油菜转基因育种研究VIP

油菜转基因育种研究 官春云李构陈社员刘忠松王国槐熊兴华林良 斌何业华 ( 湖南 农业大学油料作物研究所 长沙 4 1 0 1 2 8 ) 摘 要 本文介绍了B t 毒蛋白 基因转化甘蓝型油菜育成抗虫新品系、 墓因工程雄性不育系、 恢复系选育 和杂种优势利用以及反义F A D , 基因转化甘蓝型油莱双低品种提高油酸含量的研究结果。 关 扭 词抽 莱 ，转 基 吟 育 o y 自1 9 8 6 年M a t h e w V H等首先将N P I ， 一 B 基因利用农杆菌介导法转人芥菜型油菜以 来， 转 基因 油 莱研究有了 长 足的 发展。 据E . D . E a r le 和V . C . K n a u f 报道( 1 9 9 9 ) ， 从1 9 8 8 年到1 9 9 7 年 七年间， 有4 5 篇文章报道了3 4 个不同的 基因 对甘蓝型油莱进行了 遗传转化， 并育成一些转基 因油菜品种在生产上应用。 据C . J a m m ( 2 0 0 0 ) 报 道， 1 9 9 8 年 全 球转 基因 油 菜种植面 积为2 4 0 x 1 0 0 h m Z ， 占 全球油菜种植 面积的9 %. 1 9 9 9 年全球转基因油菜面积为2 8 0 x I ( P h W ， 占 全球油菜总面积( 2 5 0 0 x 100h.2) 的1 1 %， 年年有增加。另据C . J a m e s 报道， 2 0 0 0 年全球作物总面积为2 7 1 0 0 x 1 了 h m 2 ， 转基因作 物面积为4 4 2 0 x 1 了 h 甘， 转基因 作物占 全球作物种植面积的1 6 % o 为了育成适于我国种植的转基因 油菜品种， 我们于1 9 9 5 年开始进行B t 毒蛋白 基因、 T A 2 9 核酸酶基因、 反义F A D Z 基因转化甘蓝型油 菜的研究。现将主要研究结果报道如下: 1 B t 毒蛋白基因转化甘蓝型油菜育成抗虫新品系的研究 1 . 1 宜义 莱 青虫( A r to g e ia ) 是危害油 菜的重 要害虫， 属鳞翅目， 在我国 长江流域地区 一年可发生8 - 9 代， 且世代重叠危害， 严重影响油菜产里和品质 形成， 同时还可传播软腐病， 在秋雨多的年份 常导致成灾。 过去用化学农药防治效果不佳， 且污染环境， 又增加成本。而来自 苏云金杆菌的 C ry I 类B t 毒蛋白 基因 所编码的 蛋白 质特 异地对鳞翅目 昆虫有杀虫活性， 使油菜获得抗虫性， 并能在油莱中 稳定遗传和表达。为此进行本研究。 1 . 2 材料和方法 受体品 种为湘油1 3 号( B . n a p u s ) 。 农杆菌( A g ro b a c te r iu m t u n u f a c ie n s ) 菌株为L B A 4 4 0 4 。 表 达载 体为中 国 农业 科学院 生物技术中心 范云六教授提供的p E W Z 1 0 质粒， 含有经过人工构建 的B t 杀 虫蛋白 基因和 筛选标记基因N P 171 I 。 农杆菌介导转化方法是: 挑取含有p E W Z l 。 质粒 的 农 杆菌 单菌 落接种于 含四 环 素3 m g / L 的Y E B 液体培养基中， 2 8 振荡 培养过滤， 至O D 6 0 0 达 0 . 5 ， 然后离心收集菌体， 用M S 液体培养基洗两次， 再用M S 液体培养基稀释1 0 倍。切取4 - 5 d 无菌苗的 子叶 柄约2 rm a ， 在m s 培 养基( 附 加6 一 B A 4 . 5 m g / L ) 上 预培养1 0 h ， 放人稀释菌液中 浸 染4 一 5 m in ， 用灭菌纸吸干菌液， 插人 共培养基( M S 十 6 一 B A 4 . 5 / K e n m y c in l 5 m g / L ) 黑暗培养 印一 7 2 h 。 转移 到筛选 诱导培养基( M S + 6 一 B A 4 . 5 m g / L 十 k a n 1 5 m g / L + C m h e n ic l i n 5 0 0 m g / L + 人 ; N O 5 m g / L ) 上培养( 2 5 9C， 光照 1 6 h / d ) , 3 一 4 周后切取再生的绿芽于生长培养基( M S + 官春云等: 油菜转羞因育种研究 K a n 1 5 m g / L 十 C a r b 2 5 0 m g / L 十 K a n l 5 m g / L ) 中， 2 一 3 周即可生根， 待 根系发达后移至盆钵。 