大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化

.广东石油化工学院实 验 报 告生物技术系专 业 生物技术 班 别 学号 姓 名 同组人 实验课程 大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化 实验日期 2011-6-13至2011-6-21 成 绩 大蒜中超氧化物歧化酶提取与纯化一、实验目的：1.学习并掌握大蒜SOD提取与纯化的方法及原理。2.学习并掌握DEAE-纤维素离子交换层析分离纯化蛋白质的操作方法。3.学习并掌握SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的方法。4.学习并掌握邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活的方法。5.熟悉考马斯亮蓝测定蛋白含量的实验原理和方法。二、实验原理：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD5)广泛存在于动植物及微生物体内，可催化细胞内超氧负离子( O2-) 的歧化反应，使 O2-转化为 H2O2 和 O2。因此，SOD是一种具有抗脂质氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶及功能性酶，在医药、食品、化妆品等领域有着广阔的应用前景。SOD是一种亲水性的酸性酶蛋白，在酶分子上共价连结金属辅基，按照其结合的金属离子，主要可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3种。Cu/Zn-SOD是分布最广而且是最重要的SOD，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量约为32KD，一般由两个亚基组成。SOD对热、pH以及某些理化性质有很强的稳定性，即使温度达到60，经短时处理酶活几乎无损失；同时，酶活性不受乙醇和氯仿影响，但Cu/Zn-SOD对氰化物及过氧化氢均敏感。SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。Cu/Zn-SOD由于色氨酸含量低，其最大紫外吸收为258nm，由于含铜，所以在可见光680nm处有最大吸收。国内测定SOD活力一般采用邻苯三酚自氧化法或改良的邻苯三酚自氧化法。在碱性条件下，邻苯三酚会迅速自养化生成有色中间产物，同时生成超氧负离子（O2-）。中间产物在325 nm 和420nm 波长处均有强烈的光吸收。邻苯三酚的自氧化速率与O2-的浓度有关。当有SOD存在时，由于它可催化超氧负离子(O2-) 的歧化反应，生成氧和过氧化氢：，从而抑制邻苯三酚的自氧化，阻止了中间产物的积累。因此，可通过监测 SOD 对这个反应的抑制程度间接测定 SOD 活力。大蒜中的SOD正属于Cu/Zn-SOD。三、实验材料实验材料：大蒜四、实验操作步骤1、粗酶液制备与沉淀分离试剂和器材：(1)材料市售新鲜大蒜.(2)仪器恒温水浴 、离心机、 布氏漏斗、抽滤瓶 烧杯、量筒、搅棒、 透析袋 、搅拌机(3)试剂-18预冷的丙酮、磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）方法和步骤1、将蒜瓣去外膜,于搅拌机中搅拌10min后移至研钵中研磨至蒜泥状2、SOD粗提取方法磷酸缓冲液法：加入3倍体积(mL/mg)的磷酸缓冲液,浸泡3045min后用6层纱布抽滤.将滤渣再用2倍磷酸缓冲液浸泡30min后, 6层纱布抽滤.如此反复共3次,收集3次抽滤所得滤液,测酶活力.热变性法：将大蒜中SOD酶液于60热处理20min, 8 500r/min离心10min,弃沉淀,测定上清液酶活力.3、SOD纯化沉淀分离方法丙酮沉淀：将酶液置于冰浴中,加入等体积经-18预冷的丙酮,搅拌15min,于4 500r/min离心15min,弃上清液,用50mmol/L磷酸缓冲液溶解其沉淀后,透析磷酸缓冲液, 4 500r/min离心10min,测定上清液的SOD酶活力。2.离子交换层析纯化超氧化物歧化酶原理 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合能力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，以液体为流动相。离子交换剂由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。结合力的大小通常由离子交换剂的选择性来衡量。本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质，在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白，进而除去杂蛋白，实验中选用DEAE离子交换纤维素。 试剂和仪器 （1）试剂 DEAE 缓冲液：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） 缓冲液：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） 0.5mol/L HCl .5mol/L NaOH 馏水 （2）仪器与材料 层析柱(1.5cm 20cm) 部分收集器 梯度洗脱仪 紫外分光光度计 试管、烧杯、透析袋、量筒 砂芯漏斗抽滤瓶 电磁搅拌器 贮存器 混合器方法和步骤1、DEAE-纤维素的预处理： （1）称取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯中，室温放置30min，不时轻轻搅拌。 （2）将糊状物移入3号砂芯漏斗中，用蒸馏水淋洗。如此重复，每加一次去离子水，浸泡一段时间，再进行抽滤，至洗涤液pH等于4即可（pH试纸试）。 （3）将糊状物移入烧杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不时轻轻搅拌，弃去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次。 （4）将交换剂移入3号砂芯漏斗中，反复用去离子水淋洗，直至洗涤液pH为8.0（可用pH试纸测试）。 （5）将DEAE-纤维素浸泡在150mL去离子水中。用0.5mol/L 盐酸把pH调至7.6，滴定可在pH计上进行，须使悬液最终pH在10min内无变化，然后抽滤。 （6）将上述滤块置于100毫升量筒中，加入75mL缓冲液I，慢慢搅混之后，静置20min，用倾斜法除去上清液中细微粒子，如此重复若干次，最后上清液pH与缓冲液I几乎一致。 2、装柱 （1）层析柱用洗涤液洗清洁，柱的下端联接塑料管，装上螺旋夹。关上螺旋夹，柱内装入缓冲液I，微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出，赶走死区及塑料管中的气泡，柱中保留少量缓冲液，关闭螺旋夹。 （2）将基本平衡好的DEAE-纤维素浆液（约有1倍体积的缓冲液I）放在抽滤瓶中减压除尽气泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高约1cm高度时，部分旋松螺旋夹，让溶液缓慢流出去，注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢，陆续加入较多的浆液，直至达到高10cm以上的柱床体积。 3、平衡 当全部交换剂装入柱中后，用上柱起始缓冲液进行平衡。流速可维持在4mL/15min，直至流出液的pH与上柱缓冲液完全相同。（一般要平衡8h以上或过夜。） 4、层析 用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体，打开出口使缓冲液恰流到表面，关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD粗酶液，打开出口，使样品溶液进入纤维素内，至几乎露出床面时，柱壁用少量缓冲液小心洗涤23次，然后装入缓冲液，使液面高出创面23cm左右。 5、洗脱 （1）按图将梯度洗脱器和层析柱连接好。 （2）在洗脱瓶A（贮存器）和洗脱瓶B（混合器）内各装入100mL缓冲液和缓冲液，注意两洗脱瓶，特别是液面应处于同一水平面，同时应排除连接管内气泡。 （3）开动电磁搅拌器开关，调节搅拌速度，以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。 （4）将两瓶和柱上下连接管道打开，开始收集洗脱流出液，控制流速在1.5mLmin。 收集液测定蛋白质浓度和酶活性。 （5）收集合并具有SOD活性部分的洗脱液，透析浓缩后冷冻干燥即得纯化SOD（淡蓝绿色产品）。 3.SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测蛋白质的相对分子量原理SDS-PAGE电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，是蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子的大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量。X为迁移率，k,b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。材料和试剂（1）材料低分子量标准蛋白试剂盒 兔磷酸化酶BMW=97400牛血清白蛋白MW=66200 兔肌动蛋白MW=43000牛碳酸酐酶MW=31000 胰蛋白酶抑制剂MW=20100鸡蛋清溶菌酶MW=14400样品：称3mg样品，加2ml蒸馏水溶解测试样品血清蛋白、脱盐后的IgG、纯化后的IgG。（2）试剂30%丙烯酰胺(Acr)凝胶贮备液：称Acr30克，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于dH2O中，最后定容至100ml，过滤后置棕色瓶中，4贮存可用12月。 10%SDS溶液（十二烷基硫酸钠）：将10gSDS溶于80ml的水中并轻轻搅拌（室温时需水浴加热溶解），再定容至100ml，室温存放。 SDS-分离胶贮液1.5mol/LpH8.8Tris-HCl：称取Tris18.2g，用60mldH2O溶解，用1mol/L盐酸调至pH8.8，最后用dH2O定容至100ml，4保存。（或直接用Tris-HCl配制）。 SDS-浓缩胶贮液0.5mol/LTris-HCl（pH6.8）：称取Tris6g，加入60ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml，4保存。 10%（w/v）过硫酸铵（AP）：称过硫酸铵（AP）0.1g，加dH2O1.0ml，最好临用前配制。 四甲基乙二胺(TEMED)。 样品缓冲液：H2O（4ml）+10%SDS（1.6ml）+巯基乙醇（0.4ml）+0.1%溴酚蓝（0.2ml）+甘油（0.8ml）+0.5mol/LpH6.8Tris-HCl（1ml），混匀。4保存。 SDS-PAGE固定液取50%甲醇454ml，冰醋酸45ml混匀。 染色液：称取考马斯亮蓝R-2500.125g，加上上述固定液250ml，Whatman1号滤纸过滤。4保存。 脱色液：冰醋酸100ml，甲醇250ml，加蒸馏水定容至1000ml。 pH8.3电泳缓冲液(内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-HCl0.384mol/L甘氨酸缓冲液)：称Tirs6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml，于4保存。（3）仪器 垂直板电泳装置 电泳仪 移液管方法和步骤1、配胶按下表分别配制分离胶和浓缩胶液。 