香水月季类原球茎（PLBs）途径再生植株的研究

中国农业大学学报2 0 0 8 ， 1 3 ( 5 ) ： 2 9 3 4 J o u r n a l o f Ch i n a Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y 香水月季类原球茎 ( P L B s ) 途径再生植株 的研究 郭艳超 张 倩 田传卫 陈 菊 赵梁 军 ( 1 中国农业大学 农学 与生物技术 学院 ， 北京 i 0 0 1 9 3 ； 2 北京花木公 司 ， 北京 1 0 0 0 4 4 ) 摘要 以香水月季 ( Ro s a o d o r a t a) 的嫩叶为 外植 体 ， 采 用 MS基 本培养基 ， 添加不 同质量 浓度的 2 ， 4 一 D、 T DZ和 I B A， 研 究了类原球 茎再 生植株 的效果 。主要 步骤如下 ：1 ) 嫩叶在 MS +2 ， 4 - D1 0 mg L +蔗 糖 3 0 g L + G e l r i t e 3 g L培养基 上暗培养 4周， 愈 伤 组织诱 导率 达 i 0 0 ， 愈 伤 组 织上 的 类根 体 ( r h i z o i d ) 发 生率 最 高， 生成 率 可达 7 1 。2 ) 类根体在含 T D Z的培养基 ( 1 2 MS +T D Z 1 3 mg L+蔗糖 3 0 g L + G e l r i t e 3 g L ) 上 ， 分化成类原球 茎 束 ， 诱 导率达 7 1 0 ， 平均类球 茎束 为 2 1 。3 ) 类原球 茎在含 I B A的培养基 ( MS +B A 2 0 mg L+I B A 0 0 1 mg L +G A 3 0 1 mg L+蔗糖 3 0 g L+ Ge l r i t e 3 g L ) 上 ， 发 育出小植株 ， 萌发 率为 2 9 3 ； 不能萌发的类原球 茎上有 白色假珠 芽产生 。白色珠 芽可进行增 殖、 脱分化 、 再分化 出芽， 其植株 再生率为 4 6 7 。4 ) 再生苗的生根 培养基为 1 2 MS +NA A 0 2 mg L+蔗糖 3 0 g L + 琼脂 6 g L， 生根率 为 i 0 0 。5 ) 小苗经驯化后移栽到 灭菌草炭 土 ： 蛭 石( 体积 比为 1： 1 ) 基质上 ， 成活率为 9 5 。 关键词 香水月季 ；叶片 ；类根体 ；类原球 茎；假珠 芽；植株 再生 中图分 类号S 6 8 5 1 2 文章编号 1 0 0 7 4 3 3 3 ( 2 0 0 8 ) 0 5 0 0 2 9 - 0 6 文献标 志码 A Reg e n er a t i o n o f Ro s a o do r at a v i a pr o t oc or m- I i k e - bo di e s GU O Ya n c h a o ，Z HA NG Qi a n ，TI AN Ch u a n we i ，CH E N J u ，ZH AO L i a n g j u n ( 1 C o l le g e o f Ag r o n o m y a n d B io t e c h n o lo g y ，C h i n a A g r i c u lt u r a l U n i v e r s i t y ，B e i j i n g 1 0 0 1 9 3 ，C h i n a ； 2 B e ij i n g H u a mu C o mp a n y ；B e ij i n g 1 0 0 0 4 4 ，Ch i n a ) Ab s t r a c t T h i s s t u d y d e t e r mi n e d t h e p r o b a b i l i t y o f s h o o t r e g e n e r a t io n v ia P r o t o c o r m l i k e b o d i e s( P L B s )i n Ro d o r a t a Us i n g Mu r a s h i g e a n d S k o o g ( MS ) s u p p l e me n t e d wi t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t io n s 2， 4 一 d ic h I O r O p h e n O y a c e t i c a c i d ( 2， 4 一 D 0 15 mg L ) ，N p h e n y l N 一 