子 房注射的方法是: 对即将开放的花蕾进行人工去雄， 并套袋挂牌， 在第2 d .或第3 d 上午9 : 0 0 - 1 0 : 0 0 授粉， 重新套袋。 在授粉 后一 定时间内 用微玻针( 针口 直径1 0 一 1 0 0 P. tn 之间) ， 从子房不 同 部位注 射卜3 匹质粒D N A ， 然后再套袋隔 离2 周， 成熟后收获 种子。 转化 成功后， 对 转基因 植株进行农艺性状和品质性状的选择。 1 . 3 研究结果 1 . 3 . 1 转化结果 以 子叶柄作转化受体进行农杆菌转化， 最佳侵染时间为3 一 5 m i n ， 最佳共培养时间为6 0 - 7 2 h ， 在最佳转化条件下， 3 5 。 个外植体共培养获得小植株1 4 株， 卡那霉素抗性植株频率为 8 . 3 % 。 经D o t b lo tt in g 和S o u th e rn b l o t t in g 检 测， 转 化 频 率 为1 . 1 8 % 。 采 取 子 房注 射 法 转 化， 在 授粉后2 0 一 3 0 h 从子 房中 部注 射。 . 5 一 1 . 5 1+g 外源D N A ， 在实验的2 5 个子 房中 获种子6 7 4 粒， 其中卡那霉素植株率为1 2 . 8 %. 1 . 3 . 2 表达检测 对转基因 植株进行G U S 基因表达检测， 结果呈阳 性， 表明B t 毒蛋白 基因在转基因 植株中 得到表达。分别收获转基因 植株的自 交种子( 第2 代) ， 在N I S 培养基上进行卡那霉素抗性筛 选， 结果卡那霉素抗性植株和卡那霉素敏感植株的比 例约为3 : 1 ， 表明B t 毒蛋白 基因 是以 单拷 贝、 杂合地整合到油菜基因组中。此外分别提取形态及产量性状表现优异的转基因植株的基 因组D N A ， 进行P C R 扩增目 的 基因的分子检测， 绝大多数植株具有目的基因的扩增带， 表明目 的 基因在转基因 植株中能稳定遗传。 1 . 3 . 3 抗虫试验 转B t 基因油菜苗期对菜青虫有明显抗虫性。经3 次田 间接虫试验， 菜青虫取食转基因油 菜叶片 后， 存活率明 显下降， 在4 龄后存活率显著降 低， 平均死亡率比 对照增加6 0 . 7 %. 1 . 3 . 4 转B t 基因 杭虫油莱品系 表现 对转B t 基因油莱进行农艺性状和品质性状选择， 获得性状稳定新品系。 新品系株高 1 6 0 . 5 c m ， 一次 有效分枝7 . 6 个， 单 株角果数3 6 8 . 2 个， 每果2 2 . 7 粒， 千 粒重3 . 9 4 8 ， 无 芥酸， 硫 昔 含量201-1/g以下， 种子含油量3 9 . 3 %， 与对照湘油 1 3 号不相上下。目 前正进行安全性研 究。 2 油菜基因工程雄性不育系和恢复系选育以及杂种优势利用的研究 2 . 1 意义 油莱杂种优势显著， 一般可增产2 0 %一 3 0 %， 甚至 更高。 再加上油菜花期长， 花龄长， 花 器外露， 繁殖系 数高， 有利于杂交制种。以往选育质不育杂种和核不育杂种， 育种周期长， 组合 选配局限 性大。而利用基因工程方法育成雄性不育系和 恢复系， 来利用杂种优势， 组合选配自 由， 育种周期短， 有很好的应用前景。 2 . 2 材料和方法 受体品 种为湘油1 5 号( B . n a p u s ) 和与之能形成强优势组合的品种7 4 2 ( B . n a p u s ) 。 雄性 不育的表达载体为P F A B N B A R 5 5 ( 即N O S 一 B ，一 T A 2 9 一 b . ) , 育性恢复的表达载体为P r - A B S B A R 2 3 ( 即N O S - b a r s t a r - T A 2 9 一 b a r ) ， 分别由中国 科学院遗传研究所李文彬教授构建。 农 杆菌转化甘蓝型油菜方法是: 甘蓝型油菜子叶 柄预培养2 0 h , O D D为0 . 5 ， 农杆菌菌液感染后共 2 1 世纪作恤料技与生产友晨学术讨论会论文集 培 养3 d ， 在m s 十 A g N % 2 m g / L 十 6 一 B A 4 . 5 m g / L 十 K m 1 0 m g / L + 。 山3 0 0 m g / L 培 养 基上进 行前 期 选 择， 转化率为8 . 