凝胶浓度 试剂 分离胶（10%T）分离胶（12%T）浓缩胶（4%T）H2O（ml）8.036.683.0 Buffer（ml）5.0（pH8.8）5.0（pH8.8）1.25（pH6.8）10%SDS（l）2002005030%Acr（ml）6.668.0 0.67室温脱气10min10%AP（l）10010025TEMED（l）20205总体积（ml）20205注：T为Acr和bis总浓度；分离胶根据分离样品选择浓度，各组分须在制胶板时才能混合。2、安装垂直板电泳槽将对应的两块玻璃板用蒸馏水洗净晾干，准备2个干净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好（长板向外，封上硅胶条）。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。3、制备凝胶板混合分离各组分，用移液管快速加入分离胶，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置40min,使溶液聚合。（ 注：注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封得目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气，凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。）倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩液，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置40min.注：样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。在上槽内加入缓冲液后，拔出样梳。 注：要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加速效果。4、加样（1）取10ul标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10ul2倍样品缓冲液，上样量为10ul(2） 取10ul样品溶液，再加入10ul2倍样品缓冲液，上样量分别为5ul和3ul(3) 用微量注射器距样品槽底三分之一处进样，每槽一个样品，标样在中间槽。加样前，样品在沸水中加热3min，去掉亚稳态聚合。注：注射器不可以过低，以防刺破胶体，也不可以过高，在样品下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样5、电泳电泳槽中加入缓冲液，正负极分别与电泳仪的正负极连接，接通电源，进行电泳，开始电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA溴酚蓝距凝胶边缘约1cm时，停止电泳，约需4个小时。6、凝胶板剥离与染色电泳结束后，取下凝胶，卸下凝胶模上的橡胶框，用镊子将短玻璃棒撬开后，取出凝胶板。将凝胶板做好标记后放在大培养皿中，加入染色液，染色30min左右。注意：剥胶的时候，要小心，保持胶完好无损，染色要充分7、脱色:染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带明显8、观察测量：用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离4.SOD活性测定（邻苯三酚法）原理:在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，并产生02-，在SOD存在下，自氧化反应受到抑制。试剂和器材（1）试剂 50mmol/L pH=8.3的磷酸缓冲液 10mmol/L 的EDTA邻苯三酚 10mmol/L HCl（2）器材 试管 水浴锅 分光光度计邻苯三酚自氧化速率为 325 nm, 0.070D /min左右 ,以 1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到 50%的酶量作为一个酶活力单位 (U)。方法和步骤1、邻苯三酚自氧化速率的测定取两支试管按下表加入25预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔1 min读取A 值,连续读取4 min ,取平均值。通过微调连苯三酚的加入量控制自氧化速率在每分钟0.070 0.002。（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。试剂空白管（mL）自氧化管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.02050 mmol/L邻苯三酚-0.022、SOD样液的活性测定样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。试剂空白管（mL）样品管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.02-SOD样液-0.0150 mmol/L邻苯三酚-0.013、计算5.考马斯蓝G-250测SOD含量原理考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。以牛血清白蛋白为标准蛋白 ,按考马斯亮蓝染色法(Bradford法) 测定样品的蛋白含量。考马斯蓝G-250测蛋白含量： 3ml 考马斯蓝加入适量的样品摇匀，2 min 后在595 nm测吸光值，并用牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 ml）制标准曲线。SOD比活力(units/mgPr)=总活力（units）/总蛋白量（mg）。通过测定标准蛋白系列浓度吸光度绘制标准曲线，同时测定从样品中沉淀出蛋白的吸光度值，并根据标准曲线线性回归方程读取制备样品的蛋白浓度c。蛋白含量(mg/g)=(cv)/m式中，c:根据标准曲线的线性回归方程读取制备样品的蛋白浓度，mg/mL；v:制备样品的蛋白的体积，mL；m:样品质量，g 。