1 ， 2， 3 - t h i a d ia z o l 一 5 一 y l u r e a ( T D Z 72 0 mg L )a n d I n d o l e 一 3 一 b u t y r i c a c i d ( I B A 0 01 0 3 mg L ) ，a d v e n t i t i o u s s h o o t s i n d u c e d f r o m f n v i t r o c u l t u r e d l e a f l e t s o f Ro d o r a t a we r e s t u d i e dT h e l e a f l e t s o f Ro d o r a t a we r e i n d u c e d f o r 4 we e k s in t h e d a r k o n t h e me d i u m MS+2， 4 一 D 1 0 mg L+s u c r o s e 3 0 g L+ Ge l r i t e 3 g L：t h e r at e o f call us f or mat i on wa s 1 O O an d t h e h i g he s t i n d uc t ion r at e o f r h i z oi d was 71 Th e n u mb er of r h i z oi d per e xp l an t wa s 3 0 ，a n d t h e a v e r a g e l e n g t h o f r h i z o i d wa s 0 4 7 c mUs i n g N p h e n y l N 一 1 ， 2， 3 - t h i a d i a z o l一 5 一 y l u r e a ( T D Z) ，r h i z o i d s we r e d if f e r e n t ia t e d i n t o p r o t o c o r m l i k e b o d ie s ，a n d t h e h ig h e s t d i f f e r e n t ia t i o n wa s 7 1 o n t h e me d i u m 1 2 MS+ T D Z 1 3 mg L + s u c r o s e 3 0 g L + Ge l r i t e 3 g L T h e n u mb e r o f P L B c l u s t e r s p e r e x p l a n t wa s 2 1 T h e o p t i mu m me d i u m t h a t i n d u c e d p r o t o c o r m l i k e b o d i e s i n t o s h o o t wa s MS+B A 2 mg L+I B A 0 01 mg L +GA 3 0 1 mg L + s u c r o s e 3 0 g L + Ge l r i t e 3 g L ， a n d t h e f r e q u e n c y o f r e g e n e r a t e d p la n t s wa s 2 9 3 Cl u s t e r s o f e p r o t o c o r m l i k e b o d ie s t h a t f ai led t o g er mi n at e i n t o s h o ot s d ev elope d i n t o ps eu d obu l bi I s Th e s e c on dar y p s eu d obulbi l s c an de ve l op f r om t h e or i g i n al p s eu d obu l bi l s Th e ps eu do bu l bi l s may b e pr ol i f er at e d an d de di f f e r en t iat e d on t h e di f f er en t i n du ct i on me di a，an d t h en u s ed t o i n du c e r eg en er at ed pl a nt sTh e r at e of r ege n er at ion was 46 7 Du r in g i n du c t i onn e w p s eu d obu l bi l s a l s o oc