实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化实验报告.doc

实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期 2011年10月25号 实验地点 生化实验室合作者 指导老师总分 教师签名 批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适范围为.，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。一 实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化 AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。2、碱性磷酸酶的比活性测定 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mgpr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 在环境的温度、和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（）随底物浓度（）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示： 式中：Vmax为最大反应速度；S为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。 当=Vmax/2时，Km=S。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。 Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。 Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。二、实验材料（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定、样品兔肝、试剂 0.5mol/L乙酸镁溶液 0.1mol/L乙酸钠溶液 0.01mol/L乙酸镁0.01mol/L乙酸钠溶液 0.01mol/LTris0.01mol/L乙酸镁PH.缓冲液 丙酮（分析纯） 95%乙醇（分析纯） 正丁醇（分析纯） 0.04mol/L底物液 mg/ml分标准液 0.5mol/L 0.3% 4氨基安替比林 0.5%铁氰化钾 0.1mg/mL蛋白标准液 碱性铜试剂 酚试剂、仪器与器材 研钵 刻度离心管 刻度吸管 电动离心机 玻璃漏斗和玻璃棒 托盘天平 恒温水浴 可见分光光度计（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响、样品兔肝匀浆液、试剂 0.04mol/L底物液 0.1 mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37） 碱性溶液 0.5%铁氰化钾 0.3% 4氨基安替比林 酚标准液（0.1mg/ml）、仪器与器材 恒温水浴锅 可见光分光光度计三、实验步骤（一）AKP的提取AKP提取实验步骤步骤操作（） 匀浆2g新鲜兔肝剪碎，加入0.01mol/L乙酸镁0.01mol/L乙酸钠溶液6.0ml，研磨成匀浆。匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积，此为液吸取液0.1ml于另一试管中，加PH8.8Tris缓冲液4.9ml稀释，此为稀释液（1:50），供此比活性用（）除杂蛋白在液中加入正丁醇2.0ml，用玻璃棒充分搅拌2min，室温放置20min，用滤纸过滤（）丙酮沉淀AKP滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀离心（2000r/min）5min（）AKP溶解沉淀加入0.5mol/L乙酸镁4.0ml，用玻璃棒充分搅拌使其溶解，记录其体积，此为B液。取B液0.1ml于另一试管中，加入PH8.8Tris缓冲液4.9ml，此为稀释B液（1:50），供动力实验用(二) AKP的比活性测定1、AKP的活性测定AKP活性测定实验步骤步骤操作（1）加缓冲液取试管3支，按表操作试剂（ml）测定管标准管空白管PH8.8Tris缓冲液-1.00.04mol/L底物液1.01.01.0（2）温浴37水浴预温5min(3)加酶和底物0.1mol/ml标准酚应用液待测液-1.0-1.0-(4)酶促反应37准确保温15min(5)加显色液0.5mol/LNaOH1.01.01.00.3% 4氨基安替比林1.01.01.00.5%铁氰化钾2.02.02.0(6)显色反应混匀，室温放置10min(7)测吸光度510nm处测吸光度2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定实验步骤步骤操作（1）反应体系设置取3支试管，按表操作试剂测定管标准管空白管PH8.8Tris缓冲液-1.0待测酶液1.0-蛋白标准液（0.1mg/ml）-1.0-碱式铜试剂5.05.05.0（2）反应混匀后室温放置10min（3）加酚试剂酚试剂0.5ml（4）显色反应混匀后室温放置30min（5）比色反应在510nm处比色（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响1、底物浓度对酶促反应速度的影响将新鲜兔肝用PH10.0 0.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可酶曲线绘制步骤步骤操作(1)反应体系设置取6支试管标号，按表操作试剂（ml）1234560.01mol/l底物液0.010.200.300.501.00-PH10 0.1mol/L碳酸盐缓冲液0.070.700.700.700.700.70蒸馏水1.101.000.900.700.201.20(2)保温37水浴中保温5min(3)加酶各管分别加入兔肝稀释匀浆液0.10ml（4）酶促反应混匀，立即记录时间，将各管准确保温15min（5）终止反应各管分别加入碱性溶液1.0ml（6）加显色剂各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0ml各管分别加入0.5%铁氰化钾2.0ml（7）显色充分混匀，放置15min（8）比色测定以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定（9）反应速度计算根据酚标准曲线计算出每样品酚的含量，算出反应速度（10）曲线绘制以各管底物浓度的倒数（1/|S）为横坐标，以各管反应速度的倒数（1/V）为纵坐标，作图求出Km值2、酚标准曲线的绘制的绘制酚标准曲线的绘制的绘制步骤步骤操作（1）反应体系设置取洁净干燥试管6支，依次加入试剂试剂（ml）1234560.1mol/ml酚标准溶液-0.050.100.200.300.40蒸馏水2.01.951.901.801.701.60（2）预加热37水浴中保温5min（3）加显色剂碱性溶液1.01.01.01.01.01.00.3% 4氨基安替比林1.01.01.01.01.01.00.5%铁氰化钾2.02.02.02.02.02.0（4）显色反应混匀后，室温放置15min（5）比色测定510nm波长处比色（6）曲线绘制以酚含量（微克）为横坐标，吸光值为纵坐