基因工程-2分子的杂交.ppt

第一章基因工程的主要技术原理,第三节核酸的分子杂交,1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,1核酸分子杂交技术,彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用：检测特定生物有机体之间的亲源关系DNA/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。,1.1杂种核酸分子,按其分子种类划分1）DNA杂交探针为DNA或RNA2）RNA杂交探针为DNA或cDNA,1.2核酸杂交的类型,3）蛋白质免疫分析探针为抗体,按样品制备过程划分1）原位杂交(insituhybridization)i.原位菌落杂交ii.原位噬菌斑杂交iii.原位细胞杂交iv.原位组织块杂交,1.2核酸杂交的类型,起源于标准的光学显微镜技术，这种技术曾被用来观察细胞分裂期的染色体形态。对于许多生物体来说，可以通过染色体的形状或者不同方法的染色来区分。原位杂交提供了一种通过在光学显微镜下观察染色体的图像，直接定位克隆基因的方法。,原位杂交,原位杂交的优点不仅能够鉴定出基因存在于哪条染色体上，还可以提供染色体上基因位置的相关信息。,特点：原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。,例如：菌落杂交原位杂交之一，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。目的：鉴定重组子。,检测重组体克隆的菌落杂交技术,经固定剂处理的细胞被黏附在载玻片上，然后用核糖核酸酶和氢氧化钠降解RNA，并使DNA分子变性，单个多聚核苷酸链之间的配对碱基被拆散，而且染色体也在一定程度上被拆开，暴露出通常被包裹在它们结构之中的DNA片段。将一定量的被标记的基因掺入到制备好的染色体中。标记基因和它的染色体拷贝杂交，最终在放射性自显影中形成一个黑点。这个黑点的位置表示标记的基因在染色体上的位置。尽管技术较难，但人们已经利用原位杂交和放射性标记的探针，定位人类细胞遗传图谱上相当数量的基因。,原位细胞杂交,人们用荧光标记物替代放射性标记，将它连接到杂交探针上，探针与DNA分子杂交后，可以通过荧光显微镜直接观察实验结果。如果使用不同的荧光染料，可以同时探测两个或更多的基因，通过荧光颜色间明显的差异可以分辨出不同的杂交信号。FISH经常与已知正常染色体位置的探针一起使用，这项技术对于研究染色体已经重新排列的细胞特别有用。染色体重新排列，例如染色体复制，或者是某一DNA片段从一条染色体转移到另一条染色体上，都能够通过FISH相对较快地测定出来，比传统的染色技术快很多。,荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH),2）斑点杂交(dothybridization)先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。,先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有：i.扩散法ii.毛细管法iii.电泳转移法iv.真空转移法,3）转移杂交或印迹杂交(blottinghybridization),它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品,4)夹心杂交法(sandwichhybridization),1)DNA和RNA的杂交制备DNA或RNA样品与固定基质结合80真空固定预杂交加入标记探针杂交洗涤放射自显影或显色反应。2）蛋白质的免疫分析制备蛋白质样品与固定基质结合常温空气中固定封闭剂封闭一抗反应洗涤二抗-酶偶联物反应洗涤显色反应（EIA）或一抗放射标记物洗涤放射自显影（RIA）,2分子杂交的一般程序,2.1杂交样品膜的制备,1.固定基质的种类与特性1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulosefilter,NCF)可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。NCF不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（20,000）,优点：i.用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。ii.用于蛋白质分析时，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高；不需要预激活；易于操作缺点：结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）,硝酸纤维素滤膜NCF,硝酸纤维素膜不能滞留小于150bp的DNA片断，不能同RNA结合。应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。,2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸最大特点：能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。,i.阳离子尼龙膜（如Zeta-prob，Zeta-bind等）i)容量大,蛋白质可结合480g/cm2ii)可结合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。iii)韧性好iv)可用于电转移v)可进行反复多次杂交试验vi)广泛的化学耐受性和可高温消毒*不能用于蛋白质的直接染色ii.尼龙66广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变为pH7时阴离子状态。,3)尼龙膜,4）离子膜i.DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA,ds-DNA,RNA的制备回收)ii.CM-纤维素纸(可用于碱性蛋白质的结合),固定基质的选择依据,1）强度，耐久性，操作简便2）高信噪比（低本底高信号）3）生物大分子的结合容量和稳定性4）重现性好,核酸杂交常用几种膜的性能比较,尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是毛细管作用2.印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。,1）原位杂交样品膜的制备,2.2各种杂交样品膜的制备,2）斑点杂交样品膜的制备制备样品点样固定（可用斑点杂交仪或直接点样）,3）转移杂交样品膜的制备i.扩散法（Difusionblottingmethod),ii.毛细管法(Capillaryblottingmethod),Southern印迹,iii.电转移法(electroblotting),iv.真空转移法(Vaccumbllotting)转移速度与凝胶的速度和厚度成反比，在相同转移率（50%）时，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛细管法损失率20%。,v.各种转移方法的比较i)扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。ii)电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。iii)真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。,i)固定基质的选择ii)转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去凝胶中的SDS。iii)大分子的转移对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb。