重组DNA技术 (3).ppt

第十八章重组DNA技术Chapter18TechniquesofRecombinantDNA,DNA分子体外重组技术和核苷酸序列分析技术标志了基因工程时代的诞生。,1973年，HerbertBoyer和StanleyCohen首次成功实现DNA分子的体外重组。,1977年，FrederickSanger和WalterGilbert发明了DNA测序法。,重组DNA技术(recombinantDNAtechnique)：指在体外重新组合DNA分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。,遗传工程(GeneticEngineering)：借助生物学技术，对生物遗传物质进行更改和/或重新组合，以改变生物的遗传性状或创造新的生物品种的遗传学研究技术。,遗传工程有广义和狭义之别，狭义遗传工程专指重组DNA技术(即基因工程)，广义遗传工程包括细胞水平的遗传操作(也称细胞工程)和基因工程。,克隆：是英文“clone”或“cloning的音译，源于希腊文“Klone”，本意为无性繁殖系，即通过无性繁殖而产生的完全相同的子代集合体。,重组DNA技术的基本步骤,第一节重组DNA技术中的酶Section1EnzymesinDNARecombination,重组DNA技术中常用工具酶,一、限制性核酸内切酶(restrictionenzyme),1.定义限制性内切酶：又称限制性核酸内切酶，能识别结合双链DNA分子中的特异序列，并切割DNA。,3.限制酶的分类根据作用特征可以分为型、型和型三种类型(1)三型限制酶的基本特征,型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，作用需ATP供能，能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围400700bp）。,型：具有内切酶和甲基化酶的双重活性，作用需ATP供能，切割位点距离识别位点约25bp。,(2)型限制性核酸内切酶,只由一条肽链组成，不具有甲基修饰酶活性，不需要ATP识别位点一般为46碱基对组成的特异性序列。切割后可产生粘性末端，也可产生平头末端。,二、DNA连接酶(DNAligases),常用的连接酶为T4连接酶，既可以连接粘性末端，也可以连接平头末端。,温度是影响连接反应效率的重要因素，通常在426进行连接反应。,不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火,第二节载体Section2Vectors,DNA载体：是指具有接受外源DNA片段并能导入宿主细胞进行自主复制的特定DNA分子。,克隆载体用于克隆基因或DNA片段的载体。用于表达一个基因则称为表达载体。载体的特点：,(1)含有复制起始点(2)体积小,(3)不能插入到基因组中，易于分离和纯化(4)含有选择性标记(5)含有克隆位点(5)具有适当的长度,表达载体则除了上述特征外，还应在所要表达的基因上游具有转录启动子，下游有转录终止子等；很多表达载体还具有核糖体结合位点。,一、克隆载体,1.质粒载体通常为天然质粒的人工改良DNA。(1)pBR322,为最早发展的常用克隆载体之一，具有如下特点：带有一个复制起始位点具有Ampr和Tetr二个抗性基因，可插入失活具有较小的分子量(4.36kb)可插入较大外源片段(6kb)拷贝数较高(可达10003000),质粒pBR322示意图,(2)pUC系列质粒由pBR322改建而成，主要特征为：,有复制起始位点(ori，源于pBR322)Ampr基因(酶切位点不再单一)含有LacZ基因含有多克隆位点区段,pUC系列大多数是成对的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19,pUC18/19质粒的基本结构,pUC系列质粒的优点：具有更小的分子量和更高的拷贝数适应于组织化学筛选重组体(蓝白斑实验)pUC系列提供多克隆位点(MCS),2噬菌体载体,常用于大片段DNA的克隆，实验中以噬菌体、M13和粘粒最为常用,3.人工染色体,人工染色体(artificialchromosomes)：由染色体的复制元件构建的载体，是为克隆更大片段的DNA而发展的新型载体。