分子生物学基础知识.ppt

第一章分子生物学基础知识,一、核酸分子的基本组成,核苷酸,核苷,碱基,磷酸,戊糖,核糖,脱氧核糖,嘌呤,嘧啶,(一)碱基,1、特性：,共轭性分子结构，共轭双键，260nm处有最大吸收,嘌呤(purine),弱碱性，低PH值时可接受质子,嘧啶(pyrimidine),碱基间存在疏水堆积力,2、种类和结构：,嘌呤,腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),嘧啶,胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),(二)戊糖,（构成DNA）,2、脱氧核糖(deoxyribose),（构成RNA）,1、核糖(ribose),2OH亲水极性集团易水解易受攻击,RNA不稳定性,无2OH，DNA相对稳定,(三)核苷,(四)核苷酸,1、核苷酸核苷+磷酸磷酸酯键戊糖+碱基+磷酸,2、游离核苷酸,ADP,ATP,AMP,(五)核酸的一级结构,1、定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,2、核苷酸链的方向性：,PO4,OH,5端,3端,3、一级结构的表示方法结构式/线条式/字母式,磷酸基团,35磷酸二酯键,羟基,DNA一级结构的基本特点4种dNTP以3、5磷酸二酯键相连构成一个没有分枝的线性大分子。它们的两个末端分别称5末端（游离磷酸基）和3末端（游离羟基）。,思考题：ATGGTTAG的互补序列：A、TACCGAATCB、CTAAGCCATATGGTTAG的反向互补序列：A、CTAACCAT,(六)DNA与RNA在组成上的区别,二、DNA的空间结构,(一)DNA的二级结构双螺旋结构,1、特征反向平行的双螺旋反向平行配对规律疏水碱基平面处于内侧，亲水戊糖与磷酸骨架处于外测,右手螺旋,右手螺旋每周10个碱基，每对碱基36，碱基平面距离0.34nm存在大沟、小沟(大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。),稳定因素,横向：氢键纵向：碱基疏水堆积力,2、双螺旋结构的多样性,A,B,Z,Z-DNA是比较特殊的，它与其他DNA不同之处在于它是在减数第一次分裂前期中的偶线期产生的，约占DNA总量的0.3%。当一段Z-DNA形成时，其两端必为B-Z相互结合型态，形成与B-DNA的接口。Z-DNA能够与B-DNA构成相互结合型态，这种结构会使一对碱基突出于双螺旋之外。,A,B,Z,B-DNA,(二)DNA的三级结构超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,多级螺旋模型压缩倍数76405（8400）DNA核小体螺线管超螺线管染色单体2nm10nm30(10)nm400nm210m一级包装二级包装三级包装四级包装,三、DNA的功能,(一)DNA的基本功能:,以基因的形式荷载遗传信息，作为基因复制的模板，是生命遗传的物质基础。是转录的模板，是个体生命活动的信息基础。,(二)基本概念:,基因(gene)：携带遗传信息的一段特定的核苷酸序列，可自我复制并指导转录。基因组(genomic)：一个生物体所包含的全部遗传信息的总和，即全部DNA序列。遗传密码(geneticcode)：DNA碱基序列与蛋白质的氨基酸序列之间存在的对应关系。起始密码(ATG)AUG终止密码：UAAUAGUGA,四、RNA的结构,(一)RNA的结构特征:,组成：核糖碱基AUCG单链，局部形成双链。含稀有碱基较多DHU(二氢尿嘧啶)，T（假尿嘧啶），甲基化，甲羟化，乙酰化等,(二)RNA的种类:,1、参与基因表达的RNA,信使RNA（mRNA）：遗传信息的传递，翻译模板转运RNA（tRNA）：氨基酸载体核糖体RNA（rRNA）：提供蛋白质合成的场所,2、核不均一RNA（hnRNA）:mRNA的前体3、核内小RNA（snRNA）：参与hnRNA的剪接、转运4、核仁小RNA（snoRNA）：参与rRNA的加工修饰5、胞质小RNA（hnRNA）:运输新合成的Pr到高尔基体加工6、小片段干扰RNA（siRNA）：诱发外源mRNA的降解,(三)mRNA,含量最少种类繁多半衰期最短原核生物mRNA为多顺反子真核生物mRNA为单顺反子,1、mRNA的特征：,2、真核生物mRNA的帽子结构：,类型,m7G5ppp5Np(O型)m7G5ppp5NmpNp(I型)m7G5ppp5NmpNmpNp(II型),Humanwildp16mRNACtcctccgagcactcgctcacggcgtccccttgcctggaaagataccgcggtccctccagaggatttgagggacagggtcggagggggctcttccgccagcaccggaggaagaaagaggaggggctggctggtcaccagagggtggggcggaccgcgtgcgctcggcggctgcggagagggggagagcaggcagcgggcggcggggagcagcatggagccggcggcggggagcagcatggagccttcggctgactggctggccacggccgcggcccggggtcgggtagaggaggtgcgggcgctgctggaggcgggggcgctgcccaacgcaccgaatagttacggtcggaggccgatccaggtcatgatgatgggcagcgcccgagtggcggagctgctgctgctccacggcgcggagcccaactgcgccgaccccgccactctcacccgacccgtgcacgacgctgcccgggagggcttcctggacacgctggtggtgctgcaccgggccggggcgcggctggacgtgcgcgatgcctggggccgtctgcccgtggacctggctgaggagctgggccatcgcgatgtcgcacggtacctgcgcgcggctgcggggggcaccagaggcagtaaccatgcccgcatagatgccgcggaaggtccctcagacatccccgattgaaagaaccagagaggctctgagaaacctcgggaaacttagatcatcagtcaccgaaggtcctacagggccacaactgcccccgccacaacccaccccgctttcgtagttttcatttagaaaatagagcttttaaaaatgtcctgccttttaacgtagatatatgccttcccccactaccgtaaatgtccatttatatcattttttatatattcttataaaaatgtaaaaaagaaaaacaccgcttctgccttttcactgtgttggagttttctggagtgagcactcacgccctaagcgcacattcatgtgggcatttcttgcgagcctcgcagcctccggaagctgtcgacttcatgacaagcattttgtgaactagggaagctcaggggggttactggcttctcttgagtcacactgctagcaaatggcagaaccaaagctcaaataaaaataaaataattttcattcattcactca,功能,a、稳定mRNAb、有利于mRNA由核内到胞浆的转位c、有利于与核糖体蛋白的结合、与翻译起始蛋白的结合,3、真核生物mRNA的3poly（A）尾巴：,结构：200多个串联的聚合腺苷酸，poly（A）长则半衰期长功能：a、稳定mRNA模板b、有利于从核内到胞浆的转运,4、真核生物mRNA的5非翻译区，3非翻译区：,内含子(intron),外显子(exon),protein,5mG,3poly（A）,1、原核细胞和真核细胞的核糖体组成,(四)rRNA,2、rRNA的特征：,分子量最大，含量最多占RNA的80一级结构较保守，代谢稳定含甲基化碱基较多，利于与蛋白质结合含有许多基环结构，存在大量氢键,3、rRNA的二级结构基/茎环结构,大肠杆菌16SrRNA的二级结构,2、rRNA的功能：,在翻译的各阶段均与tRNA、rRNA相互作用。小亚基上有帽结合蛋白的识别位点，识别mRNA的帽子结构,(五)tRNA,1、一级结构：,分子量最小含有稀有碱基最多20个核苷酸是保守的，10个核苷酸是恒定的空间结构相似3端CCAOH,2、空间结构：,二级结构三叶草结构,tRNA的三级结构倒L形结构,五、核酸的理化性质及应用,(一)一般理化性质,1、粘度DNARNA2、沉降系数DNARNA3、酸碱性质DNAPI44.5，PH4.011.0稳定，提取pH8.0RNAPI22.5提取pH4.5左右，混有很少DNA污染,(二)紫外吸收特征,1、碱基的行为表现共轭双剑在260nm有最大吸收,2、应用测定浓度OD260=1.0相当于双链DNA50g/ml单链DNA（或RNA）40g/ml寡核苷酸20g/ml判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0测定是否变性DNA完全变性增加2540RNA变性增加1.1左右,(三)变性和复性,1、定义：通过加热、化学因素（尿素或者甲酰胺）等外力作用DNA解螺旋，由双链变成单链称为DNA变性。