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文档简介
第一节受体概念及基本特性概念:受体是细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子(药物、毒素、神经递质、激素、抗原和细胞粘附分子等)并与之相结合的生物大分子。它们能将生物活性分子产生的信息传递到效应器,从而引起相应的生物效应。这些生物大分子多数是蛋白质,个别的是糖脂。,受体的功能:(1)具有识别和结合的功能:即受体对其相应的配体应有一特异的识别和结合过程。(2)传导信号功能:受体与其配体结合后,应能将两者相互作用产生的信号传递到第二信使或效应器上,如酶、离子通道等。(3)产生相应的生物学效应。配体是能与受体呈特异性结合的生物活性分子。配体可分为激动剂和拮抗剂两大类。与受体结合后产生效应者为激动剂,不产生效应或阻碍激动剂与受体结合产生效应者为拮抗剂。,激动剂和拮抗剂又分为两型。I型激动剂:与内源性配体结合于受体的同一部份,产生与内源性配体同样的信号类型,其作用强度相当于或大于内源性配体。II型激动剂:与内源性配体结合于受体的不同部份,它本身不产生信号或当与内源性配体同时结合于受体时对其信号有加强作用,这类激动剂也称别构调节剂。,I型拮抗剂:与激动剂结合于受体的同一部份,但减弱或阻断内源性配体产生的信号。II型拮抗剂:与内源性配体结合于受体的不同部份,本身不产生信号或当内源性配体同时结合于受体时减弱或阻断其产生的信号,也称别构负调节剂。,受体的性质:(1)饱和性:也称有限结合力。受体是细胞的组分之一,不同受体,甚至同一受体在不同组织细胞中的数量有很大差异,可从数百(例如每个甲状腺滤泡上的促甲状腺激素受体约为500个结合部份)到数十万(每个肝细胞上的胰岛素受体约25万个结合部位)。但对某一特定受体来讲,它在特定细胞中的数目应是有一定限度的。,(2)专一性:这是指受体对配体的选择性。这种选择性取决于受体和配体两个方面。绝大多数受体是蛋白质,它们与配体结合的氨基酸残基以一定的顺序形成特定的空间结构,因而选择性地以高亲和力与一种或一类的结构上与其互补的配体分子相结合。专一性除了指受体对配体的选择性以外,还表现为受体与配体结合的立体专一性,著名的肾上腺素与其受体的三点结合理论,形象地表现出受体对配体的立体结构选择性(如下图)。,L-肾上腺素分子上带正电荷的原子,以离子键的方式与受体结合部位中的阴离子部分相结合;其羟基的氢与受体结合部位中可以提供电子对的部分以氢键相结合,而苯环则以范德华力与受体结合,即肾上腺素分子中的H原子以及不对称C原子(C*)所结合的三个基团的空间排列,恰恰能与受体中的三个点相契合,故可以相互作用,产生生物学效应。D-肾上腺素只有两点与受体契合,因而难以与受体结合产生肾上腺素的生物学效应。,(3)可逆性:一般地讲,受体与配体的结合,绝大多数是通过氢键、离子键和范德华力等非共价健结合的,因此受体与配体的结合是可逆的。在放射性配体结合实验中,当标记配体与受体的结合达到平衡时,加入高浓度的非标记配体,可取代标记配体,表现出受体配体结合的可逆性。,以上三点都是基于放射性配体结合分析实验,并不是鉴定受体的唯一和最后的手段。由这种方法所检测到的只是放射性配体的结合部位,还应进一步确定结合部分与功能的相关性以及受体分子的结构。确切地说,作为检定受体的指标,应包括三个部分的研究结果,一是放射配基结合分析;二是受体结合与功能相关,即某一特定类型的受体与配体结合反应能观察到相应的效应,例如腺苷酸环化酶活性的激动或抑制,磷酰肌醇代谢的消长,以及阴离子或阳离子通道的开放与关闭等等;三是受体结构的确定,即它的氨基酸组成和顺序及三维结构等。