胆碱酯酶的纯化及生物传感器研制

序号： 编码： 第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称： 胆碱酯酶的纯化及生物传感器研制 学校全称： 华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）： 陈小军 杨文 刘顺字 任永霞 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 报送方式：省级报送作品高校直送作品说 明1.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3.表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4.序号、编码由第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.522cm）。6作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7.其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A2申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写；2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。申报者代表情况姓名陈小军性别男出生年月1980年10月7日学校华南农业大学系别、专业、年级农药学系、农药学、2006级学历博士在读学制三年入学时间03硕士、06博士作品名称胆碱酯酶的纯化及生物传感器的研制毕业论文题目导向农药的分子构建及机理通讯地址华南农业大学农药与化学生物学教育部重点实验室邮政编码516042办公电住地通讯地址华南农业大学六一区研究生宿舍5-615室邮政编码510642住宅电他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位杨文男26硕士华南农业大学刘顺字男24本科华南农业大学任永霞女26本科华南农业大学资格认定学校学籍管理部门意见以上作者是否为2006年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是 否 （部门签章）年 月 日院系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果是 否负责人签名：年 月 日B3申报作品情况（科技发明制作）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认； 3本表必须附有研究报告，并提供图表、曲线、试验数据、 原理结构图、外观图（照片）,也可附鉴定证书和应用证书； 4作品分类请按照作品发明点或创新点所在类别填报。作品全称胆碱酯酶的纯化及生物传感器的研制作品分类（ D ）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品设计、发明的目的和基本思路，创新点，技术关键和主要技术指标1.发明目的随着人民生活水平的提高，人们已越来越注重生活的质量。我国因历史原因，农药在农产品中的超标严重，这一方面危害了我国消费者的身心健康，同时也对我国农产品出口贸易带来巨大损失。自1990年以来，我国对欧洲、日本、美国等国家出口的鸡肉、猪肉、兔肉、鳗鱼、蜂蜜、茶叶和蔬菜等农产品，由于农药残留超标，被拒收、扣留、退货、销毁、索赔和终止合同的现象时有发生，许多传统大宗出口创汇农产品被迫退出了国际市场。国外特别是发达国家利用名目繁多的安全卫生措施限制我国农产品入境，如美国对苹果及其制品农残检测项目达102种，目的是为了保护本国人民的身体健康，同时用技术壁垒保护本国农产品市场我国进口农产品主要通过疫情的风险分析进行检疫把关，而农药残留把关由于我国农药残留限量标准少，检测技术落后，远未对进口农产品起到把关作用，导致在对外贸易中处于很不利的地位。目前，农林业广泛使用的有机磷农药对海洋生物危害巨大，已经对海水养殖业形成威胁。为了控制海水有机磷农药的污染程度，减少渔业损失，我国现行的海水水质标准(GB 3097-1997)和渔业水质标准(GB 11607-89)都对水体中马拉硫磷、甲基对硫磷等有机磷农药的浓度作了严格限定。