（临床兽医学专业论文）河蚌多糖的生物学活性研究.pdf

中文摘要摘要为深入研究淡水贝类活性多糖的生物学功能和使用价值，本研究选用淡水河蚌翻阳击 f 西作为提取多糖的试验原料，主要研究以下四个部分1 河蚌多糖( a n o d o n t ap o l y s a c c h a r i d e sa p s ) 提取工艺条件的优化目的：本研究对河蚌多糖的提取条件进行优化方法：选定提取温度提取时间、料液比，提取次数作为主要影响因素，以总糖含量为指标筛选影响河蚌多糖的提取因素。在单因素试验基础上进行三因素三水平的正交试验优化提取河蚌多糖工艺条件结果：影响总糖得率的因素先后顺序为：提取温度 漫提时问料液比最优工艺条件为：浸提时间2h ，提取温度为9 0 c 料液比为1 9 0 2 河蚌多糖( a p s ) 的分离纯化目的：本研究对河蚌粗多糖对进行分离和纯化方法：河蚌粗多糖经s e v a g法去除游离蛋白，透析，冷冻干燥，过d e 5 2 纤维柱和s e p h a d e xg ，2 0 0 ，用u v分光光光度计扫描，高效液相色谱( h p l c ) 及示差检测器检测纯度检测分离效果结果：河蚌粗多糖可分离得a p s i 和a p s i i 两种多糖，在2 6 0n m 和2 8 0 n m均无核酸和蛋白质吸收峰；a p si 为一个峰，a p si i 为一大峰和一小峰方法：应用高速逆流色谱( h s c c c ) 对河蚌粗多糖的纯化，结果：以1 2 5 聚乙二醇( p e g ) 1 0 0 0 与1 6 磷酸钾缓冲溶液( p h6 8 ) 组成的水性二相系统，在高速逆流色谱仪上能成功地分离出多糖3 河蚌多糖( a p s ) 生物学功能研究3 1河绊多糖( a p s ) 的体外抗氧化作用目的：为研究河蚌多糖的体外抗氧化作用方法：应用河蚌多糖体外对羟自由基( + o h ) 和超氧阴离子( 0 2 。) 的清除，抑制h 2 0 2 诱导小鼠红细胞氧化溶血的影响，抗肝组织自发性脂质过氧化作用及总抗氧化能力等方法来研究河蚌粗多糖抗氧化活性结果：河蚌多糖对氧损伤的抑制作用均表现量效关系结论：河蚌粗多糖具有明显的体外抗氧化作用3 2 河蚌多糖( a p s ) 对罗非鱼免疫功能和抗氧化性能的影响目的：为研究河蚌多糖对罗非鱼免疫功能及抗氧性能影响方法：在罗非鱼中文摘要基础饲料的基础上添加河蚌多糖o 5 、1 o ，1 5 和2 o 连续饲喂2 1d ，分别于第7 1 4 2 1d 采血检测鱼血清中的免疫指标( l y s 、a k p ，a c p ) 及肝脏m p o ，抗氧化指标( m d a 、s o d ，g s h p x ) 结果：各添加组的免疫指标，抗氧化指标与对照组相比，差异显著( p 0 0 5 ) 结论：在罗非鱼饲料中添加o 5 一2 的河蚌粗多糖可明显增强罗非鱼的免疫性能和抗氧化能力3 3a p si 对罗非鱼外周血淋巴细胞增殖的影响目的：为研究纯化的河蚌多糖a p si 生物学功能方法：在罗非鱼外周血淋巴细胞体外培养体系中，添加a p sio 1m g m l ，lm g m l 和2m g m l ，观察其对罗j # 鱼外周血淋巴细胞增殖的影响结果：河蚌多糖a p si 添加组的淋巴细胞增殖的效果与对照组相比差异极显著( p 0 0 5 ) 结论：纯化的河蚌多糖可极显著增加罗非鱼外周血淋巴细胞活性的作用4a p si 的组成和结构的初步研究目的：为研究a p si 的组成和结构方法：通过薄层层析，元素分析仪，红外光谱仪h p i c 、1 h - n m r 及”c n m r 对a p si 进行分析结果：a p si 仅为葡萄糖组成的，不舍n 元素和硫酸根离子，c ，h 含量比值为6 ：l ，糖苷键的连接方式主要是d 糖苷键，同时存在不同连接方式的a 糖苷键，可能存在a g l cc l 一4 ) 一和d g i c c l 4 ) 一连接方式结论：a p s i 的是一个单纯的多糖化合物，连接方式比较复杂的多糖关键词：河蚌多糖；多糖提取；h s c c c ；多糖生物学活性；多糖结构，墨墨塑墨：s t u d i e s0 1 1b i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fp o l y s a c c h ar d e sf r o ma n o d o n t aa b s t r a c ti no r d e rt os t u d yb i o l o g i c a lp r o p e r t i e sa n dv a l u eo fp o l y s a c e h a r i d sf r o mf r e s h w a t e rm o l l u s c i nt h i sp a p e r , t h ep o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t e df r o ma n o d o n t ah a v eb e e nr e s e a r c h e db yt h ef o l l o w i n gf o u rs t e p s p a r t1t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so f e x t r a c t i n gp