,受体的分类(1)神经递质受体:这是人们通过药理学和生理学方法最早认识的受体,例如乙酰胆碱受体,-氨基丁酸受体、5-羟色胺受体、多巴胺受体等。,(2)激素受体:这类受体除了经典的激素,如胰岛素、甲状腺素等外,所有新近发现的主要作用于局部,但也可作用到远隔部位和种类繁多的化学信息分子的受体都包括在这一类中,如前列腺素受体(花生四烯酸代谢产物)、白三烯类受体、嘌呤受体、腺苷和腺苷酸受体、细胞因子(白介素、干扰素、肿瘤坏死因子)受体等。(3)摄取血浆蛋白或转运物质的受体:如低密谋脂蛋白受体、肝细胞的去唾酸糖蛋白受体等。,(4)细胞粘附受体:这类受体介导细胞与细胞、细胞与间质之间的相互作用。细胞粘附受体与配体结合后的生物效应主要表现为细胞内骨架蛋白结构和功能的改变,以及由此而引起的细胞变形和运动。(5)化学趋向性物质受体:如细菌的化学趋向物质受体,高等动物的中性多核白细胞的甲酰寡肽受体等。,(6)直接参与免疫功能的受体:包括T和B淋巴细胞上的抗原受体、免疫球蛋白受体、补体受体等。(7)药物受体:在药物受体的内源性配体没有找到之间,这类受体以药物分类,如苯环利定受体。而吗啡受体,在找到它的内源性配体阿片样肽后,则称为阿片肽类受体。(8)毒素受体。(9)病原体受体。,近年,随着分子生物学的发展,使人们对受体的本质有了较深刻的认识,从而有可能根据受体的结构和信号转导机制进行分类。在介绍驼种分类法前,为了便于叙述,我们先定义两个概念受体家庭和受体超家族。受体家族指分子结构和功能都相似的一组受体,受体超家族指分子结构相似而功能不同的一组受体。,从受体激活到产生效应间所需时间差异极大,有些效应非常迅速,如神经介质介导的突触传递,常以毫秒计;几茶酚胺类产生效应需要数秒钟,如甲状腺激素和甾体激素的效应需数小时。而有些肽类激素产生效应则需要数天的时间。这是因为受体与配体结合后所触发的信号转导机制不同。根据现在对受体结构和信号转导机制的认识可将受体分为4型(下表)。,受体的分型,I型配体门控离子通道型(directligand-gatedchanneltype)受体:这型受体多为快速反应的神经递质受体,如n-Ach受体、GABA-A受体等。受体直接与离子通道相联,配体与其结合后数毫秒钟内引起细胞膜的电位变化而产效应。II型G蛋白偶联型(G-proteincoupledtype)受体:这型受体主要包括很多的激素和慢反应神经递质的受体,如m-Ach受体、肾上腺素受体和腺苷受体等。这类受体与G蛋白偶联,通过G蛋白间接地控制第二信使或离子通道产生效应。这型受体与配体从结合到产生效应一般在数秒到数分钟。,III型酪氨酸激酶型(tyrosinekinase-linkedtype)受体:这类受体的最大特点是受体本身具有酪氨酸激酶的活性,通过酪氨酸激酶活性直接控制蛋白质的磷酸化,进而产生生物效应。此型受体包括胰岛素及各种生长因子的受体,它们产生生物效应一般在数小时。IV型DNA转录调节型(DNAtranscription-regulatedtype)受体:这型受体与前三型不同,它位于可溶性胞浆或细胞核内(前三型位于细胞膜),因此这类受体也称核受体,而前三型归于膜受体,此型受体的激活直接影响DNA转录,它的效应时程需要数天甚至更长。,第二节抗体分子的结构与功能抗体是高等脊椎动物获得性免疫反应的效应分子,就其化学本质而言,所有的抗体均属球蛋白。但球蛋白并非都是抗体,抗体是球蛋白中的一部分,在血清蛋白电泳中主要表现为移动较慢的-球蛋白,也有少量存在于-或2-球蛋白的慢悠悠移动区(图5-1)。免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是世界卫生组织(WHO)建议采用的各类抗体的统一名称。