然而，仅有标准还不足以有效控制有机磷农药的污染水平，重要的是对有机磷农药进行快速灵敏的监测。对具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测的生物传感器的研制越来越迫切。因此发展快速、可靠、灵敏的农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，无疑是控制着两类农药残留、保证消费者安全的基础，所以，无论是从保证我国人民的农产品食用安全，还是为我国加入WTO后提供农产品检测技术保障、发展外向农业经济方面来看，大力加强我国农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测技术尤其是快速检测技术的研究已刻不容缓。本作品正是在这一背景下应运而生的。本项目主要开展了基于酶抑制快速检测农药残毒方法中的关键技术研究，找到了可提取对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的酶源，建立了农药残留快速检测胆碱酯酶的提取和纯化工艺，建立了农药残留快速检测胆碱酯酶的提取和纯化工艺，解决了胆碱酯酶在常温下不稳定的难题，建立了基于所选酶源生产的胆碱酯酶抑制法快速测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法。并利用所提纯的胆碱酯酶研制用于农产品残留快速检测和水体中农药监测生物传感器。2.基本思路冷冻离心原材料提取试剂提取高速组织匀浆冷冻干燥收集活性峰并透析除盐酶电极固定化酶电极制备初级纯化、亲和层析酶电极稳定性检测毒死蜱残留 （1）酶源的筛选：通过对几十种生物体的胆碱酯酶提取发现酶源对甲胺磷、对氧磷、西维因、呋喃丹的抑制均比较灵敏，抑制中浓度分别为0.05、0.005、5、1mg/kg，再综合原料的易得性、经济指标等各种因素，可以说获得的这一酶源是相当好的。（2）酶的纯化：（）原材料除杂：获得原材料后应尽量除去脂肪、结缔组织等不含酶的部分。（）提取溶液的配置：分别取A、B试剂适量加入蒸馏水中，制成含两种试剂均为1的溶液，用pH计将其pH值调为7.5，现用现配。（）材料的匀浆与提取：将处理好的材料加入适量的提取溶液在高速组织捣碎机中匀浆，然后加入四倍量的提取溶液提取10 h以上，其间给予间隙搅拌。（）提取体系的离心：在4条件下5000 rpm冷冻离心20min，弃残渣，取上清液待用。取部分上清液进行冷冻干燥。（）硫酸铵盐析：在上清液中边搅拌边加入固体硫酸铵至40%饱和度，然后置于4冰箱中盐析5h以上。（）离心与透析：将上述盐析体系在4条件下5000 rpm冷冻离心20 min，弃上清液，收集沉淀物并用适量蒸馏水溶解，然后装入透析袋中对蒸馏水进行透析，期间勤换水，直至用Ba(OH)2检查无硫酸铵为止。取部分透析液进行冷冻干燥。（）DEAE-Sepharose 离子交换层析：将上述透析液用0.01 mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液平衡过夜，DEAE-Sepharose离子交换柱也用0.01 mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液平衡，用平衡好的样品上样，用1-2倍的平衡缓冲液冲洗柱子，然后用（0.01 mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液）+（0.4mol/L NaCl+0.01 mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液）进行梯度洗脱并分部收集。并同时检测蛋白含量和胆碱酯酶活力，收集活性峰并对蒸馏水透析除盐，最后将其冷冻干燥。将从Sephadex G-200层析柱中部分纯化的胆碱酯酶上样于亲和层析柱中，先用缓冲液A在流速为24 mL/h，下进行杂蛋白洗脱，直至在洗脱液中无法检测到蛋白的存在。然后利用0.02M磷酸缓冲液（pH7.0，含1mM EDTA和100mM普鲁卡因胺，缓冲液B）选择性地从亲和层析柱中洗脱丁酰胆碱酯酶，流速控制为24mL/h，收集含有丁酰胆碱酯酶高活力的几管(通常为1-2管)，混合在一起。