丝裂原活化蛋白激酶.pptVIP

第九章,丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)Ser/Thr蛋白激酶受细胞外刺激而激活在所有真核细胞中高度保守通路组成三级激酶模式调节多种重要的细胞生理/病理过程,本章主要内容：MAPK信号通路的成员MAPK的蛋白结构MAPK通路模式MAPK的激活MAPK信号转导通路间的关系,一、MAPK信号通路的成员MAPK是信号从细胞表面核内的重要转递者。已鉴定的(据1999的统计)：MAPK激酶激酶(MKKK)14种MAPK激酶(MKK)7种MAPK12种,MKKK(MAPKinaseKinaseKinase)亚族：,MKK(MAPKinaseKinase)亚族：,MAPK(MAPKinase)亚族：,二、MAPK的蛋白结构（一）MAPK的一级结构苏氨酸磷酸化位点与其他蛋白激酶同源，酪氨酸磷酸化位点是MAPK独特的。磷酸化位点的三肽模体TXYERK和ERK5TEYp38TGYJNKTPY,三肽模体位于L12各亚族L12长度不同活化唇(activationlip)各亚族都具有12个保守亚区真核细胞蛋白激酶超家族区分标志之一家族成员之间具有较高的同源性,哺乳动物MAPK,哺乳动物MAPK,（二）MAPK的二级结构和超二级结构以ERK2为例N端域主要由折叠和2个螺旋组成（1109和320358位氨基酸残基）C端域螺旋，含磷酸化唇和MAPK插入，催化环（Arg-147152)（110319位氨基酸残基）交界处的裂隙ATP结合位点,（三）MAPK的空间结构特征大体结构：非常相似底物结合口袋的结构特征：无活性时被阻断，有活性时暴露出。ATP结合位点的结构特征：大小、形状、疏水性和电荷等不同磷酸基团结合位点：4个保守位点,三、MAPK通路模式,四、MAPK的激活MAPK激活机制的发现重要的实验观察：20世纪80年代，观察到当GF刺激时，Tyr被磷酸化的主要蛋白为42kDa佛波酯醇刺激时，产生同样的蛋白胰岛素RTK催化Ser/Thr蛋白激酶胰岛素刺激，产生Thr和Tyr双磷酸化的42kDa蛋白,MAPK的激活机制活性部位位于两个折叠域的界面是通过Thr和Tyr的双位点同时磷酸化而被激活例：ERK2Tyr-185,Thr-183pY185解除L12对底物结合的阻断MAPK是Pro指导的蛋白激酶,对于ERK2来说，其底物的一般保守性序列为Pro-X-Ser/Thr-Pro活化环中Tyr-185和Thr-183的磷酸化，引起该环重新折叠，与Arg结合位点相互作用酸性氨基酸替代，不导致组成性活化MAPK的点突变不影响其活性,五、酵母MAPK通路酿酒酵母已鉴定出5条单倍体的交配途径浸润性生长通路细胞壁重构通路双组分渗透压感受器通路Sho1渗透压感受器通路,（一）酵母菌中MAPK模式的组成和作用酿酒酵母：4种MKKK4种MKK6种MAPK其中，4种参加明确的5种MAPK通路2种(SMK1,YKL161C)参加未知的MAPK通路3个成员通过与支架蛋白结合而联在一起,（二）单倍体酵母与交配有关的通路酿酒酵母的2种交配型(单倍体)：a细胞型和细胞型2种性信息素：a因子和因子7次跨膜受体：Ste3和Ste2异三聚体G蛋白：Gpa1亚基Ste4亚基Ste18亚基,Ste2receptor,酿酒酵母的交配通路,ste：不育基因Ste5：支架蛋白Ste12：转录因子,支架蛋白(Scaffoldprotein)其主要功能是将其他蛋白质结合在一起，促进它们相互作用。将细胞信号通路中的各种信号分子结合在一起，形成复合物起生理性隔室化的效应,从而防止该通路与其他通路发生交联含有许多蛋白结合域,（三）浸润通路缺乏氮源形态改变假菌丝：缺乏氮源时，椭圆型的双倍酵母进行不对称的细胞分裂以产生一个细而长的子细胞，后者又不断产生长的子细胞。