改进尼氏染色法.doc

作业二4. 目前各种技术资料上登载的各种硫堇染色法，均存在标本染色逐渐消退的问题。请设计合理的方法，使硫堇着染的神经细胞（尼氏染色）不褪色。一、 尼氏染色原理：神经元细胞体包括一个具有皱褶核膜的大细胞核、稀疏的染色质和一个明显的核仁。在细胞体中细胞质是尼氏颗粒，即能够代表粗面内质网并在很多神经元中产生特异的斑点状嗜碱性表现的嗜碱性颗粒。尼氏颗粒可以用很多染色来显示如中性红、亚甲基蓝、甲苯胺蓝和甲基紫等。染色的变异、pH和分化的时间使一些染色既可以仅突出尼氏物质，也可以显示神经元的细胞核和神经胶质。各种神经细胞内都含有尼氏体，但其形状、数量、分布位置常常不同，形状有大有小，如三角形，有的为椭圆形。尼氏体主要分布于神经细胞的浆中，也存在于树突中，但不在于轴突和包体的轴丘。尼氏体会因为生理状态的变化而变化，尼氏体是神经元内合成蛋白质合成的重要部位，当神经元受到刺激后，包体内的尼氏体会明显减少。通常尼氏能被碱性染料如硫堇、亚甲蓝、甲苯胺蓝和焦油紫等染料染成紫蓝色。二、 一般步骤：1. 样品处理 a) 对于石蜡切片： 二甲苯中脱蜡5-10分钟，共三次。注：脱蜡不充分会导致染色不均匀。 无水乙醇5分钟。 90%乙醇2分钟。 70%乙醇2分钟。 蒸馏水2分钟2. 尼氏(Nissl)染色 对于上述处理好的样品： 尼氏(Nissl)染色液染色染色3-10分钟(可以根据染色结果和要求调整时间，染色时温度提高到37-50对于25-50微米等较厚的切片可以使染色更均匀）。 蒸馏水洗涤2次(每次数秒钟即可)。 95%乙醇约5秒。 此时，如果需要直接观察，可以用70%乙醇洗涤2次。如需脱水、透明后封片按后续步骤进行，70%乙醇洗涤后仍可按照后续步骤进行脱水、透明和封片处理。 注：如果用于免疫组化等染色后的复染，可以参考上述步骤在其它染色完成后直接进行尼氏(Nissl)染色。3. 脱水、透明、封片或进行其它染色 a) 脱水、透明、封片： 95%乙醇脱水2分钟。 换用新鲜的95%乙醇再脱水2分钟。 二甲苯透明5分钟。 换用新鲜的二甲苯，再透明5分钟。 用中性树胶或其它封片剂封片。 显微镜下观察，细胞呈现斑驳的蓝紫色染色。 b) 进行其它染色： 如果进行免疫荧光染色，或进行Hoechst等荧光染料的染色，在Nissl染色液染色后： 70乙醇洗涤2次，每次2分钟。 PBS或生理盐水或TBS或TBST等用于免疫染色或荧光染料染色的溶液浸泡5分钟。 然后就可以进行免疫荧光染色或其它荧光染料的染色了。三、 举例如使用焦油紫染染色：焦油紫染液的配制：焦油紫/0.1g蒸馏水/99ml1%冰醋酸1ml实验步骤：冰冻切片氯仿中1分钟；无水酒精中1分钟；95%酒精、70%酒精各1分钟，蒸馏水洗片刻；进入焦油紫染液染色30分钟（37度温箱中染色10分钟），蒸馏水洗涤；95%酒精分色；常规脱水、透明、封片。四、 其他方法：冰冻切片后37烘1小时，PBS洗2次。染色剂3000rpm.离心10分钟。染后的酒精脱水：把百分之95的直接滴在片上，2分钟后用二甲苯滴在切片上，透明5分钟，待二甲苯干后再用树脂封片五、 分析：褪色原因：1. 封固剂的酸化问题:干性封固剂是最常用的封固剂,主要 是加拿大胶和中性树胶,但这两种封固剂均采用二甲苯作为溶剂。因日久二甲苯往往被逐渐氧化,生成苯甲酸和邻苯二甲酸而呈酸性,可导致碱性染料褪色。 2. 切片标本染色的过程中,脱水不净。3. 载玻片和盖玻片处理不当,不呈中性。 4. 在潮湿多雨时封固切片,湿气易浸人,导致切片褪色。六、 解决方法1. 在封固切片前, 于树胶瓶内加少量大理石或少量无水碳酸钠 ,放人 低温干操箱内, 不时予以搅拌。数日后待其自然澄清, 取上清液备用。封固剂及切片不可放在阳光下照射,以免氧化变酸 。2. 切片染色过程中,脱水时间要充足,特别是无水乙醇1、2,必须各用10分钟。如果无水乙醇含水(因反复使用),必须及时更换。3. 洗涤新载片和盖片时,先用洗液浸泡数小时或过夜,然后自来水冲洗24小时。水洗时注意分开每一载片和盖片,使之每一面的洗液被彻底洗净。再用燕馏水洗3次并于蒸馏水中浸泡数小时,捞出凉千后浸入95%乙醇中,数小时后取出凉干或用绸布擦干备用。洗涤旧载片时,先用肥皂水煮沸约30一40分钟,去掉盖片,趁水尚温热时,用毛刷洗掉载片上的残留物(如有钙化变白的载片则弃去不用)。流水冲洗干净,再