去除普鲁卡因胺和蛋白浓缩将上述步骤中获得的纯化丁酰胆碱酯酶溶液加入NaCl直至最后浓度达1M，然后在0.02M磷酸缓冲液中透析2-3次，将纯化并去盐的胆碱酯酶溶液真空冷冻干燥进行蛋白浓缩。（3）酶的稳定性改进：由于酶是具有生物活性的物质，其在放置或使用过程中活力会损失，一般的酶制品在常温下放置2-3d活性就将损失大半，这对其应用是一个很大的限制。为了找到一种理想的稳定剂，分别试验了抗氧化剂、络合剂、脱水剂、抗光解剂等近二十种试剂对酶稳定性的影响。结果表明，加入稳定剂B后酶的稳定性大大提高。在4下，不加稳定剂时，放置约25d其活力损失一半，放置3个月后基本无活力，而加入稳定剂B在4下放置12个月后，酶活力还有原来的70%。在33时，稳定剂的作用更明显，不加稳定剂，酶在33下放置约15天活力基本消失，而加入稳定剂B后其活力仍有原来的86%，一个月后其活力仍有原来的73%。可见加入稳定剂B后对酶的活性起了很好的保护作用。（4）最佳反应条件的确立：在加入显色剂（DTNB）50L的情况下，应用本胆碱酯酶快速检测农药残毒的最佳条件是：pH8.0的磷酸盐缓冲液；反应温度37；50L的底物（BTCI）；50L酶溶液；反应时间180s。（5）酶对农药的灵敏性：选择A值在0.3-0.9的酶分别测试甲胺磷和呋喃丹不同浓度对酶的抑制率，同一浓度的甲胺磷或呋喃丹标准液对不同A值的酶样抑制率是非常接近的，从统计学分析，抑制率之间无显著差异。这个结果说明，在运输或保存过程中酶的活力发生变化，但只要A值仍在0.4-0.8之间，则检测时对样品农药残留的判断并不会产生偏差。另外选择了5种有机磷类农药和5种氨基甲酸酯类农药进行了试验。各种农药的最低检出浓度（mg/L）分别为：甲胺磷0.25、氧乐果1.4、久效磷0.6、对硫磷1.0、甲拌磷0.7、抗蚜威1.0、速灭威1.0、仲丁威1.0、西维因0.6、呋喃丹0.3，可见不同种农药对酶的抑制率是不同的，但同种农药浓度越高，酶活性被抑制率也就越大。（6）生物传感器的研制：利用戊二醛法，将胆碱酯酶固定在醋酸纤维膜上，测定时用O型圈将酶膜固定在四氨基钻酞箐聚合膜修饰的玻碳电极上，以氯代胆碱为底物。当酶膜上固定化酶失活后，可以更换一张新的酶膜。这种带有可拆卸膜的胆碱酯酶生物传感器，由于其膜的更换方式简单，更加适合现场的在线监测。3.创新点（1）找到一条来源丰富的胆碱酯酶酶源，活性高，对有机磷类农药甲胺磷等敏感。（2）解决了酶的敏感性问题，通过加入稳定剂大大提高了酶的贮藏稳定性，使用方便。（3）研制了丁酰胆碱酶酯酶用于农药残留的快速检测方法-生物传感器法，便于快速检测。4.技术关键（1）胆碱酯酶的提取技术（2）胆碱酯酶的纯化工艺及以纯化出的胆碱酯酶为固定酶的生物传感器酶的固定化技术5.主要技术指标（1）酶源：从几十种生物体中筛选出了一种来源丰富的生物体，解决了农药残毒快速检测的酶源问题。（2）比活力高：0.5U/mg蛋白以上。（3）敏感性强：对甲胺磷、氧化乐果、西维因、呋喃丹等高毒常用农药的抑制中浓度分别为0.05、0.005、5和1mg/kg。（4）稳定性好：在33下保存1个月后的活力下降在30%以内。作品的科学性先 进性（必须说明与现有技术相比、该作品是否具有突出的实质性技术特点和显著进步。请提供技术性分析说明和参考文献资料）根据查新和与国内外同类研究同类技术比较，该技术处于国内领先水平。主要体现在：（1）酶源的筛选：该成果通过对近30种酶源的筛选，找到了一种来源广泛，易于加工，对有机磷和氨基甲酸酯类农药反应灵敏的胆碱酯酶的酶源。在本项目成果出来以前，国内用于农药残留检测的胆碱酯酶都是从敏感家蝇头部提取，不易大量生产。而国外尚未见类似的研究报告。对甲胺磷等高毒农药灵敏度也不够好。（2）研究了贮存温度和稳定剂对酶稳定性的影响，找到了较好的稳定剂，突破了在常温下保持酶的稳定性等一系列技术难点；目前，一般酶的保存在常温下3 d就失活一半，而我们的酶在常温下可保存一个月以上。（3）研究了测定时间、反应温度、底物浓度、酶量等因素对检测效果的影响，为本技术的应用提供了良好的技术保证。与传统方法相比，本技术操作流程易于掌握，成本低，准确性高，便于推广应用。（4）首次利用所纯化的丁酰胆碱酯酶研制可拆卸电流型生物传感器，更适合现场的在线检测。相关参考文献Andrea C, Modesto D C, Marco C. et al. 