o l y s a c e h a r i d e sf r o ma n o d o n t ad u r i n gt h ee x t r a c t i n gp r o c e s s ，f o u rm a j o re x p e r i m e n tf a c t o r sw e r es e l e c t e di ns i n g l ef a c t o ra n a l y s i sm e t h o dw i t ht o t a ls u g a r sb yt h ep h e n o l s u l f u r i ca c i dm e t h o da st h es t a n d a r d ，i n c l u d i n gt h ee x t r a c t i o nt i m e ，t h ee x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ，t h er a t i oo fm a t e r i a lt ol i q u i da n de x t r a c t i o nt i m e s w i t ht h ea b o v ec o n d i t i o n s ，t h eo p t i m a lp r o c e s s i n gc o n d i t i o n sf o rp o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t i o na r eo b t a i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa sf o l l o w s ：t h ee x t r a c t i o nt i m ei s2h ，t h ee x t r a c t i o nt e m p e r a t u r ei s9 0 ( 2a n dt h er a t i oo f m a t e r i a lt ol i q u i di s1 9 0 p a r t2t h ei s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f a n o d o n t ap o l y s a c e h a r i d e s ( a p s )t h ef r e ep r o t e i nw i l lb ew i p e do f f f r o mc r u d ep o l y s a c c h a r i d e sb ys e v a gm e t h o d a n dt h e na f t e rt h ep r o c e s so fd i a l y z i n ga n dl y o p h i l i z a t i o n t h ep o l y s a c c h a r i d e sa r ef u r t h e rp r o c e s s e db yd e ，5 2i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a d e xg 2 0 0t oo b t a i nt w ok i n d so f p o l y s a c c h a r i d e sa p sia n da p s1 i b yu s i n gt h eu v - s p e c t r u m ，i ti sf o u n dt h a tt h e r ea r en oa b s o r p t i o np e a k so fp r o t e i na n dn u c l e i ca c i da t2 8 0n ma n d2 6 0n m a p sia n da p si ia r ct e s t e db yh p l cf o rp u r i f i c a t i o nt os h o wt h a ta p sih a so n l yo n es y m m e t r yp e a ka n da p s1 1h a st w op e a k s t h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e sw e r es u c c e s s f u l l ys e p a r a t e db yu s i n gaa q u e o u st w o - p h a s es y s t e mw i t ho f1 2 ，5 p o l y e t h y l e n eg l y c o l1 0 0 0a n d1 6 d i b a s i cp o t a s s i u mp h o s p h a t eb u f f e r ( p h 6 8 ) w i t hh s c c c c o n c l u s i o n ：i ti se n t i r e l yp o s s i b l et os e p a r a t ea n dp u r i f yt h ep o l y s a c c h a r i d e sf r o mc r u d ep o l y s a c c h a