8 %， 在ms十 A g N 0 3 2 m g / L + K m 1 5 m g / L + C a r b 2 0 0 m g / L 培 养基上进行 延迟选 择， 净 转 化 率为1 9 . 1 %; 在泌+ A g N 仇 2 m g / L + N A A O . I m g / L 十 K m 2 0 m g / L + 。 由2 0 0 m g / L 培 养 基上进行后期选择， 净转化率为2 0 . 8 %, 采用P C R 检测外源基因是否进人甘蓝型油莱基因 组。 再生小植株经驯化后定植在盆钵中。 2 . 3 研究结果 2 . 3 . 1 转化结果 不育基因经农杆菌介导法转人湘油1 5 号后， 获得9 8 株转基因植株， 植株主要性状与供体 亲本无明显差异， 但其育性可分为完全不育、 半不育和可育三种类型。 其中 完全不育转基因 植 株约占4 %， 其雄蕊发育不良， 花丝变短， 花药小而干疼， 药室中无花粉， 或仅有极少量畸形花 粉， 套袋自 交不能结实， 授予对照花粉能结实， 半不育转基因植株约占4 0 %， 其雄蕊明显短于 雌蕊， 部分花药有少量可育花粉; 可育的转基因植株约占5 6 %， 其雄蕊与对照无明显差异， 花 粉量多， 可被k l 一 1 2 染色。 育性恢复基因 经农杆菌介导法转人， 4 2 品种后， 共获1 5 株转基因 植 株， 其表现型与供体亲本无明显差异。 2 . 3 . 2 喷药试脸 对转 基因 植株喷酒P P T 除草剂6 0 O m g / L 后， 有4 5 % 的 不育 基因 转 化植株和3 3 %的 恢复基 因 转化植株表现出不同 程度的抗性。 2 . 3 . 3 按以下制种方式生产的杂种， 与常 规品种进行产黄比较， 一般增产3 0 % 左右 A 系 雄性不育系( 转不育基因的湘油1 5 号， 具有S 显性不育基因， 且与抗除草剂基因H 紧密连锁) A 系 保持系( 未转不育基因的湘油1 5 号， 且无抗除草剂基因， 表现可育) B 系 恢复系( 具有显性基因R 十 H ， 雄性可育) 朴B(RRHhaSsHhRr)sswt 、.凡ABAB A ( S s f) x A ( s s h h ) y A ( s s h h ) + A ( S s H h ) ( 对除草剂敏感， 而被杀死) 3 反义F A D 2 基因转化甘蓝型油菜双低品种提高油酸含f的研究 3 . 1 意义 油酸脱氢酶F A D z ( E C 1 . 3 . 1 . 3 5 , 1 一 酞基一 2 一 油酞基一 s n 一 甘油一 磷酸胆碱脱氢酶) 是植 物产生多聚不饱和脂肪酸的 关键酶， 它存于内 质网 膜上， 以1 一 酞基一 2 一 油酞基一 s n 一 甘油- 磷酸 胆碱为 底物， 需氧 条件下N A D H 为还 原剂， N A D H : ty h 5 氧化还原酶和C y tb 5 生成多聚 不饱 和脂肪酸， 亚油酸( C i s 9 , 1 2 - 1 8 : 2 ) 和。 一 亚麻酸( C i s 9 , 1 2 , 1 5 - 1 8 : 3 ) ， 它们在植物的膜系统中 主 要以 醋化的 形式 存在。 本研究拟 从甘蓝型油 莱中 克隆F A D 2 基因c D N A 片段， 并构建种子特 异型表达载体， 利用反义 抑制技术， 将F A D 2 反义基因转化双低油莱品种， 使种子中油酸含量提 嘴春云等: 油菜转羞因育种研究 高到8 0 %以上。 32 材料和方法 受 体油菜 材料为双低油菜品种湘油1 5 号( 油酸含量为6 0 %) 。克隆载体为p G E M一 T E a s y ， 受体菌为D H 1 0 B o m R N A 及c D N A 的 合成 采用 试 验盒。 参照G e n B a n k 中 甘蓝型油菜F A D 2 基因 序列 设计引物， 将F A D Z 基因 克隆于p B lu e s c i p t S K 十 的 将p B I 1 0 1 的H in d IU , S a c l 区置换成p u c 1 1 9 的多克 隆位点区， 再用H i n d M , S a l l 切开， 回收大片段。用E c o R I , S a l l 将F A D Z 基因切下。用H i n d M 将 n a p in 启动子 切下。 一起连 接， 即 完 成载体构建。 