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每克胆碱酯酶可测试2000份样本，测试1份样本试剂加酶的成本约1元，若每测试1份样本收费3元，那每克胆碱酯酶带来额外的间接利润就是2000元，全国每年5000克胆碱酯酶就可带来间接利润1000万元 ；而因此项目研制的生物传感器销售利润和避免的损失更是难已估量。二是社会意义，农药残毒快速检测专用胆碱酯酶自年批量化提取以来，必将迅速得到农业部农药检定所的认可并向全国大力推广，该技术目前正被逐步推广应用到各省农药检定所、各市农产品质量检测中心、蔬菜出口基地和大型农贸市场等单位和场所，应用前景十分广阔。这一技术的广泛应用，可以有效防止有毒菜进入市场，大大降低了农药中毒事故，由此产生的社会效益是非常巨大的。专利申报情况提出专利申报 申报号 申报日期 年 月 日已获专利权批准 批准号 批准日期 年 月 日 未提出专利申请科研管理部门签 章 年 月 日C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。目前农药残留快速生化检测技术主要是酶抑制法。酶抑制法和酶联免疫法检测农药残留试剂盒或试纸条在欧美等国家是农药残留普查和田间实地检测的基本手段。许多公司专门从事检测试剂盒或试纸条的开发与应用。农药残留快速检测技术在我国应用最多的是酶抑制法，利用这一原理生产的各种速测卡、速测仪具有高的专一性、灵敏性和准确性及低成本等优点，正越来越多地进入蔬菜、果品、茶叶等生产基地、农贸市场、超市及监督部门，已成为我国农药残留快速检测的主流技术，是当前和今后一段时期内农产品农药残留快速检测的首选方法之一。AChE的来源有植物源、动物源和昆虫源。在动物体内AChE主要分布于动物的脑、神经细胞和神经肌肉的接头等神经组织和肝脏、血清、血红细胞等非脑组织。从目前已生产的动物源酶制剂来看，来源于猪的肝脏和鸡血的AChE含量和活性较高。水生动物也是AChE的重要来源。经研究其AChE在水生生物多个组织中均有分布。甲壳类小长臂虾肌肉组织中AChE的含量较高，达到178 nmol/minmg。Galgani 等通过对欧洲黄盖蝶（Limanda limand）脑、腮、肌肉、肝脏、性腺、精巢的研究中发现其头部的AChE活性最高。昆虫中AChE主要分布于昆虫的头部、胸和腹部的神经索中。在双翅目昆虫中，大部分酶活性集中于头部，胸和腹部只占15%。棉铃虫成虫和幼虫头部分别占78.2%和90.3%。但棉铃象甲（Anthonomus grandis）主要AChE活性集中腹部占50%，头部只占40%。BChE主要分布于血清及肝脏中，肌肉和脑组织也有少量存在。BChE能水解许多酯类、酰胺类化合物，参与某些药物的代谢过程，该酶还能促进细胞的生长。基于胆碱酯酶的这一特性，国内外专家学者对该酶的来源方面做了很多研究。主要是对昆虫体内、鱼脑及鱼肌肉等几种来源的ChE进行了研究。来源于动物的AChE纯化曾有报道从猪肝，鸡血中提取其活性都较高。还有从浙江产眼镜蛇、狗、牛、马脑中、牛红细胞、赤子爱胜蚯蚓中分离纯化了AChE。为了克服人类神经传导方面的疾病，也有对人脑和人血清中的AChE进行了纯化。由于近年来水体污染日益受到人们的重视，基于淡水鱼类，海洋生物中的AChE的纯化工作方兴未艾。鱼类中提取的AChE主要是来自淡水鱼或海水鱼的肌肉、脑组织。如从大黄鱼肌肉、麦穗鱼脑组织、鲅鱼脑组织。对于海洋中的其他生物，孙曼荠等从中国丁氏电鳐体内纯化了AChE，Frost等初步纯化得到微型甲壳动物的AChE。来自昆虫体内的AChE的纯化报道较多，文献报道，已有以下昆虫的AChE进行了分离、纯化或者部分纯化：家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、尖叶库蚊、黄粉甲、美洲菀夜蛾、豆荚草盲蝽、马铃薯叶甲、骚扰角蝇、棉铃虫。在本项目研究出来以前，国内用于农药残留检测的胆碱酯酶都是从敏感家蝇头部提取，不易大量生产。而国外尚未见类似的研究报告。对甲胺磷等高毒农药灵敏度也不够好。本项目通过对近30种酶源的筛选，找到了一种来源广泛，易于加工，对有机磷和氨基甲酸酯类农药反应灵敏的胆碱酯酶的酶源。 在生物传感器的研制方面，大多数报道集中在实验室研究阶段。Mionetto等在一种光交联聚合物上同时固定乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶，制备了一种电流型的生物传感器。