r i d e si na na p u e o u st w o - p h a s es y s t e mu s i n gh s c c c i n英文摘要p a n3t h eb i o a c t i v i t i e so fa p s3 1a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f a n o d o n t ap o l y s a c e h a r i d e si nv i t r oi n t h i sr e s e a r c h ，t h ea n t i o x i d a n tp r o p e r t i e so ft h ew a t e r - s o l u b l ea p sw e r ee v a l u a t e db yd e t e r m i n i n gt h ea b i l i t yo faa p ss o l u t i o nt os c a v e n g eh y d r o x y la n ds u p e r o x i d er a d i c a l s ，i n h i b i tt h el e v e lo fl i p i dp e r o x i d a t i o na n dh e m o l y s eo fm o u s ei n d u c e db yh y d r o g e np e r o x i d ea sw e l la st h et o t a la n t i o x i d a t i o na b i l i t y i nt h ea b o v ee x p e r i m e n t s ，t h ea p si n h i b i to x i d a t i v ed a m a g ei nad o s e d e p e n d e n tm a n n e ra n de x h i b i ta n t i o x i d a n ta c t i v i t y ,3 2e f f e c t so fa p st oi m m u n o s “m u l a t i n ga c t i v i t ya n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fo r e o c h r o m i sn i l o r i e z c si no r d e rt os t u d ye f f e c t so fa p st oi m m u n o s t i m u i a t i n ga c t i v i t ya n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fo r e o c h r o m i sn i l o r i c z c s ，o r e o c h r o m i sn i l o r i c z c s w e r ef e dw i t hf o r m u l a t e dd i e ts u p p l e m e n tw i t h0 5 ，1 。0 ，1 5 ，2 0 a p sr u n n i n gf o r2 1 d s i m m u n i t yi n d e x e s( l y s ，a k p , a c p , m p o ) a n da n t i o x i d a n ti n d e x e s ( m d a ，s o d ，g s h p x ) a r ea n a l y z e do nt h ed a yo f7 t h 。1 4 ma n d2 1 l l lr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta p se n h a n c e dt h ei m m u n i t ya n da n t i o x i d a t i o no fo r e o c h r o m i sn i l o r i c z c ss i g n i f i c a n tc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) ，d i e t ss u p p l e m e n t a t i o nw i t hd i f f e r e n ta p sn os i g n i f i c a n te f f e c t sw e r eo b s e r v e d i nc o n c l u s i o n f e e ds u p p l e m e n t e d sw i t h0 5 。