,下图显示了一个典型抗体的结构模式。这一模式是1959年Eldman用-巯基乙醇解析人IgG的肽链组成而加以证实的,以后被确认为各类抗体的基本结构单位。由图可见,抗体的基本单位是一个双边对称的4肽链结构,包括2条相同的重链(heavychain,分子量50kDa)和2条相同的轻链(lightchina,分子量23kDa),链间以二硫键联结,使整个分子呈现“Y”字形态,二硫键联结两条重链的对应区段,称枢纽区(hingeregion)。,抗体分子的结构通式可用HL2n表示,HL代表基本的4肽单位,n=1,2,3,4,5。最小的抗体只有2条重链和2条轻链,1个基本单位,n=1,如IgG;最大的抗体包括10条重链和10条轻链,5个基本单位,n=5,如IgM。,一、Ig轻链Ig分子中相对较短而完全相同的两条肽链称为轻链(lightchain,L)由211217(平均214)个氨基酸残基组成,通常不含碳水化合物,依据其抗原性不同又区分为Kappa(k)链和Lambda()链两型。一个Ig分子中只含有一型轻链,两型轻链不能共存于一个Ig分子内。,Ig轻链中尚含有特征性的五个半胱氨酸残基,羧基端的一个半胱氨酸(cysteine)与重链(heavychain)之间相应的残基形成链间二硫键,另外四个半胱氨酸残基则形成链内二硫键,即21-86和135-194位的联接。链内二硫键及其所包含的数十个残基实际上是特征性功能区的重复或周期性的反映。,二、Ig重链Ig分子中的相对较长而且完全相同的另外两条肽链称之为重链(heavychains,H),约含450个氨基酸残基,几乎是轻链的两倍,而且具有糖基化位点。Ig重链一般区分为(IgG)、(IgM)、(IgA)、(IgD)和(IgE)五类,,三、Ig片段Ig的绞链区(hingeregion)在一级结构上富含脯氨酸,同时存在寡糖基团,重链间二硫键也多集中在此区,使得肽链不能形成螺旋结构而保持较高的柔曲性,这就使得绞链区易于被蛋白酶水解(图5-3)。常用于水解Ig的蛋白酶类有木瓜酶(papain)和胃蛋白酶(pepsin)。,木瓜酶从绞链区的第224位残基切断两重链,一个IgG分子可裂解成两个Fab(fragmentsofantigenbinding)片段和一个Fc(fragmentofcrystallization)片段,包含在Fab片段中的重链部分称为Fd片段,进一步的酶反应位点在第341和433位残基,两位点间的肽段称为Fc。,将完整IgG与其Fc、Fab和F(ab)2片段进行比较可以发现,F(ab)2仍然具备完整IgG结合抗原的部位,并保持了二价特性,可以结合并交联两个抗原分子,但由于缺乏完整IgG中的Fc片段,因而不具备结合补体和受体等生物学效应。Fab尚能结合抗原但却是单价的,同样也不具备Fc的效应。,Ig的基本类别和特性Ig的重链依据其分子结构和抗原性可区分为类(class),共有IgG、IgM、IgA、IgD和IgE五类(图5-4),它们分别含、和重链,,一、IgGIgG约占总Ig的75%,血清中浓度为816mg/ml,血管内人布约45%。IgG的分子量为150kDa,含糖量为3%,呈典型四肽链结构,具有二价的抗原结合位点和三个恒定区(CH1、CH2和CH3)。IgG可以通过胎盘,也是机体二次免疫反应中的主要抗体,具有较强的中和能力。,二、IgMIgM占血清总抗体的5%10%,血清中浓度为0.52mg/ml,血管内分布占80%。IgM为五聚体并含J链,分子量高达900kDa(单体的分子量为180kDa),含糖量约12%。,三、IgA循环性IgA约中总IgA的85%,血清中浓度为14mg/ml,占血清中总抗体的10%左右,其血管内分布约为42%。