由于母细胞与子细胞仍然相连，因此这种单级分裂方式的不断重复将产生由延长的细胞组成的丝状物。,KSS1：丝状生长所需要(单倍体，双倍体)注：未被Ste7激活时，是浸润生长的抑制物，被Ste7激活时，刺激浸润生长。,FUS3和KSS1的鉴别：刺激激活的条件不同FUS3信息素KSS1缺乏氮源表达不同FUS3单倍体细胞中KSS1单倍体细胞和双倍体细胞中对浸润生长的调节作用FUS3抑制KSS1刺激,（四）细胞壁重构通路,酵母的生长依赖于有效的细胞壁重构PKC1：MKKKKMKK1和MKK2的重叠作用意义不清,（五）渗透压感受器和应激通路酿酒酵母的2种渗透压感受器：“双组分”渗透压感受器低渗透压条件下激活膜渗透压感受器高渗透压条件下激活2种渗透压感受器对MAPK通路的调节作用不同,1.“双组分”渗透压感受器“双组分”转导体系通常见于原核细胞“双组分”转导体系的组成感受器分子胞外区+胞质His激酶域+反应-调节分子接受域+DNA结合域是一种His-Asp磷酸化体系“双组分”转导体系在哺乳类尚未鉴定出,“双组分”转导过程感受器蛋白活化胞质激酶域的His磷酸化反应-调节分子接受域的Asp磷酸化启动输出功能，即转录激活作用,酵母“双组分”渗透压感受器：由3种蛋白组成Sln1+Ypd1+Ssk1两个相连的“双组分”体系第一个Sln1(His激酶域和接受域)第二个Ypd1(His激酶域)+Ssk1(接受域),在低渗透压条件下Sln1是有活性的Ssk1是无活性的HOG1也无活性在高渗透压条件下Sln1是无活性的Ssk1是有活性的HOG1也有活性,2.Sho1依赖的渗透压感受器Sho1：跨膜蛋白渗透压感受器结构：4个跨膜区+C-末端胞质区(含SH3域),在高渗透压条件下Sho1感受高渗透Sho1激活Ste11Pbs2发挥支架蛋白的作用Pbs2含有多聚脯氨酸富集区,3.裂殖酵母菌中的渗透压感受通路和应激通路环境应激时激活2个相关的MAPK通路WIK/WIS/SPC1通路WIN1/WIS/SPC1通路(在渗透压应激时起主要作用)上游调节因子Mcs4是Ssk1蛋白的同源物ATF1是SPC1的主要核内底物,SPC1只有经磷酸化后才能入核热休克和氧应激时SPC1磷酸化激活，但不需要WIS的作用。Pyp1使SPC1脱磷酸化,（六）芽孢形成通路芽孢形成：是指将单倍体核包装入芽孢的过程包括减数分裂。仅发生在双倍体由饥饿诱发芽孢形成过程：减数分裂双层膜的原孢子壁包裹单层核膜的4个单倍体从原孢子壁的双层间隙沉积孢子壁。,孢子壁的组成：共4层：第一、二层：同植物细胞壁第三层：孢子特异性的结构聚乙酰氨基葡糖+聚氨基葡萄糖第四层：电子密集层双酪氨酸包被,从以上酵母MAPK通路的研究中看到:MAPK通路是一个连续的蛋白激酶激活的途径MAPK的主要底物为转录因子MAPK通路受不同的上游因子调节信号转导是高度特异的某一种蛋白成员存在于数种通路时,支架蛋白起着隔室化的作用,六、哺乳动物MAPK通路哺乳动物MAPK通路不同于酵母:多种MAPK通路可被一种受体型所激活MAPK的主要底物包括转录因子、胞质蛋白质、细胞骨架、蛋白激酶和磷脂酶已鉴定出4条MAPK通路MAPK有多种亚族和多种不同的剪接体,（一）ERK通路研究得最为透彻ERK的MAPK有5种(15)它们分属于不同的亚族ERK1和ERK2(ERK1/2)研究得最为透彻为细胞内主要的MAPKERK3存在于细胞核ERK4通过Ras依赖性通路而被激活,1.ERK1/2通路中MKKK许多受体通过活化Ras激活ERK1/2通路Raf:是该通路中的重要的MKKK亚型:有3种A-Raf、B-Raf、Raf1组成:含3个结构域C-末端的激酶域富含Cys的调节域含Ras结合位点的调节域,表达:Raf1在体内广泛表达而A-Raf和B-Raf表达方式严格如B-Raf主要在神经组织中表达激活:酶水平的调节较复杂主要包括2个过程:一是结合于GTP-Ras二是磷酸化(一簇Ser338,Ser339,Tyr340,Tyr341),Raf1对于H-、K-和N-Ras显示应答B-Raf可被Rap1a活化TC21能够与Raf1和B-Raf相互作用，激活它们。