2 a p sc o u l di m p r o v ei m m u n i t yf u n c t i o na n da n t i o x i d a n ta b i l i t yo f o r e o c h r o m i sn i l o r i e z c s 3 3t h ee f f e c to fa p sit op r o l i f e r a t el y m p h o c y t e so fp e r i p h e r a lb l o o df r o mo r e o c h r o m i sn i l o r i c z c s l y m p h o c y t e sc o u l db ei s o l a t e df r o mp e r i p h e r a lb l o o do fo r e o c h r o m i sn i l o r i c z c sw i t h1 0 8 5 士0 0 0 2r e l a t i v ed e n s i t yo ff i c o1 1s e p a r a t i o ns o l u t i o n t h ec o n d i t i o n so fc u l t u r ea r ca sf o l l o w s ：t h er p m i16 4 0m e d i u mc o n t a i n i n gt h eb o v i n ec a l fs e r u m ( b c s ) 1 0 ，t h et e m p e r a t u r ei s2 3 c 。t h ec a r b o n d i o x i d ec o n c e n t r a t i o ni s5 a n dt h ep e r i o do fc u l t u r ei s7 2h t h es t i m u l a t i o ni n d e xi ss t u d i e dt h r o u g hi nv i t r oc e l lc u l t u r eo fm t ta s s a y t h er e s u l t ss h o wt h a tc o m p a r e dw i t hc o n t r o l l e dg r o u p ，w h e na p sil e v e l sr e a c h0 i ，i ，2m g m l ，a p sic o u l ds i g n i f i c a n t l ye n h a n c et h ep r o l i f e r a t i o no fl y m p o h o c y t e so ft h ep e r i p h e r a lb l o o di nv i t r o ( p 0 0 5 ) i nc o n c l u s i o n ，a p sih a si m u n o s t i u l a t i n ga c t i v i t y p a r t4t h ec o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo f a p sia p s1w a sa n a l y z e db yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) ，e l e m e n ta n a l y z e r , i r ，h p i c 1 h - n m ra n d ”c n m r t h er e s u l t ss h o wt h a tm o n o s a e c h a r i d eo fa p sii sp u r eg l u c o s e ne l e m e n ta n ds u l f u rc o u l dn o tb ef o u n di na p sia n dt h ec o n t e n to fta n dhe l e m e n t si sa p p r o x i m a t et ot h e o r yo fp u r e p o l y s a c c h a r i d e s i rs p e c t r u mi n d i c a t st h a tt h e r ea r ct y p i c a lc h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a k so fp o l y s a c c h a r i d e s c h e m i c a ll i n k a g ea n a l y s i sw i t h h - n m r ，3 c - n m ra n di rs h o w e dt h a ta p sii sm a i n l yd g l y c o s d ea n dm a yh a v eq - g l cc l _ 4 ) _ a n d3 - g i cc l _ 4 ) _ + l i n k a g e ，i nc o n c l u s i o n ，a p sil i n k a g ei sc o m p l i c a t e d ，w h i c hn e e dt ob et e s t e db ym e t h y l a t i o na n a l y s i sa n ds m i t ha s s a ya n a l y s e st ou n d e r s t a n dm o r e k e yw o r d s ：a n o d o n t ap o l y s a c c h a r i d e s ；e x t r a c t i o no fp o l y s a c c h a r i d e s ；h