c u r e d T h e a p p r o p r i a t e me d i u m f o r r o o t i n g wa s MS+NA A 0 2 mg L + s u c r o s e 3 0 g L + a g a r 6 g L a n d t h e r a t e o f 收稿 13期 ：2 0 0 8 0 2 2 5 基金项 目：国家“ 8 6 3 ” 计划项 目资助( 2 o o 6 AAl O O l O 9) ； “ 十五” 国家科技攻关计划课题 资助( 2 0 0 4 B A5 2 1 B 0 2 ) 作者简介 ：郭艳超 ， 硕士研究 生 ； 赵梁军 ， 教授 ， 通讯作 者 ， 主要从事 园林植 物基因工程和细胞 工程 育种研究 ， E - ma i l ： Z h a o l j 5 0 7 3 s i n a c o m 维普资讯 3 0 中 国 农业大学 学报 2 0 0 8年 第 1 3卷 r o ot i n g was 1 0 0 -Af t e r ac cl i mat ion an d t r an s pl a n t at ion， t h e s u r vi v al r at e wa s u p t o 9 5 Th e s u i t ab l e t r a n splan t at ion ma t r i x f o r s h o o t s wa s s o d d y s o i l ：v e r mi c u l i t e ( 1 ：1 )T h e r e g e n e r a t i o n o f s h o o t s o f尺o d o r a t a ma y b e i n d u c e d b y a n e w ( 1 e a f le t s - c a l l u s - r h i z o i d P L B r e g e n e r a t e d s h o o t s ) me t h o d ，t h a t i s P L B s Ke y wo r ds尺 odo r at a； lea f let s r hiz oi d： pr ot c om l i k e b odies ps eu d obu l bil s；s h o ot r e gen er a t i on 在蔷薇属植物 中， 再生显著受基 因型影 响口 ， 仅有 个别 材料 可 以得 到 较 高 的再 生 率 ， 再 生 困 难 制 约着其基因工程育种_ 6 。因此 ， 建立一个非基因型 依赖 的、 高效的再生体 系是蔷薇属植物基 因工程育 种 迫切需 要 的 。 本实 验 室一直 在对 蔷薇 属植 物进行 种质 资源 的 收集 、 新品种的选育和研究 。在对狗蔷薇( Ro s a c a n i n a ) 、 粉 团蔷 薇 ( Rmu l t i f l o r a v a r c a t h a y e n s i s ) 和 白玉堂 ( Rmu l t i f l o r a v a r a l b o - p l e n a ) 3种 蔷 薇 属植 物 的再 生研究 过 程 中 ， 发 现 了一 种高 效 再 生 途 径 ， 首次 在蔷 薇属植 物 上提 出 了类 原球 茎 的概念 ， 简 称该途径为类原球茎再生_ 9 。这种途径在一定程度 上减 轻 了蔷薇 属植 物再 生对 基 因型 的依 赖 。 其 主要过 程如 下 ： 以叶 片为外 植体 ， 用 2 ， 4 一 D诱 导 出愈 伤和类 根体 ， 然 后再用 T DZ诱 导其分 化 出类 原 球茎 ， 最后 让类 原 球 茎 束 萌 发成 苗 。因为 每 个 叶 片 外植 体可 以诱 导 出 3 1 0根 左 右 的类 根 体 ， 每 个 类 根体 分化 出 的类 原球 茎束 可 以发 育成 3 - 5个或 者 更多的再生芽， 从而大大提高植株的再生效率。 国外 研 究发 现 ， 以蔷 薇 属植 物 的花 丝 、 花 托 、 花 瓣 、 花粉囊等为外植体 ， 在 B A和 2 ， 4 一 D的作用下也 可 以诱 导 出带 类 根体 的愈 伤 组 织l_ 】 。用 2 ， 4 一 D处 理 R h y b r i d a Ca r e f r e e Be a u t y和 R c h i n e s i s mi n i ma R e d S u n b l a z e 的叶 片和茎 段 同样可 高频诱 导 出类 根体 口 。