上游激酶的调节:已知磷酸化Raf1的激酶有Src、PAK、PKC及其他蛋白激酶,其他的磷酸化位点Ser259和Ser621调节Raf1与14-3-3蛋白结合，稳定其活性。不过，14-3-3蛋白也可能抑制Raf活性。抑制性的磷酸化位点是由Akt(Ser259)和PKA催化的。抑制：RKIP可干扰Raf-MEK的结合，抑制后者磷酸化和活化。,2.ERK1/2通路中MKK(MEK)MEK1和MEK2是该通路主要的MEK为双特异性蛋白激酶通过两个残基的磷酸化而被激活(Ser或Thr)(同MAPK)突变可引起其活性增加(不同于MAPK)酸性氨基酸替代，明显增加其活性特异性较高，仅磷酸化少数底物,MEK4可磷酸化非MAPKMEK1和MEK2含3个非酶活性结构域ERK1/2结合位点(D域)富含Pro结构域核输出序列(NES),MEK1和MEK2的上游调节因子Raf、RTK、非RTK、GPCR在转化细胞：RasRaf1MEK1ERK1/2在心肌细胞A-RafMEK1ERK1/2在PC细胞B-RafMEK1ERK1/2,3.ERK1/2蛋白激酶的作用底物及灭活底物的保守性磷酸化位点模体为Pro-Lue-Ser/Thr-Pro底物蛋白胞质蛋白:p90S6K、cPLA2、EGF受体细胞骨架:MAP1、2、4、Tau转录因子：Elk-1,Ets-1,Sap1a,c-Myc等灭活:MKP-1,-3,-4,4.ERK1/2通路的生物学功能刺激细胞增殖抑制细胞生长、分化细胞周期调控调控MTOC纺锤体的组装促进细胞存活某些情况下，与细胞死亡有关,（二）JNK信号转导通路1991年鉴定出的新的MAPK与ERK有两点不同：被紫外线辐射等细胞应激所激活磷酸化c-Jun的氨基活化位点故称之为c-JunN-terminalkinase(JNK)鼠的同源物则被命名为Stressactivatedproteinkinase(SAPK)。,之所以称为SAPK是因为在应答各种刺激时，它们的活性增加。这些应激包括：细胞因子生长因子撤离干扰DNA和蛋白合成的试剂UV辐射热休克反应活性氧(ROS)高渗透压,JNK信号转导通路是已知的应答最多样刺激的细胞信号转导途径之一JNK通过Thr-Pro-Tyr模体的磷酸化被激活由JNK、MAP2Ks、MAP3Ks和MAP4Ks组成细胞外配体应答的JNK通路照比细胞应激应答研究得较为清楚,JNK：人的JNK由3个基因(jnk1,jnk2和jnk3)编码3个基因转录产物的不同剪接产生10个JNK亚型(46kDa,55kDa)JNK家族成员间的激酶催化核心的同源性为87%同一基因编码的46kDa和55kDa亚型无明显的功能差异,JNK1和JNK2广泛地在多种组织表达JNK3主要在神经组织表达JNK1和JNK2在激酶域的不同剪接体可改变JNK与它们底物的相互作用不同的亚型受不同的调节,JNK底物包括：转录因子c-Jun,Jun-D,ATF-2,ATF,Elk-1Sap-1a,GABP,GABP肿瘤抑制蛋白p53JNK生理功能：JNK1和JNK2有重叠功能，在免疫应答和胚胎发育中具有重要的调节作用。