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第 7 卷 第 12 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 7 No. 12 2016 年 12 月 Journal of Food Safety and Quality Dec., 2016 基金项目: 广东省质量技术监督局科技项目(2013PS02) Fund: Supported by the Science and Technology Project of Administration of Quality and Technology Supervision of Guangdong Province (2013PS02) *通讯作者: 范安妮, 硕士, 工程师, 主要研究方向为分子生物学。E-mail: annie1860 *Corresponding author: FAN An-Ni, Master, Engineer. Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision, Foshan 528300, China. E-mail: annie1860 牛奶中主要过敏原 s1-酪蛋白的生物信息学分析 范安妮*, 佘之蕴, 梁宇斌, 张 娟, 周臣清 (广东产品质量监督检验研究院, 国家食品质量监督检验中心(广东), 佛山 528300) 摘摘 要要: 目的目的 用生物信息学方法分析预测牛奶中主要过敏原 s1-酪蛋白的结构与功能。 方法方法 从 Genbank 搜 索 s1-酪蛋白的氨基酸序列, 采用多种生物信息学分析手段对该序列进行分析预测, 包括信号肽、疏水性、跨 膜区、活性位点、B 细胞表位、二级结构和三级结构。结果结果 s1-酪蛋白的 116 位是信号肽, 无跨膜区, 有 3 个糖基化位点、5 个酪蛋白激酶磷酸化位点、3 个蛋白激酶 C 磷酸化位点。IEDB 数据库预测 s1-酪蛋白的抗 原区分别为氨基酸的 1629、4550、5254、5670、7475、7786、94104、142152、173179 和 185210, 同时预测构建了 s1-酪蛋白的二级结构和三级结构。结论结论 预测得到的 s1-酪蛋白结构和功能信息, 可为牛奶 过敏原酪蛋白的致敏机制研究及检测方法建立提供信息基础。 关键词关键词: 过敏原; s1-酪蛋白; 生物信息学; 牛奶 Bioinformatics analysis for s1-casein of main allergens in milk FAN An-Ni*, SHE Zhi-Yun, LIANG Yu-Bin, ZHANG Juan, ZHOU Chen-Qing (Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision, China National Quality Supervision and Testing Center for Foods (Guangdong), Foshan 528300, China) ABSTRACT: Objective To analyze and predict the structures and functions of main allergen s1-casein in milk by bioinformatics methods. Methods The amino acid sequence of s1-casein was searched in Genbank. Its signal peptides, hydrophobicities, transmembrane domains, active site, B-cell epitopes, the secondary structures and tertiary structure were predicted and analyzed by bioinformatics methods. Results The predicted signal peptide was in the 116 amino acid secquence. It had no transmembrane region, 3 glycosylation sites, 5 casein kinase phosphorylation sites and 3 protein kinase C phosphorylation sites in the protein. After prediction by IEDB, the antigen areas of s1-casein were in the amino acid sites of 1629, 4550, 5254, 5670, 7475, 7786, 94104, 142152, 173179 and 185210, respectively. Meanwhile, the secondary structure and tertiary structure were predicted and built. Conclusion The predicated structures and function information of s1-casein can provide information base for the sensitization mechanism research and detection of casein allergens in milk. KEY WORDS: allergen; s1-casein; bioinformatics; milk 1 引 言 牛奶是 8 大类食物过敏原之一, 其引起的过敏严重威 胁婴幼儿健康, 严重时会导致死亡。