,人工染色体主要包括三种：细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和哺乳动物人工染色体(MAC),YAC载体的复制元件包括：复制起点序列(即自主复制序列，ARS)、着丝粒(centromere,CEN)和两个端粒(TEL)。,二、表达载体,根据表达载体的结构特点：原核表达载体酵母表达载体昆虫细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体植物细胞表达载体等,1.原核表达载体,(1)原核表达载体的结构特点：强启动子常用启动子：Lac启动子、Trp启动子、T7噬菌体启动子转录终止子：T7终止子等SD序列：提供核糖体的结合位点,(2)原核表达载体表达特点：非融合型表达蛋白融合型表达蛋白分泌型表达蛋白,T7启动子,Lac操纵序列,rbs(SD序列),T7终止子,MCS,His标签,His标签,凝血酶位点,pET-28a-c(+)克隆表达区结构特征,2.酵母表达载体,一般为质粒型穿梭载体。,选择性标志,通常利用营养缺陷型突变作为筛选的标记，如常用的：URA3、LEU2、HIS3和TRP1。,复制子,通常利用啤酒酵母2m环质粒的复制起始序列。,常用的启动子,常用的酵母基因启动子：醇脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、蔗糖酶、酸性磷酸酯酶和酵母交配因子(MF)。,(1)酵母表达载体的结构特点,上游活性序列,上游活性序列的功能类似于增强子，可促进转录。,终止序列,可终止转录，还可增加mRNA的数量和蛋白质表达的总量。,特定蛋白结构域,如信号肽序列和核定位序列等。,(2)酵母表达载体的表达形式,直接表达,分泌性表达,外源蛋白质表达后积累于酵母细胞质中，如人乙型肝炎表面抗原的表达。,外源蛋白质表达后在信号肽指导下分泌至细胞外，信号因子通常为因子前导序列，Invitrogen公司的酵母表达载体pGAPZ属于此种类型。,3.哺乳动物表达载体,哺乳动物细胞表达外源蛋白的优势是可被修饰。,常用的哺乳动物细胞表达宿主：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)猴肾细胞(COS)等,哺乳动物细胞表达载体一般为穿梭型载体，含有真核细胞表达相应序列，如Invitrogen公司开发的pcDNA3.3-TOPO。,哺乳动物表达载体pcDNA3.1,第三节重组DNA操作的基本过程Section3ProtocolsofDNARecombination,DNA重组的基本过程：1.靶基因DNA片段的制备2.适宜载体的选择和制备3.DNA片段与载体的连接4.重组DNA转化宿主细胞5.含有重组DNA宿主菌的筛选6.重组DNA分子的鉴定,基因组DNA,质粒载体,限制酶,目的基因序列,重组后含有外源基因的载体,DNA连接酶,转化,扩增,重组DNA技术的基本步骤,一、目的DNA片段的制备,来源与方法：基因组DNA、cDNA、PCR产物和化学合成的DNA。,基因文库(genelibrary)：也称基因组文库(genomelibrary)，用限制酶切割基因组DNA获得成千上万的在一定大小范围内的DNA片段，每一个DNA片段与载体分子连接，产生一个重组DNA分子的混合物，重组DNA分子转化宿主菌后，每一个转化细胞含有一个重组DNA分子，这些克隆的集合体被称为基因文库。,基因组文库的构建,cDNA文库(cDNAlibrary)：提取细胞总mRNA，经反转录获得总cDNA，每一个cDNA分子与载体连接产生了一个重组DNA分子的混合物，再转化宿主菌，每个宿主菌细胞克隆将含有一个cDNA重组分子，这些克隆的集合体被称为cDNA文库。,若目的序列全部已知，可以通过人工合成的方法获取靶序列。,已知目的序列两端序列时，可以通过PCR方法获取靶序列。,cDNA文库的构建,二、载体的选择与准备,选择原则：依据重组DNA的目的，选择适当载体。,适合的选择标记,三、DNA分子的体外重组,互补性粘性末端将使连接更容易。,限制酶粘性末端连接T-载体粘性末端连接平末端连接同聚物加尾连接人工接头连接,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,限制酶粘性末端连接,目录,目录,平末端链接,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,目录,4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目录,四、重组DNA分子导入宿主细胞,1.