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文档简介

重组DNA转化宿主细胞,实验原理,转化是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。受体细胞在完成转化的过程中必须处于感受态。大肠杆菌感受态细胞有多种制备方法。目前，最常用的方法是CaCl2处理法。感受态细胞经过转化后，就成为转化细胞，也可以被称为转化子。也就是带有异源DNA分子的受体细胞。,实验原理,DNA分子转化进入受体菌的过程如下：吸附完整的DNA分子吸附在受体菌的表面；转入双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一条链降解；自稳外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；表达供体基因随同复制子同时复制，并被转录转译。,实验原理,本实验用的载体DNA为质粒pUC19，内含氨苄青霉素（Amp）的抗性基因（Ampr基因），经过转化的大肠杆菌能在含有Amp的平板上生长，说明转化成功。pUC19质粒还可导致受体菌产生-互补现象，在含有IPTG和X-gal的平板上形成蓝色菌落。外源基因的插入破坏-互补作用，在同样的平板上形成白色菌落。,实验原理,IPTG：Isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside；异丙基-D-硫代半乳糖苷X-gal：5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside；5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,实验原理,实验原理,操作步骤,取三个1.5mL离心管，各加入100L大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。往1管中加入2LpUC19质粒；其余两管各加入5L连接物（上周所做），加入后反复吹吸几次混匀，冰浴60min。离心管在42C水浴放置100s后立刻冰浴2min。加入1mLLB培养基，混合后37C水浴45min，期间每隔15min左右反复颠倒离心管几次。12000rpm离心30s。吸去大部分上清，残留100L左右，再用枪头反复吹吸，使之成为细胞悬液，涂布在平板上。平板37倒置培养12-16hr，挑选不产蓝色色素的白色单菌落，初步确定为所需转化子。,操作步骤,平板的准备：熔化LB固体培养基，每100mL中添加100mg/mLAMP100L、48mg/mLIPTG100L、20mg/mLX-gal200L。铺制平板三块。,注意事项,注意无菌操作，避免染菌。注意用火安全。Amp溶液解冻后会有沉淀，稍稍加热使沉淀溶化才可使用。严格控制热激活温度和时间。,思考题,转化后，
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