高中生物核心概念高考复习课件-PCR技术.ppt

2019/12/3,PCR技术（聚合酶链式反应）,DNA的体内复制基本过程,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,DNA的体内复制基本过程,GGAUCG,5,AUCGCG,5,3,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA的体内复制基本过程,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E.coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪,KaryB.Mullis,1989年美国Science杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,穆利斯荣获1993年度诺贝尔化学奖。,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus),酶活性(%),温度(),405060708090100,10080604020,72,94,55,PCR循环,一、PCR的基本原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR技术原理和基本操作,Taq,P1,P2,PCR反应体系,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+,模板：DNA引物：P1P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+,PCR技术的反应条件,DenaturetemplateDNAbyheat(95oC),TargetSequence,TargetSequence,模板DNA的变性：模板DNA经加热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCRCycle-Step1,PCRCycle-Step2Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences,TargetSequence,TargetSequence,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated,TargetSequence,TargetSequence,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,TaqDNAPolymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA互补链。,3,Endofthe1stPCRCycleResultsintwocopiesoftargetsequence,TargetSequence,TargetSequence,每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,TargetAmplification,No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824,1cycle=2Amplicon,2cycle=4Amplicon,3cycle=8Amplicon,4cycle=16Amplicon,5cycle=32Amplicon,6cycle=64Amplicon,7cycle=128Amplicon,2019/12/3,18,1缓冲液,10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可有添加剂、共溶剂等。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。,二、有关PCR反应体系常识,2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。,3、引物使用浓度为0.1-0.5mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配。,2019/12/3,19,4、模板单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。,5、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有53聚合酶和53外切酶活性。常用的有：1）TaqDNA聚合酶2）TthDNA聚合酶3）VentDNA聚合酶4）PwoDNA聚合酶5）PfuDNA聚合酶6）混合DNA聚合酶。,2019/12/3,20,PCR引物的设计一般原则引物长度一般以1830bp为宜，过短降低特异性，过长会引起退火时结合的模板数减少，降低反应效率。解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，两条引物间的Tm值越接近越好。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构。引物3端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能。要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。引物5末端碱基可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其它序列均应无明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。,2019/12/3,21,三、PCR反应程序1、常规程序：94左右预变性几十秒至几分钟；94左右变性10秒至1分钟；50-65左右退火30秒至1分钟；20-35个循环72左右延伸30秒至几分钟；72左右最后延伸和加尾3-10分钟；4-25保持3分钟或更长。2、退火和延伸温度：退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。,2019/12/3,22,3、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时间长，简单模板时间短，复杂模板时间长。退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短，引物结构差的退火时间宜长。延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数,PCR操作（录像）,PCR中其它注意的事项,1.防止污染试剂小量分装吸头及EP管(离心管)一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作2.设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板、无模板试剂对照：除模板外的所有组分,PCR应用举例,1、在PCR产物两端添加限制性酶切位点在PCR引物的5加上根据需要而设计的酶切位点，PCR产物内部无该切点。在酶切位点的5加3个左右的保护碱基，其数目多少取决该酶的性质。PCR产物经电泳回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。,2019/12/3,35,2、TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活性，通常在其产物DNA分子每条链的3末端加上一个突出的A。T载体：通过特定制作技术制作的在多克隆位点中间已开环的质粒载体，其每条链的3末端具有一个突出的T。TA克隆：将3末端具一个突出的A的PCR产物与T载体连接重组，转化大肠杆菌，对鉴定为阳性的重组克隆子的多克隆位点区的插入片段进行测序，然后再亚克隆到其它载体进行功能研究等。,3、反向PCR(reversePCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,4、利用接头的PCR/锚定PCR(anchoredPCR),将基因组总DNA用限制酶切割，然后将序列已知的接头连接到酶切片段的两端，以提供PCR的锚定引物，该锚定引物与已知序列中的基因特异引物组合后，用于目标基因侧翼序列的扩增。为了减少锚定引物与锚定引物之间组合后构成的非特异扩增，可以将接头替换为一端平、另一端为5突变的结构，且对3凹陷的碱基实行亚氨基修饰。,5