转化,转化(transformation)：质粒DNA分子导入细菌宿主，并使其获得新表型的过程。,三种方法：转化、转染和感染。,感受态细胞(competentcell)：指经过处理后变得更容易接受外源DNA的细菌细胞。如使用CaCl2处理E.coli细胞，可获得E.coli的感受态细胞。,2.转染,转染(transfection)：将重组DNA分子转入真核细胞的过程。,转染细胞：接受了外源DNA分子的宿主细胞。,稳定转染(stabletransfection)：进入宿主细胞的DNA分子整合到宿主细胞基因组中。,瞬时转染(transienttransfection)：进入宿主细胞的DNA分子游离于宿主染色体之外。,转染方法：常用磷酸钙法和脂质体法。,3.感染,感染(infection)：以病毒或噬菌体为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，感染适当的细胞，并在细胞内扩增，也称为转导(transduction)。,五、重组子的筛选与鉴定,1.载体的抗药性标志,抗氨苄青霉素基因(Ampr)抗四环素基因(Tetr)抗卡那霉素基因(Kanr)等,2.载体抗药性标志插入失活选择,一般选用含有两个以上抗药基因的载体，外源DNA插入其中一个抗药基因，并导致该基因失活。如pBR322质粒含有Ampr基因和Tetr基因(BamHI)。,(插入失活法)抗药性标记选择,目录,3.-互补法(即蓝白斑筛选法),质粒-肽(无半乳糖苷酶活性),-肽-肽(半乳糖苷酶活性),宿主-肽(无半乳糖苷酶活性),X-gal,X(蓝色产物),+gal(半乳糖),互补的检测,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,4.营养缺陷型的互补筛选,5.核酸分子杂交筛选,通过原位杂交、Southern印迹和Northern印迹分析转化子。,根据插入序列设计探针,与转化子克隆进行杂交,有杂交信号的为阳性克隆,6.PCR法进行鉴定,根据插入序列设计PCR引物,以转化子的重组DNA为模板进行PCR扩增,电泳分析PCR产物,根据PCR产物长度判断阳性克隆，还可结合PCR产物测序进行更精确的分析,7.DNA序列分析鉴定,直接进行DNA测序，精确分析阳性克隆。,对阳性重组转化子的精确鉴定一般先选择前6种方法之一进行初步分析后，再进行DNA测序分析。,第四节外源基因的蛋白质表达Section4ExpressionofRecombinantGene,重组基因表达体系的创建过程包括：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离、纯化等技术。,根据宿主细胞的不同可分为：原核表达体系真核表达体系,一、原核表达体系,1.不同表达方式的优缺点,(1)非融合型表达优点：与真核生物体内蛋白质结构最相似，功能最相近。缺点：容易被细菌蛋白酶所破坏。,(2)融合型表达优点：可以抵御细菌蛋白酶的破坏，融合蛋白比天然的外源蛋白更加稳定,缺点：需要去除原核多肽。原核多肽切除方法：化学裂解法和酶解法。,(3)分泌表达优点：防止大肠杆菌对表达产物的降解，减轻大肠杆菌代谢负荷和恢复表达产物天然构象。,包涵体益处：防止蛋白酶对表达蛋白的降解，有利于表达产物分离纯化。,包涵体缺点：表达蛋白不具有生物活性，必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性。,2.包涵体(inclusionbody),是大肠杆菌高效表达外源基因时形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。,二、真核表达体系,1.酵母表达体系(1)酵母表达体系具有诸多优点：,可以对蛋白进行多种翻译后修饰培养简单自身分泌蛋白少，是理想的分泌型表达系统具有较高的安全性，如啤酒酵母表达体系分离纯化的过程比较简单,(2)酵母表达体系实例干扰素、人表皮生长因子、人乙型肝炎表面抗原和核心抗原等。,2.哺乳动物细胞表达体系优点：可表达克隆的cDNA，也可表达真核基因组DNA。表达蛋白可被适当修饰。,缺点：操作技术难费时成本高,三、重组蛋白质分析鉴定,重组蛋白质的鉴定方法及标准,四、重组蛋白质药物制备,生物制药领域的上游技术包括基因克隆、表达载体构建与表达；下