血清中的IgA是单体、二聚体和多聚体的混合形式,其中单体IgA占80%,其分子量为160kDa,结构与IgG类似,含糖量是7%。IgA中的重链为链,尽管它没有额外的同源单位,却比IgG分子中的链长,分子量为55kDa。IgA在粘膜免疫和获得性免疫中发挥作用。,四、IgDIgD在血清中的浓度低于0.4mg/ml,占血清中总抗体的1%,血管内分布约叶75%,IgD结构类似IgG,分子量为180kDa,其中含糖量达12%,重链为链,分子量为62kDa,长于IgG中的链。,五、IgEIgE在血清中的浓度极低(10400ng/ml),占血清中总抗体的0.01%,血管内分布占51%。IgE也呈单体形式存在,分子量为190kDa,含糖量为12%。IgE分子中的重链为链。分子量是70kDa,含有四个恒定区。,抗原抗体反应结合抗原是抗体的基本性质,抗原抗体反应的动力学,以及抗体活性的测定方法,都是免疫化学研究的重要内容。图5-5显示了与抗体结合抗原有关的各种作用力。与形成这些力有关的离子或原子基团根植于抗原决定簇与抗体结合部位的分子内部,两者是否匹配及所产生的吸引与排斥的综合效果,将在很大程度上决定着抗体的亲和性。,抗体的特异性和亲和性同是抗体活性的指征,但各自的形成机制却不相同,如特异性所必需的分子基团与支持亲和性的基团一致,则特异性强的抗体,亲和性也高;反之就可能出现特异性与亲和性偏离的现象。,抗体活性的检测一般以结合抗原后所产生的形态变化为指征。有人将抗原抗体反应分为不同的等级,简单地说,一级反应限定在溶解状态;二级反应要有肉眼可见的凝集或沉淀现象;三级反应则必须出现由抗体直接或间接引起的生物效应,如细胞溶解、局部组织坏死等。,第三节核酸探针制备核酸探针是一类具有特异顺序的DNA或RNA克隆片段。它们能专一性地与受检目标DNA互补结合(分子杂交),检测核酸的质和量。它具备两个基本功能要素:(1)示踪:探针依据自己特有的碱基顺序,从茫茫DNA和RNA的大分子群体中,通过碱基互补的原则,跟踪和发现与自己同源的核酸顺序;,(2)显示性:核酸探针在捕捉到目标DNA后,通过自己的显示器,显现目标DNA的存在及其性质。探针制备就是将其示踪性和显示性融入一体的过程。分类:分为DNA、RNA和人工合成核酸三大类。它们有着不同的来源和制备方法、根据不同的检测目的和示踪要求,可以选择和应用不同类型的核酸探针。,核酸标记重组DNA技术发展往往依赖于新的检测手段的出现,使我们能检出和分析从克(g)到微微克(10-12g,即pg皮克)水平的DNA,能操作十分之一微升(0.1l)体积的DNA。目前实际可以应用的三个基本检测和示踪DNA的手段,它们是:(1)用紫外分光光度仪测量核酸,定量和检出每毫升微克水平(g/ml)的DNA;(2)用溴乙锭(E.B)染核酸的荧光紫外分析定量(10ngDNA);(3)同位素(如32P)标记核酸的定量和检定(pgDNA)。,许多核酸分析工作都是在非常小的体积中进行的,这有利于一些酶促反应的完成(如限制性酶解,DNA连接与克隆、cDNA合成和DNA的体外合成等)。应用32P等同位素做为示踪剂,可以使我们很容易监测到DNA的存在及工作状态,并进行定量分析。,32P在水和塑料中释放射线距离为6mm,能激发表面荧光,因而在自显影时可用增感屏,可以加倍使X光感光。,核酸标记是通过酶促反应将放射性核素(如32P等)参入到DNA或RNA分子中。由于不同研究的目的所应用的核酸分子性质不同。如RNA与DNA,大分子(1-10kb)与小分子(10-100bp),单链与双链,环状与线状分子等,核酸分子的标记方法也各不相同,但有一点是
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