在对 月季 品种 L i v i n E a s y 的研究 中， 用叶柄为外植体 ， 在含 2 ， 4 ， 5 一 T( 2 ， 4 ， 5 - T r i e h l o r 0 p h e n 0 x y a c e t i c ) MS培养 基 中暗培 养 4周后 ， 愈 伤 上产 生类 根体 口 引。 由此 可见 ， 在 蔷薇 属植 物 中 ， 类 根 体 的发 生 具 有 一 定 的 普 遍 性 ， 所 用 的 外 植 体 类 型 也 较 多 。但 是 ， 通过类根体诱 导出类原球 茎 ， 进而得到再生 植 株 的 报道 没 有 。T i a n C h u a n we i l 9 首 次 提 出 了蔷 薇 属植物的类原球 茎再 生途径 ， 该途 径具有 潜在 的 高 再 生率 。 香水 月季 ( R o d o r a t a ) 是月 季 ( Rc h i n e n s i s ) 与 巨花 蔷 薇 ( Rg i g a n t e a) 天 然 杂 交 种 ， 是 现 代 月 季 形成 的重要种质 ， 香水月季花芳香浓郁 ， 具有极高的 应用价值_ 】 。 本 实 验 以 香 水 月 季 为 试 材 ， 按 照 Ti a n C h u a n we i 的研 究方法 对其 通 过类原 球茎 再 生进 行研 究 。 一 方 面 验证 香 水 月 季 通过 P L B s途径 再 生 的可 能 ， 另 一方 面 为香水 月季 利用外 源 基 因进 行遗 传 改 良建 立 了一 个 良好 的再生 技术 平 台 。 1 材料 与方法 1 1 试 验 材料 中 国农 业 大学观 赏植 物试 验 圃保 存 的香水 月 季 ( Ro d o r a t a ) 植 株 。 1 2 方法 1 2 1 香水月季无菌快繁体 系的建立 外植 体灭 菌 方法 参考 文献 口 引。2 0 0 7年 5月上 旬 ， 剪取香 水 月 季 当年生枝 条 的 中上 部 ， 去除 叶和刺 ， 用低 浓度 的洗 衣 粉水 洗 去枝 条表 面 的附着物 ， 然 后剪成 6 c m 左 右 的茎 段 ， 用 流水 冲洗 1 0 mi n ， 再 剪成 单 芽 茎段 ， 放入 灭 菌 的塑 料 瓶 里 。在 超 净 工 作 台里 ， 用 7 0 mg mL 的酒精处理 3 0 S ， 无菌水冲洗 2 3次 ， 接着用 0 1 mg mL的升汞 处理 7 mi n ， 无 菌水 冲洗 2 3次 ， 接 种 到 MS 十6 - B A0 5 r n g L + NAA0 1 r n g L培 养 基 上光 照培养 。1 周 后 ， 腋 芽 开始 萌 发 ， 芽 体 开 始 膨 大 、 伸长 、 展 叶 。将 萌发 的新 芽切 下置 于增殖 培养 基 MS 十 6 - B A0 8 r n g L 十 NAA0 0 5 r n g L 上 ， 每 4 周继代 1次。增值系数可以达到 2 4倍。 1 2 2 愈 伤及 类根 体 诱 导取 无菌 苗的 顶生 幼叶 ， 将 叶背 朝 下 分 别 接 种 于 含 0 1 、 0 5 、 1 0 、 1 5 、 2 0 、 2 5 、 3 0和 5 0 r n g L 的生 长 素 类 物 质 2 ， 4 一 D 的 MS培养基 上 行 暗 培 养 。每 个 处 理 接 种 2 0个 外 植 体 ， 5次重 复 。设 无 菌 水 为 对 照 。接 种 4周 后 统 计 叶片愈伤诱导率、 类根体发生率及平均类根体数。 1 2 3 TD Z对 类原球 茎发 生的 影响 将 带 有类 根 体 的愈伤转入 1 2 MS ( 无机盐减半) ， 并在分别添加 7 、 1 1 、 1 3 、 1 5 、 1 7和 2 0 r n g L 的 细 胞 分 裂 素 类 物 质 T DZ的培 养基 上 进 行 培 养 。每 处 理 接 种 8个 外 植 体 ， 3次重复。4周后统计类类原球茎束 生成率 及 平均 类 原球茎 束数 。 1 2 4 I B A 浓度 对 类 原球 茎分 化 的 影 响 将 带有 类原 球 茎 愈 伤转 入 添 加 6 - B A( 2 rag L ) 、 I B A( 0 0 1 维普资讯 第 5 期 郭艳超 等 ：香水 月季类原球茎 ( P L B s ) 途径再生植株 的研究 O 3 0 rag L ) 、 GA ( 0 1 rag L ) 的 MS培养基 上 进 行光 照培 养 。每个 处 理接种 8个外 植 体 ， 3次 重 复 。 4周后统计类原球茎束上发生不定芽的数量 。 