提取质粒实验报告

1 / 19 提取质粒实验报告 1实验目的： 通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒； 通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术； 2实验材料及用品 实验仪器： 恒温培养箱、恒温摇床、高速离心机、漩涡振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、微量加样器、烧杯、量筒 、 玻璃棒、 微波炉、 天平、电泳梳子、电泳槽 、 电泳器 、 紫外灯 3）、材料与试剂： 溶液 I： 50mmol/L 葡萄糖； 25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷Tris-HCl； 10mmol/L 乙二胺四乙酸 溶液 I 可成批配制，每瓶约 100ml， 10 磅高压蒸气灭菌 15分钟，贮存于 4。 溶液：新鲜配制，等体积混合 /L NaOH； 1% SDS 注意： SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 溶液 III TE 液缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl； 1 mmol/L 2 / 19 EDTA 70% 乙醇； 平衡酚：氯仿 1： 1： 将量取 25 ml Tris-HCl平衡苯酚，加入 24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中， 4保存。 LB培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 15g pH 琼脂糖； 1 liter5 TBE备用溶液： 54g tris base， 硼酸， 20ml mol/L EDTA , pH ； 6凝胶加样缓冲液： % 溴酚蓝， 40% 蔗糖； 另外还有的试剂是：胰 RNA 酶、 DNA Marker、硼酸、Gelview试剂 实验材料：含有 pUC19质粒的大肠杆菌等。 3实验原理： 1）质粒 DNA的提取： 关于质粒： 3 / 19 质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外呈游离状态的双链、闭环的 DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立 自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。 一般分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个步骤： 培养细菌，使质粒 DNA大量扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒 DNA。 分离制备质粒 DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、 SDS 法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。 碱裂解法提取大肠杆菌质粒 DNA的原理： 碱裂解法提取质粒 DNA是根据共价闭合环状质粒 DNA和线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒 DNA。 在 pH 值介于 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时，4 / 19 共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体 DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构 。而复性的质粒 DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA，蛋白质 -SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒 DNA。 2）质粒 DNA的琼脂糖凝胶电泳： 关于电泳技术： 电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子 尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。 琼脂糖是 一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离 200 到 50,000 bp 大小的 DNA 片断。一般琼脂糖胶浓度在到 4之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的 DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的 DNA 片断。 琼脂糖凝胶电泳条带的观察： 5 / 19 通过观察示踪染料的迁移距离可以判断 DNA 的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与 300 和4000bp 大小的双链 DNA片断相同。当 迁移足够距离后，就可以通过 Gelview 染色来观察 DNA 片断。 Gelview 是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳 时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的 Gelview 溶液中进行染色 。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的 DNA或 RNA 进行观察。 质粒 DNA的琼脂糖凝胶电泳分离： DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应， DNA分子在高于等电点的 pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的 DNA 分子泳动速率不一样，可以进行分离。 未切割的质粒 DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒 DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒 DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在： 超螺旋 DNA： 6 / 19 尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞 内 DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。 线性 DNA： 当 DNA 损伤在 DNA 双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒 DNA，这种 DNA 的泳动速率介于超螺旋与切口质粒 DNA之间。 开环 DNA： 在质粒 DNA 复制过程中，拓扑异构酶 I 会在 DNA 双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。 