他们发现，在乙酰胆碱醋酶与胆碱氧化酶的摩尔比0.25: 5时，检测的灵敏度最高，其对地虫磷和对氧磷的检测限分别可达10-6和10-10 M。Martorell等和Wang 等设计了一种结实的，能经抛光更新表面的胆碱酯酶电极，该电极由石墨粉、环氧树脂和AChE构成。酶在环氧树脂-石墨混合体中能保持其活性。以乙酰硫代胆碱为基质，工作电压700mV，检测对氧磷的检测限为27 g/mL，该电极的优点是只需经过简单抛光就可再用。Larosa寻求以乙酸氨基苯酯作AChE的底物。用戊二醛和牛血清白蛋白将AChE固定在尼龙膜上，然后将膜片覆盖在玻碳电极表面，工作电压为250mV，测定对氧磷的检测限为10-7 mol/L，膜片的重活化率高。Hiroaki等首次将AChE固定于银电极的表面，并且为了防止吸附硫代胆碱，在表面覆盖一层透析膜，获得较大的酶活性。Niwa研究组利用的锇-聚乙烯吡咯是非常理想的媒介物。它与辣根过氧化物酶结合可在OV(vs.Ag/AgCl)条件下进行测定，这就可以在活体检测时避免很多易氧化物质如抗坏血酸的干扰。该研究组将胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶、辣根过氧化物酶与锇-聚乙烯毗陡同时固载于玻碳电极表面，成功制作了用于大脑切片研究的在线乙酰胆碱生物传感器。 魏福祥等以固定化AChE作为敏感物质、银基汞膜电极作为基础电极，制备了安培型生物传感器，采用单扫描伏安法考察了传感器对有机磷农药敌敌畏的响应特性。以乙酞硫代胆碱作底物，在1. 010-8 -1.010-6 mol/L浓度范围内对敌敌畏进行了测定，检出限为2.810-10 mol/L。Xavier等把酸碱指示剂（氯酚红）和AChE共同固定在多孔硅珠上，构建成检测氨基甲酸醋类农药的光纤型酶传感器。底物酶促反应产生的乙酸导致pH值降低，可被抓酚红感应，颜色由黄色变为紫色。由于农药对ACNE的抑制作用，吸光度将发生变化。因此，通过测定酶抑制前后体系的吸光度变化，可计算出农药的含量。Doong等利用溶胶-凝胶技术将AChE和异硫氛酸荧光素固定在膜上，并与光纤束、紫外灯、聚光镜、光电倍增管和微机组合成光纤型酶传感器。此传感器对0.5-20 mmol/L的底物呈线性响应，而且具有良好的重现性，当对氧磷加人系统中30 min后，即可观察到30%的酶活抑制率。Rainina等人报道的测定有机磷农药的电位型传感器则将敏感元件从酶换成了微生物。他们在-14的条件下用聚乙烯醇包埋含有磷酸水解酶的噬菌体，然后将此膜紧贴在pH电极表面。磷酸水解酶水解有机磷中的P-O、 P-F、 P-S以及P-CN键，产生了溶液体系pH的变化。电极表面附有大孔的膜，使得氢离子很容易渗透，从而得以检测。该电极中的噬菌体在4时可保持活性2个月。 本研究利用利用戊二醛法，将胆碱酯酶固定在醋酸纤维膜上，测定时用O型圈将酶膜固定在四氨基钻酞箐聚合膜修饰的玻碳电极上，以氯代胆碱为底物。当酶膜上固定化酶失活后，可以更换一张新的酶膜。这种带有可拆卸膜的胆碱酯酶生物传感器，由于其膜的更换方式简单，更加适合现场的在线监测。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写； 2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名性别年龄职称工作单位通讯地址邮政编码单位电话住宅电话推荐者所在单位签章 （签章） 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价其它说明推荐者情况姓 名性别年龄职称工作单位通讯地址邮编单位电话住宅电话推荐者所在单位签章 签章日期 年 月 日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价其它说明学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章 年 月 日E大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日F参赛作品打印处胆碱酯酶的纯化及生物传感器的研制总结报告陈小军指导教师：徐汉虹教授、博士（华南农业大学资源环境学院，广州， 510642）随着人民生活水平的提高，人们已越来越注重生活的质量。