1 2 5 假 珠 芽的增 殖 、 脱 分化 及再 生在诱 导 不定 芽过 程 中会产生 假 珠 芽 ， 而且 假 珠 芽 的上 面 还 会 发 生二 次假 珠芽 。将假 珠芽 接种 到增 殖培 养基 上光 照 培养 、 脱分 化培 养基 暗培养 ， 然 后把 假珠 芽脱 分化 形 成 的愈伤 组织接 人 小植 株 诱 导 培 养 基 光 照 培 养 ， 诱 导不 定 芽 。 培 养 基 中 的 激 素 种 类 及 含 量 参 照 文 献 。每个处 理 接种 1 O个外植 体 ， 3次 重 复 。4周 后统 计发生 不定 芽 的数 量 。 1 2 6 再 生植株 的增 殖 、 生根及 移植将再生 苗 移 至增 殖培养基 上 培 养 ， 将生 长健 壮 的小 苗 移 至 生 根 培养基上 ， 将长根 的再生植株炼苗后移植于无菌基 质 中 ， 草 炭 土 和蛭 石 的体 积 比为 1： 1 ， 置 于 光 照 培 养箱 中驯化 培养 。 1 2 7 培 养 条 件及 数 据 处理 本 实 验 均 采 用 MS 培养基 ， 除 特别 说 明 外 均 以蔗 糖 为 碳 源 ， 添 加 量 为 3 0 g L； 快 繁及 生根 培 养基 所 用 凝胶 为 6 g L琼 脂 ， 再生培养基用 3 g L G e l r i t e ； p H5 9 。培养条件为 ( 2 5 - + -_2 ) 、 光 子 量 照 度 为 5 0 t mo l ( m。 s ) 、 光 周 期 为 1 6 h光 8 h暗 。 实验 采用 随机 区组设 计 ， 实验数 据 采用 S AS统 计 软 件进 行分 析 。 2结 果 与 分 析 2 1 不 同质 量浓 度 2 ， 4 - D 对 愈伤 及 类 根体 诱 导 的 影 响 将 叶 片 接 种 在 不 含 2 ， 4 一 D 的 培 养 基 上 不 能 产 生愈伤， 而在含不 同质量浓度 2 ， 4 一 D 的 MS培养基 上均能产生愈伤 ， 愈伤诱导率达到 了 1 0 0 。叶片 在接 种 5 d后 ， 小 叶 切 口处 开 始 膨 大 ， 继 而 产 生 愈 伤 ， 愈 伤 的颜色 为 黄 褐 色 、 湿 润 、 水 浸状 。1 0 d左 右 愈 伤上 开 始 出现 白色类 根体 ， 随着培 养 时 间的延 长 ， 类 根体 数 目增 多并 且长 度增 加 。类 根体 上 附有大 量 纤 毛状 物 。暗培 时 间超 过 3 5 d后 ， 愈 伤 组织 颜 色 褐 色 加深 ， 类 根体 的数 量 和长度 不 再增 加 ， 颜 色 也开 始 转 褐 。类 根体 的平 均 长度在 0 2 0 5 c m 之 间 。本 试 验得 到 的类根 体 生 长 没 有极 性 ， 类 根 体 上 附 有大 量的纤毛状物 ， 这与组培苗的根有一定 区别。 试验 结果 表 明 ， 在 2 ， 4 - DI 0 mg L 培养基 上类 根体生成率达 到最高 ， 为 7 1 ， 平 均类根体数 为 3 个 。从数 据 可 以看 出 ， 类 根 体 的 发 生受 2 ， 4 一 D质 量 浓度 的影 响 较大 。试 验 范 围 内 ， 低 浓度 促 进 类 根 体 的发生、 高浓度抑制类根体 的发生 ， 并且类根体的长 度 明显变 短 ( 表 1 ) 。 表 1 2 ， 4 - D质量浓 度对 香水月季叶片愈伤分化及 类根体 生成的影响 Ta bl e 1 Ef f e c t of 2 4 一 D c on c e nt r a t i o ns o n s t i mul a t i o n o f r hi z oi d a n d c a l l us i ndu c t i on f r om l e a f e xp l a n t s of Ro do r at a 体数 类 总数 类根体的 平 均长度c m O O 47 a O 3 2 b 0 25 c b O 21 C O 2 O C O2 O C O 20 C O 20 C 注 ： 所 有数据 为暗培养 4周后的统计值 ， 表中字母表示显著水平为 P0 0 5 。下 同。 2 2 T D Z对类根体分化的影响 将带类根体 的愈伤转到含不 同质量浓度 TD Z 的培养 基上 进行 光照 培养 ， TD Z的浓度 梯 度 根 据本 实验室的前期研究结果设定。在不含 T D Z的培养 基 上 类根 体不 能分 化成 类 原球 茎 ， 并 逐 渐褐 化死 亡 ； 类 根 体在 含 TD Z 的培 养 基 上 培 养 1 0 d后 ， 其 顶 部 由 白色变 为黄 绿色 并 开 始 膨 大 ， 逐 渐 分 化 成 带 有 大 量 突起 结构 的类 原球 茎 束 ( 图 1 a 、 b ) 。 