这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。 4实验方法步骤及注意事项 1）实验方法步骤 第一部分：质粒 DNA的提取及酶切 取 ml含 pUC19这里的大肠杆菌培养物于 ml微量离心管中， 4 000 r/min 离心 2 分钟，吸去上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥； 加 100 ml 溶液悬浮细菌沉淀，充分混和均匀，室温放置 10 min； 7 / 19 加 200 ml 溶液 ，盖紧管口，轻缓上下 4-6 次颠倒离心管以混合内容 物。将离心管静置冰上 5 min； 加 200 ml 溶液 ，盖紧离心管口后上下轻缓颠倒4-6 次，置冰上 15 min ； 12 000 rpm 离心 15 min，转移上清液至另一离心管； 向上清液中加入等体积的酚：氯仿，反复混匀， 12 000 rpm离心 5min，取上清液移至另一离心管中； 加 2 倍体积无水乙醇，振荡混匀，静置 10 min， 12000 rpm 离心 5 10 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。 加 200 ml 70乙醇洗涤沉淀物， 12000 rpm 离心 2 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干。 沉淀加 20 l TE, 反复吹打使质粒 DNA 充分溶解， 20保存。 第二部分：质粒 DNA的琼脂糖凝胶电泳 . 凝胶的制备 制备 1琼脂糖凝胶： 称取琼脂糖，放人锥形瓶中，加入 50mL的 TBE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为琼脂糖凝胶液； ； 待胶凝固后，轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内； 8 / 19 加入 电泳缓冲液： 用移液枪缓慢将 DNA 样品及其经过酶切的质粒 DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方，各加样量如下： DNA samples ： 15 l酶切的 DNA 样品： 3 l Loading buffer： 2 l DNA markers ： 6 l . 电泳： 接通电泳槽与电泳仪的电源。保持电压 120V； 当溴酚蓝染料移动到凝胶总长度一半处时，停止电泳； . Gel Interpretation ： 将电泳后的 凝胶放在紫外灯的照射下进行 DNA 电泳条带的观察，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。 2）注意事项 加溶液 I 后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒 DNA提取的首要关键； TAE 和 TBE 均为常用的缓冲液。 TBE 比 TAE 有相对高的缓冲能力。 加样染料溴酚蓝可与长度约为 kb 的 DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。 DNA的迁移速率取决于以下因素 : DNA 的分子大小 分子量越小，迁移越快。 琼脂糖浓度 浓度越 低，迁移越快。 DNA的构象 环状的或带切口环状的 DNA通常比线9 / 19 状的 DNA 迁移要快。 两个电极之间单位厘米的电压 电压越高，迁移越快。 如果 DNA 条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起： DNA 过载电压过高加样孔破损 凝胶中有气泡 在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用； 二实验内容 1 实验现象与结果： 将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶 电泳成像系统进行拍照得到的 DNA电泳条带图如下所示意： 图注： x：代表经过酶切的质粒 DNA样品的电泳条带； x ：代表未经过酶切的质粒 DNA 样品的电泳条带； marker:DNA 相对分子质量标准物。 pUC19 质粒 DNA标准参照条带图像： 2 对实验现象、实验结果的分析及其结论： 对实验现象的分析及其结论：从上述所示的 DNA 电泳条带图可以看出： 10 / 19 不管在 DNA Sample 中还是在经过酶切处理后的 DNA样品中均具有电泳 迁移速率处于中间的线性质粒 DNA。而在此次试验中出现线性质粒 DNA是因为 pUc质粒 DNA在提取的过程中 DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。 这说明质粒制备过程个出现线性 DNA 说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。可能在其中混有少量的蛋白质，或者在实验的提取过程中加入溶液所经历的时间过长，在碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。 但是其中各组也存在超螺旋 DNA。标号为 1、 2 和 3组的电泳条带存在开环质粒 DNA，而且只出现在未经过酶切的质粒 DNA Sample 中， 这说明在此次实验过程中酶切是彻底的。 从总体上观察，所有电泳条带的亮度并不高，可能是提取的质粒 DNA 量较少或电泳前加样量过少所致。 5作业 1.简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因 ? 溶液的作用：悬浮大肠杆菌菌体，而且加溶液 I后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒 DNA提取的首要关键。且其中含有的溶霉菌可以水解菌体细胞壁的 主要化学成分肽聚糖中的 -1,4 糖苷键，因而11 / 19 具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。 EDTA 是 Ca2+ 和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液 I 中加入 EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制 DNase 对 DNA 的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 溶液的作用： 提供碱性条件，在 NaOH与 SDS的共同作用下使大肠杆菌瞬间裂解，并变性核 DNA。当细胞悬浮于 NaOH和十二烷基酸钠溶液中使，在高 pH 的作用下细胞发生裂解，此外蛋白质和染色体 DNA 发生变性与细胞碎片一起沉淀下来。这是由于细胞膜发生了从 bilayer 结构向 micelle 结构的相变化。新配制的溶液避免作为最佳溶解细胞的试剂 NaOH接触空气中的 CO2 过久而减弱了碱性。用不新鲜的 M NaOH，即便有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌。因此必须使用新鲜的 M NaOH 试剂进行配制。 