2、变性因素：加热强酸强碱有机溶剂3、变性后理化性质的改变增色效应碱基暴露Tm值：DNA在加热变性过程中紫外吸收达最大值一半时的温度。沉降系数增加粘度下降,4、复性：变性的DNA在适当的温度、一定离子强度条件下，给以足够的时间重新缔合形成双螺旋的过程，称为复性。5、影响复性的因素：T：Tm2026离子强度：降低带同种电荷单链间的排斥DNA浓度DNA复杂程度6、分子杂交：不同来源的具有互补序列的两条核酸单链，在一定条件下可以按碱基互补原则形成双链的过程。,六、遗传中心法则,转录,翻译,DNA,RNA,蛋白质,逆转录,基因,表型,控制,基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。,基因表达(geneexpression),translation,DNA,mRNA,protein,transcription,DNA,RNA,transcription,DNA无组织特异性基因表达有组织特异性,核酸生物合成的一般规律1按照碱基互补配对原则，以DNA为模板，逆转录以RNA为模板253方向，通过磷酸二酯键连接3特异的聚合酶催化4聚合酶的底物核苷酸要求是5核糖或脱氧核糖5RNA聚合酶进行聚合反应时，可从头合成RNADNA聚合酶进行聚合反应时，要有3-OH末端,(一)DNA的复制,复制(replication)是指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板，以dNTP为原料，按照碱基互补原则合成子链DNA的过程。,2019/12/1,49,可编辑,15N链,14N链,重氮环境15N,轻氮环境14N,1、复制的方式：,母链双螺旋解链，以母链的两条单链为模板，半保留复制以四种dNTP为原料碱基互补配对规律子代DNA双链与母链碱基序列一致53方向，通过磷酸二酯键连接,2、复制的条件：,substrate:dATP,dGTP,dCTP,dTTPtemplate:解开成单链的DNA母链模板primer:提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合enzyme：a、DNA聚合酶b、DNA连接酶c、引物酶d、解螺旋酶和拓扑异构酶,DNA拓扑异构：是指DNA分子在双螺旋的基础上更高层次的结构紧张状态与松弛状态，即超螺旋状态与解旋状态之间的相互转换过程。特点：这过程不发生碱基组成或顺序的任何改变。作用：超螺旋的解旋是复制或转录前的必要准备，除了缓解张力以利于复制或转录过程的正常进行外，更重要的是暴露DNA分子中的结合位点，使参与复制或转录的各种调控蛋白发挥作用。,解旋、解链酶类：拓扑异构酶：型不耗能，切断DNA双链中的一条，解除张力后封闭切口；型耗能切断DNA双链后封闭切口。解旋酶：在复制叉处解开双螺旋。移动方向可不同。单链结合蛋白：结合DNA单链，保护单链的完整性。,DNA聚合酶原核生物：DNApol：单一肽链构成的大分子，只能连续延长20个核苷酸。主要参与DNA的损伤修复和对空隙进行填补。具有三种活性：53的聚合活性;35的外切活性；53外切活性以枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理，DNApol裂解为两个活性片段，较大的C端称Klenow片段DNApol：只有35的外切活性何DNA聚合活性，在紧急修复中起作用。DNApo:真正催化核酸合成的酶，具有53聚合活性和35外切活性,引物酶：以DNA为模板催化一小段引物RNA合成的酶连接酶：连接两条DNA双链上的缺口形成磷酸二酯键，不能连接两条单链DNA端粒酶：真核细胞染色体DNA是线性的，它的3端有特殊序列，被称为端粒，该序列是线性DNA末端复制所必需的。端粒酶是一个蛋白质与RNA组成的核糖核蛋白，有逆转录酶的性质，能够利用自己的RNA成分作为模板，与端粒配合合成线性DNA的末端。以保证真核细胞染色体DNA的复制得以完成。,端粒（Telomere）是真核细胞染色体末端的特殊结构.人端粒是由6个碱基重复序列(TTAGGG)和结合蛋白组成。端粒有重要的生物学功能,可稳定染色体的功能,防止染色体DNA降解、末端融合,保护染色体结构基因,调节正常细胞生长。正常细胞由于线性DNA复制5末端消失,随体细胞不断增殖,端粒逐渐缩短,当细胞端粒缩至一定程度,细胞停止分裂,处于静止状态.故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(Mistosisclock)，端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关。