h h k d 6 2 O 3 7 2 3 6 O L文 L a C C b a b d d e e O O O O O O O O 强 & O 1 5 2 8 9 2 4 3 7 1 1 2 1 7 1 2 2 1 1 0 “ 0 0 1 5 O 5 O 5 O O O L L 维普资讯 3 2 中 国 农 业 大 学 学 报 2 0 0 8年 第 1 3卷 T DZ对类根体分化成类原球茎束起 重要 作用 ( 表 2 ) ， 随着 TD Z浓度加 大， 类根体分 化成类 原球 茎束 的数量增 加 ， 在 T D Z质 量 浓度 为 1 3 mg L时 ， 类 原球 茎束 的发 生 率 达 到 最 高 ， 为 7 1 ， 平 均 类 原 球 茎束 数 为 2 1 个 。当 T DZ的质量 浓 度 进 一步 加 大时 ， 类根体分化成类原球茎束的数量呈下降趋势。 a 类 根体顶端膨大变绿发育成类原球茎 ； b 类 原球茎；c 类原球茎萌发 出芽 ； d 再生植株 ；e 愈伤化的类原球茎 ；f 假珠 芽的出现及发育 ；g 假珠芽的增殖 ； h 假珠芽上的二次假珠芽 ( 箭头所指) ；i 脱分化的假珠芽再生出芽( 箭头所 指) 。 图 1 香水月季通过类原球茎途径再生 过程 Fi g1 Pl a nt r e ge n e r a t i o n of R o dor at a vi a PLB 表 2 T D Z浓度对香水月季类根体分化成 类原球 茎束的影响 Tab l e 2 Ef f e c t of TDZ c o nc e n t r a t i on on d i f f e r e nt i a t i on of r hi z oi d o f Ro dor at a T Dz质量浓度 外植体数 ( rag L) 产生类原球茎 的外植 体数 类原球 茎束数 类原球茎束 生成 率 平均类原 球茎束数 O 7 11 13 15 1 7 2 O O 6 9 1 7 1 1 1 1 3 O 8 1 8 3 5 21 1 8 3 O 2 5 3 b 37 7 ba O O 8 a 2 3 a 2 1 a 1 8 a 1 6 a O 7 a 2 3 I B A浓 度对 类原 球 茎分化 的 影响 4周后将带类原球茎束的愈伤转接到萌发培养 基上进行芽的诱导 。I B A 的浓度影响类原球茎束的 萌发( 表 3 ) ， 在较低 的浓度下 ， 有的类原球茎束上的 a a a b b b O O O 7 1 6 6 2 7 4 4 1 0 维普资讯 第 5期 郭艳超等 ：香水月季类 原球 茎( P L B s ) 途径再 生植株的研究 突起 可 以逐 渐萌 发形 成 正常 的再 生植株 ( 图 1 c 、d ) ； 随着 I B A浓 度 的 加 大 ， 类 原 球 茎 束 会 逐 渐 愈 伤 化 ， 形成 胚性 愈伤组 织 ， 愈 伤 组 织 上 会 有 白色 假 珠 芽 出 现 ( 图 1 e 、 f ) 。结 果 表 明 ， 当 I B A 的 浓 度 为 0 0 1 mg L时 ， 类原 球茎 的 萌发率 达 到最大 ， 为 2 9 3 。 表 3 I B A的浓度对香水 月季 类原 球茎分化的影响 Ta b l e 3 Ef f e c t of di f f e r e nt c o nc e n t r a t i on s o f I BA o n di f f e r e nt i a t i o n o f PLB o f Ro dor at a 2 4 假 珠 芽的增 殖 、 脱 分化 及植 株再 生 将愈伤化 的类原球茎 束 ( 带愈伤组织 ) 转 到含 0 1 mg L G A 、 以麦 芽 糖 为 碳 源 的 1 2 MS培养 基 上进行光照培养 ， 可诱导出 白色假珠芽 ( 图 1 g ) ， 假 珠芽的发生率为 6 O 左右 。随培养 时间的延 长， 假 珠芽大量发生( 图 1 g ) ， 并在假珠芽上产生二次假珠 芽 ( 图 1 h ) ； 另 外 ， 在 培 养 过 程 中 有 畸 形 芽 的 出现 ， 畸形 芽 上也 会产 生假 珠 芽 。在该 培养 基 上 只有 极 少 假珠芽分化成正常植株 。 把 假珠芽转 到分别含 2 ， 4 一 D和 T D Z的 MS或 1 2 MS培养 基上进行 暗培养 ， 1 周 左右 后假 珠芽 表 面 即 开始膨 大并 愈 伤 化 ( 表 4 ) 。在 暗 培 养 过程 中会 有 白 化苗 出现 ， 另 外 还 会 有新 的 假珠 芽 出现 ( 图 1 i ) 。