本类药物-COOH；可用碱直接滴定，如ASA的含量测定，其原理如下：,第四节含量测定,1.原理：,2.条件：,在中性乙醇中，以酚酞作指示剂；摩尔比为1:1。,3.应用：,多国药典用于双水杨酯、苯甲酸、丙磺舒、布洛芬测定；USP和BP还用于甲芬那酸的测定。,（二）水解后剩余滴定法ASA含量测定,原理：,条件：,水溶液,注意事项：碱液在受热时易吸收二氧化碳，生成碳酸盐，使酸回滴体积减少，使结果偏高，故需在相同条件下进行空白实验。,具体试验：,I份NaOH,I份NaOH,V,VO,Vo-V相当于ASA消耗硫酸的ml数,ASA%=(VoV)FT/W100%,（三）两步滴定法,ASA片的含量测定,第一步为中和,ASA+NaOH,ASA-Na+H2O,水解产物SA+NaOH,SA-Na+H2O,酸性稳定剂+NaOH,中性盐,第二步为水解与测定,2NaOH+H2SO4Na2SO4+2H2O（剩余）,从阿司匹林结构出发，试述其片剂的鉴别方法，特殊杂质水杨酸的检查方法以及其含量测定方法,包括原理、操作要点（限容量分析法，需写出反应方程式）。,取本品20片（1.4801g）标示量25mg/片,每份12片（0.8908g），（约相当于阿司匹林0.3g）研细，计算平均片重。置锥形瓶中，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20ml，振摇使阿司匹林溶解加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)至溶液显粉红色（约耗NaOH20mL），再精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)40mL。置水浴上加热15分钟并时时振摇，迅速放冷（凉水冲冷）至室温，用硫酸滴定液(0.05molL)滴定（约消耗18-19mL）至粉红色消失，并将滴定结果用空白实验校正。每lml氢氧化钠滴定液(0.1molL)相当于18.02mg的C9H8O4。CH2SO4=0.05716mol/L;Vs=18.86mL;V0=33.24mL中国药典（2005）规定，本品含阿司匹林(C9H804)应为标示量的9501050。,（三）两步滴定法,标示量%=（VOVS)FTW平/W/B100%,注意事项：1.中和滴定速度稍快，注意旋摇，防止局部过浓2.本实验中，中性乙醇对酚酞指示液显中性。3.阿司匹林在水中微溶，在乙醇中易溶，故选用乙醇为溶剂，且乙醇可抑制阿司匹林的水解。,（四）、非水溶液滴定法,吡罗昔康有吡啶环，显碱性，可在冰醋酸中用高氯酸滴定液滴定。,（一）直接紫外分光光度法Chp2010收载二氟尼柳、美洛昔康、尼美舒利制剂，对乙酰氨基酚及其部分制剂采用此法进行测定。,四、紫外分光光度法,标示量%=,AsCRDW,ARWB,100%,（二）柱分配色谱-紫外分光光度法,USP(24)采用此法同时测定ASA胶囊中ASA和SA。1.SA的限量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备。,2.ASA的含量测定色谱柱的制备；对照品溶液的制备；供试品溶液的制备。,供试品液：CHCl3液,洗脱液1：CHCl3洗脱液2：HAC-乙醚,硅藻土，FeCl3-尿素,玻璃棉,硅藻土，Na2CO3,供试品液：CHCl3-HCl液,洗脱液1：HAC-CHCl3(1:10)10ml洗脱液2：HAC-CHCl3(1:100)85ml,1-杂质先洗脱2-SA后洗脱,max=306nmAuAs,1-杂质先洗脱2-ASA后洗脱,max=280nmASA(mg)=C(Au/As),Ch.P(2010)收载的典型芳酸类非甾体抗炎药物制剂大多采用离子抑制-反相HPLC法测定，以外标法计算含量。反相离子抑制色谱，在流动相中加入冰醋酸，为了抑制ASA的解离，进而消除因色谱柱的吸附而造成拖尾影响，可抑制ASA水解，增加溶液稳定性。,五、HPLC法,ASA栓剂的含量测定本品含ASA应为标示量的90.0%-110.0%。,色谱条件：色谱柱ODSC18；流动相为乙腈：四氢呋喃：冰醋酸：水(20:5：5:70);检测波长276nm。系统适用性试验：n3000;ASA与SA与内标物的R1.5具体计算：Cx=Ax/ARCR,标示量%=W测/WW平/标示量100%=CRAx/ARDW平/W/标示量100%,ChP2010：取本品5粒，精密称定，置小烧杯中，在40-50度水浴中微温熔融，在不断搅拌下冷却至室温，精密称取适量（约相当于阿司匹林0.1g），置50mL量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液适量，在40-50度水浴中充分振摇使阿司匹林溶解，放冷，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却1小时，取出，迅速滤过，取续滤液作为供试品储备液。精密量取供试品储备液5mL，置100mL量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取10uL，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿司匹林对照品，精密称定，加1%冰醋酸的甲醇溶液振摇使溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.1mg的溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。,一、血清中ASA和SA浓度的HPLC法色谱条件：色谱柱为ODS-C18(100mm4.6mm,5m)流动相为0.05%甲酸的乙腈溶液为A，40%10mmol/L甲酸铵溶液为B，60%ASA178.9-136.8；SA136.9-92.8；内标物为4-ABS162.9-118.