试剂和器材 （1） 试剂 牛血清蛋白 95%乙醇 85%磷酸牛血清蛋白标准溶液：称取100mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中即为1mg/ml的原液。染色液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，加入85%(W/V)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液在常温下课放置一个月。未知浓度蛋白：浓度控制在130mg/ml。（2）仪器与材料可见分光光度计 试管 方法和步骤（1）标准曲线制作：分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。蛋白质标准曲线测定加样试剂空白12345100ug/ml牛血清清蛋白/ml1.00.10.20.40.60.8去离子水/ml00.90.80.60.40.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.05.05.05.05.05.0吸光值A595（2）蛋白样品 配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。4数据处理4.1 考马斯蓝G-250测SOD含量蛋白质标准曲线测定加样：试剂空白123456500ug/ml牛血清清蛋白/ml00.10.20.40.60.81蒸馏水/ml10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250试剂/ml3333333蛋白质含量（ug/ml）012.5255075100125吸光值A59500.0710.1850.3240.4380.5630.654将未知蛋白的A595值代入方程y=0.0053x+0.0277求得：试剂粗酶液AB0.2B0.4B0.6B0.8B1未知蛋白/ml0.20.20.20.20.20.20.2吸光值A5950.5780.0590.1530.1030.1580.2570.214蛋白质含量（ug/ml）103.835.9023.6414.2124.5843.2635.15（1）待测液蛋白质含量由公式：待测液蛋白质含量（ug/ml）=标准曲线差得 X 稀释倍数得粗酶液蛋白含量=103.85(40.2)=2077ug/m提取液A蛋白含量=5.90(40.2)=118 ug/m提取液B0.2蛋白含量=23.64(40.2)=472.8 ug/m提取液B0.4蛋白含量=(40.2)=284.2 ug/m提取液B0.6蛋白含量=(40.2)=491.6 ug/m提取液B0.8蛋白含量=(40.2)=865.2 ug/m提取液B1蛋白含量=(40.2)=703 ug/m（2）提取液B0.8蛋白含量SOD酶产率=待测*总体积*100 大蒜*106=（865.2*8*100）/（50*106）=0.138 ug/m4.2邻苯三酚（1）SOD活力的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：SOD活力（U/ml）=M式中，A0：为邻苯三酚自氧化率： AM：加酶后邻苯三酚自氧化率； V总：反应总体积； V样：加入样品液的体积； V定义：活性单位定义体积1 ml； M：样品稀释倍数。 样品SOD比活力(U/mg)=单位体积活力(U/ml )/C式中，C：每ml样品液蛋白质含量(mg)。SOD总活性(U)=单位活性酶原液总体积。 时间 A4200306090120150180210240自氧化0.0260.0650.0970.1110.1300.1450.1550.1640.172粗酶0.0250.0590.0870.1080.1260.1380.1480.1560.162B0.80.0350.0610.0880.1090.1260.1400.1500.1590.166A0=(0.172-0.026) 4=0.0365A粗酶=（0.162-0.025）4=0.0343AB0.8（0.166-0.035）4=0.0327粗酶液SOD活力（U/ml）= M = =301.37 U/ml提取液B0.8粗酶液SOD活力（U/ml）= M = =520.58 U/ml 可得：粗酶液SOD比活力(U/mg)=单位体积活力(U/ml ) C=301.370.10338=2920 U/mg提取液B0.8SOD比活力(U/mg)=单位体积活力(U/ml ) C=520.580.04326=10380 U/mg粗酶液SOD总活性(U)=单位活性酶原液总体积=301.378=2410.96 U提取液B0.8SOD总活性(U)=单位活性酶原液总体积=520.588=4164.64 U回收率=4164.64/2410.96=173%(2)样品SOD比活力的计算 样品比活力（U/ug）=单位体积活力（U/ug）C式中 C：每ml样品液蛋白含量（ug）可得：粗酶液SOD比活力（U/ug）=301.37103.38=2.92U/ug提取液B0.8SOD比活力（U/ug）=520.5843.26=10.38U/ug纯化倍数=每步比活力/第一步一步比=10.382.92=3.554.3 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测SOD的相对分子量-电泳图。5、实验结果：酶液酶液总体积（ml）蛋白质（ug/ml）酶活性（U/ml）总活性（U）比活性（U/ug）回收率（%）纯化倍数粗酶液82077301.172410.962.92-层析后B0.88865.2520.584146.6410.381733.556.结果分析6.1 考马斯亮蓝G-250染色法测定SOD含量由回归方程性相关系数值R=0.9881可知，回归方程性较好，本实验所得标准曲线数据合理，所测得的待测提取液蛋白含量均落在范围内，而且在所测得标准曲线数据之间，可见待测提取液蛋白含量数据可靠。