溶液的作用： 该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基硫酸钠发生反应形成十二烷基 硫酸钾，从而将与之结 质粒 DNA的提取、定量、酶切与 PCR鉴定 一、实验目的 12 / 19 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握 PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 在 DN A 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以 特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外复制 DNA，使目的 DNA 按 2n方 式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A.变性：加热反应系统至 95，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板 DNA互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反应温度升至中温 72，在 Taq酶作用下，以 dNTP为原料，引物为复 制起点，模板 DNA 的一条单链在解链 和退火之后延13 / 19 伸为一条双链。 2.质粒 DNA的提取与制备 .碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体 DNA和质粒 DNA均变性； B.当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA复性并保存在溶液中，染 色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 .离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低 pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液 中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高 pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量分析： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 : DNA分对波长 260nm的紫外光有特异的吸收峰 14 / 19 蛋白质对波长 280nm的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm的紫外光有特异的吸收峰 /A280 及 A260/A230 的比值可以反应 DNA的纯度； A260/A280= DNA 纯净 A260/A280 A260/A280 含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA的酶切鉴定： 限制性内切酶是 DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链 DNA。 5.琼 脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于 琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的 DNA，分子量大小 及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 . 15 / 19 三、材料与方法： 实验材料： 仪器： PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 材料：菌液【大肠杆菌 DH5a 菌株】、无菌去离子水、2 Premix Taq、引物 2. 质粒 DNA的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管 材料：溶液 P1、溶液 P2 、 EcoR I 5.琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料：电泳指示剂、 Gelview、 TBE、琼脂糖、 DNA Marker 5000、电泳缓冲液 实验方法 2. 质粒 DNA 的提取与制备 3. 质粒 DNA的定量 质粒 DNA抽提实验报告 一实验目的： 1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒 DNA 的方法，提16 / 19 取的质粒 DNA可直接用于酶切， PCR 扩增等。 2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测 DNA 的纯度，构型，含量和分子量大小。 二实验原理：碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体DNA与质粒 DN结果 A 的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 值高达的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性 。质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以的 NaAc高盐缓冲液去调节其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子 RNA、蛋白质 -SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三实验仪器及试剂： 管、高速离心机、移液枪 溶液 I： 50 mmol/L 葡萄糖、 10 mmol/L EDTA、 25 mmol/L Tris-HCl 2 毫克 /毫升 溶菌酶 溶液 II： 200 mmol/L NaOH、 1% SDS 溶液 III： 3 mol/L NaAc 溶液、 TE缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl、 pH mmol/L EDTA 四实验步骤 : 1、取细胞培养物于管中， 12000rpm/min 离心 1min，去上清液 2、加 200 l溶液重悬浮细胞 17 / 19 3、加 200 l溶液，轻轻摇匀，放置 5min 4、加 150 l 溶液，轻轻摇匀，冰浴 5min，12000rpm/min 离心 5min 5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀， 12000rpm/min 离心 10min 6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置 5min，12000rpm/min 离心 10min 7、 70%乙醇洗涤沉淀 2次，风干 8、加 20ddH2O 溶解沉淀， -20下保存备用 五实验结果：得到大肠杆菌质粒 DNA PCR以及电泳实验报告 一实验原理： PCR：该技术是在模板 DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于 DNA 聚