暗 培 4 周后， 假珠芽的脱分化率可以达到 7 5 左右。 表 4 不 同激素对 香水月季假珠芽愈伤化 的影响 Ta bl e 4 Ef f e c t of di f f e r e nt pl a nt gr owt h r e gul a t or s on di f f e r e n t i a t i on of ps e u do bul bi l s of Ro do r a t a 把假珠芽在不同脱分化处理下形成 的愈伤组织 分别接到 4种再生培养基 上培养( 表 5 ) ， 进行小植 株的诱 导 。其 中 以 T D Z暗 培 养后 形 成 的假 珠 芽 愈 伤组织在萌发培养基上萌发状态最好 ， 愈伤组织颜 色翠 绿 、 上 面有大 量 芽点 ， 诱 导 出的小 植株 健壮 。在 再生培养基上 ， 再生植株的诱 导情况没有显著差异 ( 表 5 ) ， 随着 培养 时间 的延 长 ， 愈 伤组 织 上 还会 出现 假珠芽 ， 并且数量逐渐增多。 表 5激素组合对香水月季假珠 芽愈伤化后小植株诱导 的影 响 Tab l e 5 Ef f e c t o f di f f e r e nt c o mbi n a t ions a n d c onc e n t r a t i on s of p l a nt g r o wt h r e gul a t or s o n t h e r e g e n e r a t i o n o f Ro d o r a t a mg L 激 素 种 类 BA I BA NAA GA 再生植株 数 再生苗出现率 2 O 2 O 3 0 O O 0 01 0 01 O O O1 0 0 O 01 0 1 0 1 0 1 1 3 1 4 7 1 6 43 3 a 46 7 a 23 3 a 53 3 a 2 5 再 生 苗的增 值和 生根 移栽 将类原球茎束萌发的再生植株及假珠芽再生植 株转 入增殖 培养 基 上 进行 增殖 培 养 ， 然 后 将 生 长 健 壮的小 苗转 移 到含 NAA( O 1 、 0 2和 0 5 mg L) 的 1 2 MS培养基上进行生根培养 。在 NAA 0 2 mg L时 生 根 率 达 1 0 0 ， 生 根 数 多 达 6 1 2根 ， 根 粗 壮 、 白褐 色 ， 未 见 须根 。再 生植株 炼 苗 1 周 后 移栽 到 V( 草炭土)： V( 蛭石) 为 1：1混合 后的灭 菌基 质 中， 并置于 HP G一 4 0 0 H 光照培养箱 中， 光 照强度 为 1 O l x 、 光 照 时间 1 4 h 、 昼 夜 温 度 2 1 1 6 、 相 对 湿 度 6 O ， 成 活率 达 9 5 ， 植株 健 壮 。 3 讨 论 本试验以香水月季的无菌叶片为外植体 ， 在 2 ， 4 一 D的作用下 ， 高频诱导出类根体， 本试验支持了前 人 的研究 结论 ， 同 时 也 证 实 了香 水 月 季 可 以按 照 T i a n C h u a n we i 的方法 通 过类 原球 茎 ( P L B s ) 直 接萌发得到再生植株 。另外 ， 在实验过程 中发现 ， 香 维普资讯 中 国 农业大 学学报 2 0 0 8年 第 1 3 卷 水月季也可以通过假珠芽得到 间接再生植株 ， 再生 率较高。 蔷薇属植物通过类 原球 茎再 生植株 的报道极 少 ， 该 途径 的相 关 过 程 有待 进 一 步 研 究 。通 过类 原 球茎再 生植 株具 有 潜 在 的高 效 性 ， 在 一 定 程 度上 减 轻了蔷薇属植物再生对基因型的依赖。这对蔷薇属 植 物 的再 生和 以后 的研 究 具有很 重要 的意义 。 假 珠 芽 在 柑 橘 、 山 茶 属 植 物 的 研 究 中 出 现 较 多L 1 。 ， 研 究认 为假 珠 芽 是胚 状体 发 育 受 阻后 形 成 的没有 芽 原基 只有根 原基 以及 只有 不健全 的维 管组 织 的特 殊 结 构 。假 珠 芽 多 为 黄 色 、 黄 白色 ， 表 面 光 滑 ， 多近球形 、 拳头形 以及 云耳形 、 瘤状等。假珠芽 的分化能力很强 ， 经不同激素诱导可以生根 、 分化胚 状 体及 丛生 芽 ， 增 长迅 速_ 1 。 在 蔷薇 属 植 物 上 ， 正 常发 育 的子 叶数 为 2 。在 通过体细胞胚途径诱导体胚萌发时 ， 子叶数 目变异 很大 ” 。