s c c c ；b i o a c t i v i t yo f p o l y s a c c h a r i d e s ；s t r u c t u r eo f p o l y s a c c h a r i d e sv缩写词a p ss o dm d at a o cg s h p xa k pl y sh s c c ch p l ct l cn m ri rd m s oa c pm p 0c o n ap h ag l um a na r ag a l缩略词表英文原文a n o d o n t ap o l y s a c c h a r i d e ss u p e r o x i d ed i s e t a s em a i e j c d i a l d e h y d et o t a la n t i o x i d a t i v ec a p a c i t yg l u t a n t h i o n ep e r o x i d a s ea l k a l i n ep h o s p h a t a s el y s o z y m eh i g hs p e e dc o u n t e r 4 c u r r e n tc h r o m a t o g r a p hh i g hp e r f o r a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p hn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c ei n f r a r e ds p e c t r u md i e t h y ls u l f o x i d ea c i dp h o s p h a t a s em y e l o p e r o x i d a s ec o n c a n a v a l j nap h y t o h e m a g g l u t i n i ng u c o s em a n n o s ea r o b i n o s eg a l a c t o s e中文释义河蚌多糖超氧化物歧化酶丙二醛总氧化能力谷胱甘肽过氧化物6碱性磷酸酶溶菌酶高速逆流色谱高效液相色谱薄层层析核磁共振红外光谱二甲亚砜酸性磷酸酶髓过氧化物酶伴刀豆球蛋白a植物血凝素葡萄糖甘露糖阿拉伯糖半乳糖独创性声明本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：叼钦双薹日期：纱印7 ，旷论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留，使用学位( 毕业) 论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。口不保密，本论文属于不保密。口学位c 毕业，论文储亲笔她撇垂吼叫。乡纩特捌保骆彬日期勺占，c r前言l 河蚌多糖研究的背景刖吾多糖( p o l y s a c c h a r i d e ，p s ) 又称多聚糖，是一种由单糖之问脱水形成糖苷键，并由糖苷键线性或者分枝连接组成的链状聚合物具有广泛生物活性的天然大分子物质多糖广泛存在于许多动植物体内，不仅是生物的营养成分，而且参与多种生命活动，是构成生命活动的四大基本物质之一，维持生命功能密切相关多糖是来源于高等动植物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是所在生命有机体的重要组成成分与维持生命所必须的结构材料人们对糖的认识首先是把其看作能量来源。近几十年来，由于相关研究包括鹱的化学功能，免疫物质的研究以及对新药资源的寻找等的发展，发现糖类广泛参与了生物体内各种生命活动，具有多种多样的生物学功能。如标记功能，细胞免疫功能以及血型抗原、细胞恶化标记。蛋白质保护蛋白质修饰等糖作为一类高级生物信息分子，所舍信息量巨大，比核酸、蛋白质高数个数量级，这类信息无法直接用核酸碱基对排列与蛋白氨基酸之间的简单对应关系加以解释，因此糖链所表达的信息直接反映出d n a 中更深层次的遗传语言，潜在的研究与应用价值将是相当惊人的，1 9 8 8年牛津大学r a y m o n d 教授提出糖生物学( g l y c o b i o i o g y ) 一词，目前，糖生物学及糖工程己成为继基因工程蛋自质工程之后的第三大生物工程，是当今最前沿的生物擘科之一【1 - 3 目前国内外已在一些动植物中，分离提取了许多医疗价值的活性多糖或复合物无毒可食的一些贝类软体动物，民间也常作为医疗保健食品医学记载，不少贝类具有清热解毒，明目利胆利水消胂等功效【4 j 已有试验发现，常见贝类组织中舍有较多的多糖成分【5 】我国拥有极为丰富的贝类资源，淡水贝类和人类的关系十分密切，二方面可食用药用或制作工艺品，同时也是经济鱼类、鸟类的食物；另一方面，它们作为传播寄生虫的媒介动物，可引起人们的动物的寄生虫，如钉螺为日本血吸虫的中间寄主，导致血吸虫病在广为流行，严重危害人和家畜的健康，贝类是淡水生物群落的重要组成部分，其生物量在底栖动物中占优势贝类种类繁多，应用广泛。