几年前提出的菜蓝子工程是为了解决居民吃菜难的问题，而近年提出的放心菜、无公害蔬菜、绿色食品则是为了保障人们的饮食卫生与安全。这主要源于频频发生的农药中毒伤害、死亡事故，已到了谈农药残留色变的地步，这是因为农药一方面造成中毒者身体伤害，甚至中毒个体死亡；另一方面则通过在人体内的蓄积，造成对下一代的伤害，从而影响人类的种群质量。产生这些问题的主要原因：一是我国农药结构不合理，我国杀虫剂的70%是有机磷和氨基甲酸酯类，而其中70%以上是高毒农药，这使农民在用药时受到极大限制；二是使用者不按规定使用农药，农药管理条例中明确规定“应按照规定的用药量、用药次数、用药方法和安全间隔期施药，防止污染农副产品，剧毒、高毒农药不得用于防治卫生害虫，不得用于蔬菜、瓜果、茶叶和中药材”，而有些农民往往不遵守上述规定而滥用农药；三是没有一整套的严格检测、执罚措施。农药在农产品中的严重超标，一方面危害了我国消费者的身心健康，同时也对我国农产品出口贸易带来巨大损失。自1990年以来，我国对欧洲、日本、美国等国家出口的鸡肉、猪肉、兔肉、鳗鱼、蜂蜜、茶叶和蔬菜等农产品，由于农药残留超标，被拒收、扣留、退货、销毁、索赔和终止合同的现象时有发生，许多传统大宗出口创汇农产品被迫退出了国际市场。国外特别是发达国家利用名目繁多的安全卫生措施限制我国农产品入境，如美国对苹果及其制品农残检测项目达102种，目的是为了保护本国人民的身体健康，同时用技术壁垒保护本国农产品市场。我国进口农产品主要通过疫情的风险分析进行检疫把关，而农药残留把关由于我国农药残留限量标准少，检测技术落后，远未对进口农产品起到把关作用，导致在对外贸易中处于很不利的地位。有机磷和氨基甲酸酯类农药具有杀虫力强、药效快等特点，它们是我国目前主要应用的农药品种，也是发生农药残留超标和农药中毒事故的主要来源。因此发展快速、可靠、灵敏的农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，无疑是控制着两类农药残留、保证消费者安全的基础，所以，无论是从保证我国人民的农产品食用安全，还是为我国加入WTO后提供农产品检测技术保障、发展外向农业经济方面来看，大力加强我国农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测技术尤其是快速检测技术的研究已刻不容缓。农药残留检测技术主要有生物检测法、生物化学的酶抑制法、免疫分析法、仪器分析法等方法。蔬菜上农药残留的检测有其特点，即应满足廉价、快速、多残留检测的要求。从技术上来看，唯有生物化学的酶抑制法能同时满足这些要求。目前农药速测技术主要有：本研究根据我国农产品化学农药残留超标严重和我国农业用药杂乱的情况，主要开展了基于酶抑制快速检测农药残毒方法中的关键技术研究，找到了可提取对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的酶源，建立了农药残留快速检测胆碱酯酶的提取和纯化工艺，解决了胆碱酯酶在常温下不稳定的难题，建立了基于所选酶源生产的胆碱酯酶抑制法快速测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法并并酶固定化制备酶生物传感器。现将研究结果报道如下：1. 研究总体路线路线原材料高速组织匀浆提取试剂提取冷冻离心收集活性峰并透析除盐冷冻干燥初级纯化、亲和层析酶电极制备酶电极固定化酶电极稳定性检测毒死蜱残留原材料初级纯化、亲和层析初级纯化、亲和层析图1研究总体路线2.材料与方法2.1实验仪器与药品蛋白质纯化仪、冷冻层析柜、组织捣碎机、紫外分光光度计、移液枪、电泳仪、水浴锅、pH值计、高速离心机。氯化乙酰胆碱：上海三爱化学试剂有限公司；碘化硫代乙酰胆碱、碘化硫代丁酰胆碱、5,5-二硫代双二硝基苯甲酸、1-环已基-3-（2-吗啉代乙基）碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉、硫酸普鲁卡因、二甲基氨基苯甲酸、普鲁卡因胺：Sigma公司；S-butyrylthiocholine、S-Acetylthiocholine、溴化氰：Aldrich公司；溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B、羟乙基活化的琼脂糖凝胶4B：Pharmacia公司；十二烷基硫酸钠：武汉化学试剂厂；牛血清白蛋白：武汉亚法生物科技有限公司；T