表达载体 转人农杆菌L B A 4 4 0 4 。 然后按已 建 立的再生体系 转化双低油菜品 种湘油1 5 号。 最后采用KR 扩增法进行检测。 3 . 3 研究结果 油菜F A D Z 基因c D N A 片段的克隆和序列分析。 经1 %的 琼脂糖凝胶电 泳分析表明P C R 产 物的大小为6 5 0 个， 特异性很强， 与引物所对应的片段大小相符。我们提取的油菜叶片总D N A 用同 样引 物进行P C R 扩增， 同 样扩增出6 5 0 b p 产物， 说明F A D z 基因c D N A 片段无插人序列。 重 组克隆质 粒经N o d 酶切消 化后有 一长 约6 5 0 b p 的D N A 片段出 现。 酶切结果表明: P C R 产物已 插人 载体p G E M 一 ， E a s y 中。 F A D 1 基因c D N A 片段的 序列分析结果表明， P C R 产物为6 5 4 6 p ， 经 与G e n B a n k 中序列( A F 2 4 3 0 4 5 ) 进行同 源性比 较， 序列在比 较区的同 源性达1 0 0 %. 油 菜种子 特异表达 基因n a p in 启动 子的 克隆。 经I % 琼 脂糖凝胶电 泳分析表明， P C R 产物 大小约 1 . l k b ， 特异性很强， 与引物所对应的片段大小相符。P C R产物回收后， 与 p B lu e s c ri p t H S K 连接， 酶 切分析 确证其正 确性。 n a p in 启动子 序列分 析表明， 序列长1 1 4 7 个碱 基， 富 含A T , T A T A 盒出 现的一 7 0 位置， 与n a p A 只 有1 个碱基差 别， 即4 6 2 位少1 个G ， 这正好 与n a p B 的 启动子 序列一 致， 它与n a p B 有7 个碱基差别， 即7 9 位多了， 个碱 基， 这正好与n a p A 启动子 系 列一 致。 因 此我 们认为， 新的 启动 子是n a p A 与n a p B 在8 6 位与4 6 2 位之间 发生交换 产生的。 现已 将这一启动子登录到G e n B a n k ， 登录号为B a n k I t 4 2 2 7 9 6 A F 4 2 0 5 9 8 0 新的 种子 贮藏蛋白 启动 子n a p i n 已 与 反义F A D 2 基因 连接， 构建了 种子 特异表达载体， 现正 通过农杆菌介导法导人湘油1 5 号油菜中。 参考 文 献 1 刘后利. 油菜遗传育种学. 北京: 中国 农业大学出 版社， 2 0 0 0 2 付廷栋主编. 杂交油菜的育种与利用. 湖北: 湖北科学技术出版社， 2 0 0 0 3 官春云， 李构， 李文彬. 芸整属植物的生物工程. 湖南: 湖南科学技术出版社， 1 9 9 9 4 E . D . E a r le a n d V . C . K m m f , G e n e ti c e n g in e e ri n g . 助目 际C . G o m e z 一C e m p o : B i o l o g y o f B r a s s i c a C o e a n s p e c ie s E I S E V I E R , 1 9 9 9 5 C . J , 2 0 0 0 年全球转基因作物商品化概述【 J 7 . 张 银玉， 王琴芳译. 生物技术通报， 2 0 D 1 , ( 3 ) : 4 1 一 4 4 4 42 1 世纪作心科技与生产发展学术讨论会论丈集 D e v e l o p m e n t o f R a p e s e e d C u l t i v a r s b y G e n e t i c T r a n s f o r m a t i o n ( O i l s e e d Ab s 臼 习d l a b o r a t o ry w e re G u a n C h u n y u n Wa n g G u o h u a i C ro p I n s t i t u te , H u n a n UX u n C h e n S h e n y u a n L i u Z h o n g s o n g X o n g X i n h u a L i n l i a n g b i n H e Y e h u a A g ri c u l t u r a l U n i v