食品法典委员会 (Codex Alimentarius Commission, CAC)、美国及欧盟等的标 签法明确要求必须在食品标签上明确标示牛奶过敏原1-7。 第 12 期 范安妮, 等: 牛奶中主要过敏原 s1-酪蛋白的生物信息学分析 4741 牛奶主要过敏原为酪蛋白、-乳白蛋白、-乳球蛋白 等 30 种以上蛋白质8, 有文献报道, 大约 65%的牛奶致敏 者都对酪蛋白过敏9。蒋红玲等10通过研究组胺定向释放 率、抗血清中 sIgG 的效价及 Western blot 分析, 结果表明 酪蛋白是牛奶中的主要致敏组分。 s1-酪蛋白是酪蛋白中最 主要的一个过敏原, 而且 s1-酪蛋白占据牛奶总蛋白的 30%以上11,12, 因此, 开展对酪蛋白致敏机制的研究以及 建立牛奶过敏原酪蛋白的测定方法很有必要, 这些研究的 基础是明确牛奶酪蛋白的性质, 但目前尚未有关于 s1-酪 蛋白的结构及功能研究的报道。 随着计算机技术的发展和生物信息数据库的日益扩 大, 从已有的数据中总结蛋白的序列及结构特征, 并通 过计算手段对其他蛋白进行结构、活性位点等信息预测, 然后结合实验予以验证, 成为一种研究未知蛋白的技术 路线。 2 蛋白质结构分析 通过美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的 Genbank 查询到牛奶 s1-酪蛋白的氨基酸序列, 该序列的登录号为 AY94838513。 理化性质分析通过 ExPASy ProtParam 进行; 信号肽预测通 过 CBS SignalP 进行; 疏水性分析通过 expasyprotscale 进行; 跨膜区域预测使用了两种方法: embnet和TMHMM; 活性位 点预测通过 expasyscanprosite 进行。 二级结构预测采用 ExPASy proteomics 的 SOPMA 和 PORTER 两种模式进行, 并对这两种模式下预测的结果进 行比对。 三级结构预测采用 phyre2 进行, 该模式是基于蛋白 折叠建模。 B 细胞表位预测基于免疫表位数据库(The Immune Epitope Database, IEDB)进行, IEDB 数据库是目前使用最 为广泛和最具权威性的表位数据库。 3 结果与分析 3.1 序列信息 在 NCBI 数据库搜索登录号为 AY948385 的信息, 查 询得到牛奶 s1-酪蛋白的氨基酸序列: MKLLILTCLVAVAL ARPKQPIKHQGLPQGVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKV NELSTDIGSESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPISVE QKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYNVPQLEIVPNL AEEQLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPQLFRQF YQLDAYPSGAWYYVPLGTQYPDAPSFSDIPNPIGSENSG KTTMPLW。 3.2 理化性质 使用ExPASy ProtParam工具录入s1-酪蛋白氨基酸序 列后, 分析得到该蛋白的理化性质。该蛋白共 214 个氨基 酸残基, 相对分子质量为 24326.7, 理论等电点为 4.85, 分 子式为 C1102H1709N277O329S7, 不稳定指数为 57.98, 属于不 稳定蛋白。 3.3 信号肽预测 采用 CBS SignalP 进行信号肽分析, 一般来讲, 信号 肽在蛋白质 N 端, 极少超过 45 个氨基酸残基, 因此分析蛋 白质 N 端 70 个氨基酸残基。信号肽预测结果如图 1 所示, 每个氨基酸对应一个 S 值, 信号肽区域的 S 值较高; 每个 氨基酸对应一个 C 值, 在剪切位点处 C 值最高; Y 值是综 合考虑 S 值和 C 值的一个参数, 剪切位点是 S 值陡峭的位 置。预测结果显示, 第 16 位 C 值最大, S 值陡峭, Y 值最高 峰, 预测为信号肽剪切位点, 因此, 预测 116 位是 s1-酪 蛋白的信号肽。 图 1 s1-酪蛋白信号肽预测结果 Fig. 1 Prediction of the signal peptide for s1-casein 3.4 疏水性分析 采用 ExPASy Protscale 对 s1-酪蛋白进行疏水性分析, 得分大于 0, 且分值越大, 表示疏水性越好, 图 2 结果表明 s1-酪蛋白疏水性较差。 图 2 疏水性分析结果图 Fig. 2 Prediction of the hydrophobicity for s1-casein 4742 食品安全质量检测学报 第 7 卷 3.5 跨膜区域预测 蛋白质序列中跨越细胞膜的区域, 通常为-螺旋结构, 约 2025 个氨基酸残基。构成它的蛋白质的氨基酸大部分 是疏水性氨基酸。采用两种方法预测 s1-酪蛋白是否存在 跨膜区域, 两种方法均预测该蛋白不存在跨膜区域, 这与 该蛋白预测疏水性差的结果一致。EMBnet 预测跨膜区域 结果如图 3 所示, 得分为正值的氨基酸序列为蛋白的跨膜 区域, s1-酪蛋白的氨基酸序列得分基本为负值, 不存在跨 膜区域。TMHMM 预测 s1-酪蛋白跨膜区域结果如图 4 所 示, 214 个氨基酸全部位于膜外, 不存在跨膜区域。这两种 方法预测的结果一致。 