,vi.转移的最佳条件,其步骤是：0.25MHCl处理凝胶两次（每次15分钟）水洗0.5MNaOH/1MNaCl两次，每次15分钟转移。对于大分子蛋白质，可采用下述三种方法之一：解偶联剂使凝胶解聚；蛋白酶作用；转移缓冲液中加入SDS。,1.标记化合物的种类1）放射性同位素标记物,125I，3H，14C用于蛋白质标记；32P，3H，35S用于核酸标记，其中32P和35S使用频率高。32P标记核苷酸的位或位，35S则是标记核苷酸的位.,2.3标记探针的制备,2)非放射性标记物i.生物素分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一种碱性蛋白抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更牢固，可大大提高其灵敏度。生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合物。,ii.半抗原包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。,iii.蛋白质检测标记物i)酶偶联二抗（0.05ng）ii)蛋白质A（来自金黄色葡萄球菌）。可作用于大多数哺乳动物的IgG，灵敏度较低（5ng）iii)免疫金（immunogold）0.1-0.5ng,3)两类标记化合物的比较i.灵敏度检测蛋白质，两种方法差不多。检测核酸，放射法比酶法敏感。ii.稳定性酶法探针可在4保存一年，放射性标记需每次制备。iii.安全性非放射性标记安全。iv.效率非放射性标记所需时间短。,2.标记探针的制备1）链标记法i.切口移位法ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.随机DNA引物延伸法ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P),iii.反转录法mRNA+dNTP(32P)cDNA（标记）iv.转录法含有待标记DNA片段的重组质粒+NTP(32P)RNA（标记）v.引物延伸法含待标记DNA的单链DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待标记DNA链,vi.T4DNA聚合酶法ds-DNAT4DNA聚合酶,无dNTP3-5外切酶活性加入dNTP和标记核苷酸新合成链（32P）,2)末端标记i.5-末端标记ss-和ds-DNA,RNA脱磷酸化反应(CIP)T4DNA激酶(-32P)ATPii.3-末端标记i)TdT加尾反应，用于dsDNA,ii)补齐反应,iii)T4RNA连接酶反应RNA-OH+*pNp（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi,3)标记化合物的纯化i.柱层析利用SephadexG-50，前峰-标记物，后峰-核苷酸ii.旋转柱层析快速，简便,可同时纯化多个样品。,2.4分子杂交与结果检测,1.核酸杂交与结果检测1）预杂交：预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA，预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合,424-6h或过夜。2）杂交：探针100变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42一天,3）洗涤：2SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1SSC+0.1%SDS65洗涤两次，每次15分钟。若使用低聚核苷酸探针，洗涤温度按下式计算：T=4GC+2AT*高强度与低强度杂交：若具高度特异性同源序列，采用高强度杂交条件；若使低同源性DNA之间杂交，则采用低强度杂交条件。这两种条件之差异表现在杂交液和洗涤液的离子强度以及杂交和洗涤时的温度。,4）放射自显影或显色反应使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。若采用非放射性同位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。主要有两种酶：i.辣根过氧化物酶:可将3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或将4-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。,ii.碱性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，该化合物可转变为兰色沉淀物，该反应中释放的氢离子可将硝基兰四唑还原成深紫色沉淀，这些沉淀物都是沉积在酶的作用位点。iii.两种酶偶联物的比较i)碱性磷酸酶的灵敏度比辣根过氧化物酶高10倍左右，但噪声大。ii)碱性磷酸酶的显色反应可持续几个小时，其显色结果可长期保存，但辣根过氧化物酶的显色反应仅能持续30分钟。5)杂交结果,2.蛋白质的免疫分析封闭剂，明胶，牛血清蛋白，卵清蛋白等。,3SouthernDNA印迹杂交由E.Southern于1975年首先设计出来的，根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。,Southern凝胶转移杂交技术,SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。,在进行核酸印迹转移的时，1.要将已转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤12小时；2.紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。,4NorthernRNA印迹技术（Northernblotting）1979年，J.C.Alwine等人发展而来，将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与SouthernDNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做NorthernRNA印迹技术（Northernblotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做Western蛋白质杂交技术（Westernblotting）。,5凝胶阻滞实验（Gelretardationassay）又叫DNA迁移率变动实验（DNAmobilityshiftassay）80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。,不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在与某一特定DNA片断结合的蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确的DNA序列的特异性。（加入超量的非标记竞争DNA）,可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。1.用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测蛋白是否属于此类转录因子；2.在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。,凝胶阻滞实验能揭示在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用的有关信息，但无法确定两者结合的准确部位，而DNase足迹实验可以解决这个问题。,6DNase足迹实验（footprintingassay）是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性