,体内DNA复制是以一段由RNA聚合酶合成的小片段为引物的.复制结束后，该引物被切除。因此，每复制一次，都要比母链就缩短一节。但是会不会缩短到没有呢？,端粒酶(Telomerase)是使端粒延伸的反转录DNA合成酶。是个由RNA和蛋白质组成的核糖核酸-蛋白复合物。其RNA组分为模板,蛋白组分具有催化活性,以端粒3末端为引物,合成端粒重复序列。端粒酶的活性在真核细胞中可检测到，其功能是合成染色体末端的端粒，使因每次细胞分裂而逐渐缩短的端粒长度得以补偿，进而稳定端粒长度。主要特征是用它自身携带的RNA作模板，通过逆转录合成DNA。,DnaA,DnaBDnaC,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,DnaA1)在DNA复制过程中，识别起点序列，并在起点特异位置解开双链的一种蛋白质。2)DNA复制起点上有四个9bp的重复序列，为DnaA蛋白的结合位点。3)DNA缠绕其上，形成起始复合物（initialcomplex）。,解链过程中正、负超螺旋的形成,复制的方式半保留复制复制的高保真性双向复制半不连续复制复制起始点具有特殊的序列形成复制叉结构需要RNA引物,3、复制的基本规律：,(二)DNA的损伤与修复,1、引起突变的因素：,物理因素紫外线照射电离辐射化学因素稠环芳香烃黄曲霉素B亚硝酸盐生物因素碱基错配,2、DNA损伤修复：,光修复,切除修复,重组修复,SOS修复当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应，形成网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。,(三)转录,转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。mRNA把遗传信息从染色体内贮存的状态转送至胞质，作为蛋白质合成的直接模板。,1、方式：,不对称转录(asymmetrictranscription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。底物4种NTP53方向，通过磷酸二酯键连接,5GCAGTACATGTC3,3cgtgatgtacag5,5GCAGUACAUGUC3,NAlaValHisValC,编码链、有义链、正链orCrick链,模板链、无义链、负链orWatson链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,基因文库DDBJ（DNADataBankofJapan）EMBL（TheEuropeanMolecularBiologyLaboratory）,2、酶RNA聚合酶（无外切酶活性，不能纠错）,E.Coli4种亚基构成的五聚体（2）,：决定哪些基因被转录：催化功能，结合底物NTP，并形成磷酸二酯键。：结合DNA模板，参与转录的全过程。：辨认起始点，70是典型的辨认转录起始点蛋白。,核心酶coreenzyme,全酶holoenzyme,起始：RNA聚合酶全酶在转录起始区（启动子）的结合,-35,RNA聚合酶识别部位,RNA聚合酶结合部位-10,原核生物转录起始,3、转录过程,（一）原核生物的转录起始,2DNA双链解开,形成转录空泡,1RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,5-pppGpNOH+ppi,RNApol-DNA-pppGpN-OH,pppG,NTP,pppGpN-OH,起始复合物:,5-pppG-OH+NTP,转录起始需解决两个问题：1、RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域2、DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板,延伸,转录延长,1、亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2、在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,转录终止,-RNA聚合酶在DNA模板上停止前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来,原核生物的转录终止,1、依赖因子（Rho)的转录终止,2、不依赖因子的转录终止,D