高丽萍等人以月季 萨蔓莎 的组培苗 叶片为外植体诱导 出假珠芽 ， 脱分化后得到生活 力强、 可长期继代 的愈伤组织 ， 再生出植株 ； 田传卫 等人在 多 花蔷 薇 上 以子 叶 为外 植体 诱 导 出假 珠 芽 2 ， 建立 了再 生 体系 。 从 有关 文献 报 道可 以看 出 ， 蔷 薇 属植 物离 体 培 养过程中出现的这种非正常子叶应为假珠芽 ， 其可 以做为材料进一步诱导出体细胞胚。 1 2 3 4 5 6 参 考 文 献 张常青 ， 洪波 ， 王海琴 ， 等地被月季 R o y a l B a s s i n o 高 频再生体系的建立 J 园艺学报 ， 2 0 0 5 ， 3 2 ( 6 ) ：1 0 6 5 1 O6 9 任 桂芳 ， 王建红 ， 冯慧， 等现 代月 季( R o s a h y b r i d a ) 叶 片植株 再生 体 系 的建立 J 园艺 学 报 ， 2 0 0 4 ， 3 1 ( 4 ) ： 5 33 5 36 Hi c k s G S S ho ot i ndu c t i on a nd o r g a no ge n e s i s v i t r o ： a d e v e l o p me n t a l p e r s p e c t i v e J I n v i t r o C e l l u l a r a n d De v e l o pme nt a l Bi ol ogy，1 9 94，3 0： 1 0 1 5 Ronc hi V N Or ga n og e ne s i s a nd e mbr y o ge n e s i s：ge n e t i c a n d p h y s i o l o g i c a l a p p r o a c h e s J Ac t a Ho r t i c u l t ur e，19 9 0，28 0： 1 一 i 0 W a r r e n G The r e ge ne r a t i on o f p l a n t s f r o m c u l t ur e d c e l l s a n d t i s s u e s M S t a f f o r d A，Wa r r e n G， e d s Pl an t Ce l l a nd Ti s s u e Cul t ur e M i l t o n： 0pe n Uni ve r s i t y Pr e s s ，1 99 1，82 1 0 0 L i X Q，Kr a s n y a n s k i S F，Ko r b a n S S S o ma t i c e m一 7 8 9 1 O 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 O br y o ge n e s i s， s e c o nd a r y s oma t i c e mbr y og e ne s i s a nd s h o o t o r g a n o g e n e s i s i n R o s a J J o u r n a l o f P l a n t Phy s i ol og y，2 00 2，1 5 9： 31 3 31 9 C a s t i l l 6 n J ， Ka mo KMa t u r a t i o n a n d c o n v e r s i o n o f s o ma t i c e mbr y os o f t hr e e ge n et i c al l y di v er s e r os e c ul t i v a r s J Ho r t s c i e n c e ，2 0 0 2 ， 3 7 ： 9 7 3 9 7 7 高莉萍 ， 包满珠 月季 萨蔓莎 愈伤组织 的诱 导及植株 再生 J 园艺学报 ， 2 0 0 5 ， 3 2 ( 3 ) ： 5 3 4 5 3 6 Ti a n C h u a n - we i ，Z h a o L i a n g j u n P l a n t r e g e n e r a t i o n t h r o u g h p r o t o c o r m l i k e b o d y( P LB)i n d u c e d f r o m r h i z o i d s u s i n g l e a f e x p l a n t s o f Ro s a s p p J P l a n t C e l l Re po r t ， 2 008， 27： 8 23 83 1 Ar e ne L，Pel l e gr i n o C