JNK3在神经组织中有特异功能,1.JNK信号通路MKK和MKKKMKK(MAP2Ks)MKK4(SEK1/MEK4/JNKK1/SKK1)主要激活JNK，但对p38也有活化作用可能是个抑癌基因胚胎发育所必需使细胞免于凋亡不是惟一的激活剂,MKK7(MEK7/JNKK2/SKK4)特异地激活JNK，而不激活p38或ERK与MKK4相关，属于哺乳动物细胞MAPKK超家族与果蝇的HEP(DJNK的激活剂)密切相关MKK7基因编码6个蛋白亚型不同亚型应答不同的细胞外刺激和上游激酶,MKK4与MKK7在人和鼠组织中广泛表达，但在不同的组织起表达的丰度不同MKK4与MKK7介导来自同一细胞外刺激的信号转导，但它们被不同MAP3Ks所激活。同MEK1/2，用酸性氨基酸置换磷酸化位点的氨基酸，可增加其激酶活性。,MEKK(MAP3Ks)包括：MEKK14、ASK1/MAPKKK5MAPKKK6、TAK1Tpl-2、MLK2/MSKMLK3/SPRK/PTK1MUK/DLK/ZPKLZK,MEKKs(MAPK/ERKkinasekinases)因与酵母的STE11同源而被克隆首先鉴定出的激活JNK的MAP3K是MEKK1目前已克隆的4种称为MEKK14在蛋白C-末端具有同源的激酶域，而它们的N-末端几乎无同源性,MEKK1和4与G蛋白Cdc42和Rac相互作用MEKK1还可结合RasMEKKs也调节其他细胞信号转导途径MEKK13激活ERK通路MEKK34激活p38通路,TAK1(TGF-activatedkinase)因其在芽殖酵母中具有回补STE11突变体缺失的功能而被克隆N-端具有激酶域C-末端与TAB1/2相互作用被TGF-、IL-1、神经酰胺、UV激活可直接激活IKK和NF-B转录活性,ASK1/MAPKKK5ASK2/MAPKKK6(Apoptosissignal-regulatingkinase1)应用PCR技术而被鉴定出激酶域位于蛋白分子的中间ASK1MKK4JNKASK1MKK3p38被TGF-、FasL激活诱导凋亡,ASK2/MAPKKK6ASK1的相关激酶(鼠的同源物是ASK2)应用酵母双杂交技术而被鉴定出整个分子与ASK1的同源性为45%但激酶域的同源性高达82%与MEKK14的同源性约为40%仅能较弱地激活JNK，但并不能激活p38,Tpl-2/cot(Tumorprogressionlocus2)最初作为原癌基因而被克隆与人的cot基因约有90%的相同性与其他的MAP3K约有30%的相同性Tpl-2MEK1ERKTpl-2MKK4JNK参与NF-B的激活,MLKs(Mixedlineagekinase)该家族激酶的特点：催化域具有Tyr和Ser/Thr两种蛋白激酶的结构特点N-端含有SH3模体C-端有Pro富集区C-端附近有亮氨酸拉链,MLK2/MST(mammalianSTE20-like)MLK2MEK4JNKMLK2MKK7JNK对p38和ERK的作用较弱含有Cdc42和Rac的结合位点MLK3/SPRK/PTKMLK3MKK4JNKMLK3MKK3/6p38对ERK无作用,MUK/DLK/ZPK/LZK(MAPK-upstreamkinase)(dualluecinezipper-bearingkinase)(luecinezipper-proteinkinase)(luecinezipper-bearingkinase)MUKMEK7JNKLZK激活JNK,MAP4KsSTE20相关激酶N-端具有STE20样的催化域中间至少有2个Pro富集域C-端有CNH域是JNK强的特异性激活剂GCK(germinalcenterkinase)KHS(kinasehomologoustoSTE20)GCKR(GCK-relatedkinase)GLK(GCKlikekinase),TAO1(Thousandandoneaminoacidproteinkinase)应用PCR方法从大白鼠脑的cDNA文库中鉴定出。