图 3 EMBnet 预测跨膜区域结果图 Fig. 3 Prediction of the transmembrance domains for s1-casein by EMBnet 图 4 TMHMM 预测跨膜区域结果图 Fig. 4 Prediction of the transmembrance domains for s1-casein by TMHMM 3.6 活性位点预测 采用 Scanprosite 方法分析 s1-酪蛋白的活性位点, 预 测有 3 个糖基化位点分别为 2530、6065、202207, 5 个 酪蛋白激酶磷酸化位点分别为 6366、8184、8285、 137140、193196, 3 个蛋白激酶 C 磷酸化位点分别为 103105、137139、206208。 3.7 二级结构预测 采用 SOPMA 和 PORTER 两种方法对 s1-酪蛋白的二 级结构进行预测, 并将预测所得结果进行比较, 结果如表 1 所示。 SOPMA 预测 螺旋的相对含量最高, 达到 49.07%, 无规则卷曲的相对含量为 35.98%, 这两种结构的相对含量 超过 85%。 3.8 三级结构预测 Phyre2 预测该蛋白的三级结构含有 8 个螺旋结构, 这 8 个螺旋结构通过无规卷曲连接。 三级结构预测结果中的 螺旋与无规卷曲的相对含量与二级结构预测的结果吻合。 结果如图 5 所示。 表 1 SOPMA、PORTER 预测 s1-酪蛋白二级结构 Table 1 Prediction of the secondary structures for s1-casein by SOPMA and PORTER 序列/方法 预测结果 序列 MKLLILTCLVAVALARPKQPIKHQGLPQGVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSTDIGSE SOPMA hhhhhhhhhhhhhhcccccccccccccthhhhhhhhhheecccchhhhhhhhhhhhhccccc PORTER chhhhhhhhhhhhhhcccccccccchhhhhhhhhhhhhcccccchhhhhhhhhhhhhhcccc 序列 STEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPISVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYNVPQL SOPMA cchhhhhhhhhhhhhhhhccchheeeeehhttccccccccthhhhhhhhhhhhhttccccch PORTER chhhhhhhhhhhhhhccccccccccccchhhhccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhchhhh 序列 EIVPNLAEEQLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPQLFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGT SOPMA Eechhhhhhhhhhhhhhhhhttcccceecchhhhhhhhhhhhhhhhhtcccttceeeeeccc PORTER hhcchhhhhhhhhhhcccchhcccccccchhhhhhhhcccchhhhccccccccccccccccc 序列 QYPDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPLW SOPMA Ccttccccccccccccccccccccceee PORTER Cccccccccccccccccccccccceccc 注: C、H、E 和 T 是指随机螺旋、 螺旋、卷曲和 折叠。 C, H, E and T refer to random coil, alphahelix, extended strand and beta turn respectively. 第 12 期 范安妮, 等: 牛奶中主要过敏原 s1-酪蛋白的生物信息学分析 4743 图 5 Phyre2 预测三级结构结果图 Fig. 5 Prediction of the tertiary structure for s1-casein by Phyre2 3.9 B 细胞表位预测 表位是蛋白质抗原性的基础, 确定B细胞表位对于建 立检测致敏蛋白具有重要的指导作用14,15。IEDB 数据库 预测 s1-酪蛋白的抗原区分别为氨基酸的 1629、4550、 5254、5670、7475、7786、94104、142152、173179 和 185210 位点。结果如图 6 所示, 该方法结合隐马尔科 夫模型和亲水性参数评分预测线性 B 细胞表位, 得分越高 表示这些部位是抗原区的可能性越大。 图 6 IEDB 预测 B 细胞表位结果图 Fig. 6 Prediction of the linear epitope for s1-casein by IEDB 4 结 论 通过对牛奶主要过敏原 s1-酪蛋白已知蛋白序列进行 理化性质、信号肽、疏水性、跨膜区、活性位点进行预测 分析, 建立二级结构模型, 计算得到各种结构组成的相对 含量, 发现 螺旋和无规则卷曲占据 85%以上。三级结构 模型发现含有 8 个螺旋并且由无规则卷曲相连, 同时预测 到 s1-酪蛋白的 B 细胞表位。本研究运用生物信息学方法 预测得到的结构信息及 B 细胞表位信息, 为牛奶过敏原酪 蛋白的致敏机制研究及检测方法建立提供了信息基础。 参考文献 1 Wal JM. 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