主要在脑和睾丸中表达激酶域与其他STE20相关激酶的同源性约45%主要激活MKK3,HPK1(hematopoieticprogenitorkinase)主要在造血细胞中表达含有4个Pro富集域与连接物蛋白相互作用受酪氨酸蛋白激酶调节主要激活JNK，不是ERK和p38在TGF-诱导的JNK激活中是TAK的上游,支架蛋白：在哺乳动物细胞中了解有限JIP1(JNK-interactingprotein1)应用酵母双杂交筛选出主要结合JNK，不是ERK和p38抑制JNK的核转位结合MKK7与MLK家族、HPK1相互作用,（三）p38信号转导通路p38最初作为LPS刺激产生的酪氨酸磷酸蛋白而被鉴定出p38与酵母HOG1具有明显的同源性p38是细胞抑制性抗炎药的靶分子双磷酸化三肽模体Thr-Gly-Tyr不同亚型的表达、激活和特异性不同亚型之间有重叠的、不同的生理作用,p38的表达：p38：白细胞、肝、脾、骨髓中等高表达p38：脑和心中高表达p38：主要在骨骼肌中表达p38：肺、肾、肠及内分泌器官中高表达注：p38和p38具有不同的剪接体例：Mxi缺少80氨基酸残基的p38,p38的结构：N-末端、C-末端延伸短，与已知其他激酶无同源性(p38家族成员和JNK亚型除外)相似于ERK2，但活化环构象差异明显ATP结合位点相对开放磷酸化唇序列比ERK2短6个氨基酸残基,1.p38信号转导通路的MKK和MKKKMEKs:MEK3和MEK6是细胞中p38激活的主要激酶。不同的MEK选择性地激活不同的亚型MEK6共同的激活剂MEK3激活p38,MEKKs:MEKK13参与p38激活MEKK1MEK4p38(3T3细胞)MEKK3MEK3p38(转化细胞)MLK家族的4个成员参与p38激活其他激酶Tp12ASKTAK,MLK家族成员含有3个结构域：SH3域亮氨酸拉链小分子G蛋白结合域参与p38激活的4个成员是：MUK/ZPK/DLKMTK1/MEKK4MLK2/MSTMLK3/PTK/SPRK,上游调节因子：Rac、Cdc42、Rho家族的小分子GTPase是p38途径的较强的调节因子。Rac/Cdc42PAKp38,来自细胞表面的活化：异三聚体G蛋白可激活p38途径，但激活机制因细胞不同而异。M1-乙酰胆碱受体-Gq/11M2-乙酰胆碱受体-Gi-肾上腺素受体-Gs(HEK293细胞)1A-肾上腺素受体-Gs(PC12细胞)-肾上腺素受体-Gi(ARVM细胞),激活p38途径的物理、化学应激：氧化应激(巨噬细胞)低渗压(HEK293细胞)紫外线辐射(PC12细胞)低氧(牛肺动脉成纤维细胞)循环扩张(肾小球膜细胞),亚细胞定位：细胞核、胞质(免疫荧光显微镜)应激反应，如心肌缺血、低氧时，胞质核p38的抑制剂：吡啶咪唑结合于ATP结合位点延伸袋p38,敏感p38,不敏感,2.p38蛋白激酶的作用底物和灭活作用底物:细胞骨架细胞应激微管相关蛋白(tau)stathmin(癌蛋白18）细胞质蛋白刺激血小板cPLA2血管紧张素Na+/H+交换体,转录因子ATF1/2(activationtranscriptionfactor1/2)CHOP10(C/EBP-homologusprotein10)MEF2C(myocyteenhancerfactor2C)Max(mycassociatedfactorX)MAPKAPK2/3MNK1/2(MAPK-interactingkinase1/2)PRAK(p38-regulated/activatedkinase),p38蛋白激酶灭活：蛋白激酶磷酸