在医药、农业工业中受到越来越多的重视随前言着人工培育珠技术的发展，贝类的经济价值有了很大提高蚌似n o d o n t a ) 又名河蚌，河歪，是蚌科动物无齿蚌，三角帆蚌，褶纹冠蚌等多种蚌类的肉我国大部分地区有分布，现部分地方开始人工养殖蚌属于河鲜，食用历史已有3 0 0 0 多年蚌肉作用药用，最早见于唐孟诜食疗本草，谓其能治“大热，解酒毒，止渴，去眼赤”日华子本草说它能“明日，止消渴，除烦解热毒，补妇女虚劳，下血，并痔瘘，血崩，带下”随息居饮食谱说它能“清热滋阴，养肝凉血，熄风解酒，明目定狂”本草纲目记载蚌内有“止渴除热，解酒毒，去明目除湿”等作用本草再新谓“治肝热，肾衰，托斑疹，解豆毒清凉止渴。”现代研究表明，河蚌软体中含多糖，且是活性部位贝类多糖是存在于贝类体内的一种生物活性物质，又可分为海洋贝类多糖如鲍鱼多糖、文蛤多糖等；淡水贝类多糖如河蚌多糖等和陆生贝类多糖如蜗牛多糖贝类多糖中关于粘多糖( m u c o p o l y s a c c h a r i d e ) 等的研究最多粘多糖叉称氨基多糖( g l y c o s a m i n o g l y c a n ) ，结缔组织多糖、糖胺聚糖和氨基葡聚糖，是动物中含氨基的一粪多糖，是动物体内的一类重要大分子物质2 贝类多糖的生物学功能及应用状况贝类中存在大量的具有生物活性的多糖类物质由于生长环境不同，这些多糖类物质不同于陆生生物随着人们对贝类多糖研究的深入，发现许多贝类多糖具有抗肿瘤，抗病毒、免疫调节降血糖降血脂、抗氧化及抗炎等生物孝功能，目前大多还处于动物试验阶段，因此贝类多糖逐渐成为当今新药开发的重要方向之一【1 1 2 1 抗肿瘤作用抗肿瘤活性是多糖类化合物所显示的重要生物活性，其特点是毒副作用小，能提高机体免疫功能并抑制肿瘤生长，与化疗药物适当组合有协同作用并可降低或免除化疗药物的毒副作用许东晖等药理试验表明鲍鱼多糖可能是通过增强荷瘤小鼠的免疫功能和抗氧化作用而发挥其抗肿瘤活性的【6 】范秀萍研究发现菲律宾蛤仔氨基多糖具有明显的抗肿瘤活性川范秀萍研究结果表明，珠母贝c p g及g a g 1 ，g a g 0 2 对体外肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用【3 】胡健饶等研究三角帆蚌多糖的抗肿瘤活性，结果表明三角帆蚌多糖有一定的抗肿瘤活性，其作前言用机制可能与增强胸腺免疫功能有关【9 】雷晓凌等研究发现缢蛏糖胺聚糖可能具有抗肿瘤作用【1 0 1 陈倩超研究讲求实效鲍鱼多糖具有抑制肿瘤生长，对s l s o 腹水型小鼠、艾氏腹水型小鼠和肝癌腹水型小鼠有延长寿命的作用对s l s 0 实体型小鼠有明显的抑瘤作用同时认为多糖的抗癌活性与其化学结构，给药途径、荆量选择有密切关系 h i 褶纹冠蚌提取物能抑制小鼠s 1 8 0 肉瘤e a c 腹水瘤和l i l 2 1 0淋巴白筹办病瘤，且能增强荷瘤小鼠n k 细胞杀伤活性，其作用机制类似于抑制因子的抗肿瘤作用f 蜊2 2 免疫调节作用多糖类物质具有广谱的免疫调节活性，不仅能激活巨噬细胞( m 0 ) ，t 淋巴细胞，b 淋巴细胞，自然杀伤细胞( n k ) 细胞毒t 细胞( c t l ) 淋巴因子激活的杀伤细胞( l a k ) 等免疫细胞，还能促进细胞因子生成，活化补体，以及调节神经一内分泌一免疫( n i m ) 网络的平衡，并能对过免疫调节作用发挥多种生理活性【3 】袁亚非在研究中发现，河蚌提取物( k a l ) 对t 淋巴细胞参与的免疫反应有一定作用；可明显增加小鼠腹腔m 由吞噬功能，吞噬百分率明显增加：对刀豆素蛋白a ( c o n a ) 诱导下的淋巴细胞增殖反应表现出明显的促进作用：各剂量组对脾细胞l - 2 的产生有促进作用，且荆量增大作用增强【1 2 】崔悦礼等在研究发现，河蚌多糖能广泛地影响潜在的m 中活性，并获得应答能力而表达吞噬功能，使具有吞噬能力的细胞数量显著增加f 1 9 】姚滢等研究发现，厚壳贻贝多糖能从细胞免疫功能体液免疫功能单核巨噬细胞功能及nk 细胞活性方面促进正常小鼠的免疫活性作用，并具有明显的抗肿瘤作用昊皓等报道，珠蚌多糖能明显升高免疫低下小鼠白细胞水平，能促进体内单核巨噬细胞的吞噬功能，有利巨噬细胞清除异物，对体外培养l p s 刺激的b 淋巴细胞增殖有增强作用，对免疫低下小鼠c o n a 刺激的t 淋巴细胞转化和增殖有促进的作用，提示珠蚌多糖在调节免疫方面有作用【1 4 | 何雅军在研究发现文蛤多糖对环磷酰胺( c t x ) 造成的小鼠免疫功能损伤有对抗作用，能使免疫器官胸腺，脾脏增重，外周血液白细胞数量增加，吞噬能力增强，血清溶血素抗体水平增高，s r b c 和p c 所致超敏反应增强i ”】周永灿等研究发现珍珠多糖肽可以增强合浦珠母的贝非特异性免疫能力王俊等研究发现牡蛎多糖能增强小鼠细胞免疫体液免疫功能，并有一定的抗肿前言瘤和抗氧化作用l 陈文星等用3 h t d r 掺八法观察珠蚌多糖对正常小鼠和免疫低小鼠t ，b 淋巴细胞转化增殖作用的影响，用放射免疫法测定珠蚌多糖对氢化可的松造模小鼠血浆c a m p 与c g m p 的影响结果发现珠蚌多糖可增强b 淋巴的转化增殖作用和降低血浆c a m p 与c g m p 水平，促进机体免疫功能【2 0 1 2 3 其他作用侯建明等发现，以不同剂量海洋生物多糖( a c - i ) 能明显阻抑大鼠肠道对脂类的吸收；降低大小鼠的血浆甘油三酯和胆固醇崔悦礼等研究表明，河蚌多糖，田螺多糖，玛瑙螺多糖，能明显对抗人体高胆固醇血症的形成，使血清总胆固醇含量显著下降其结果与许多具有生理活性的植物多糖药理作用类似刘赛等对海洋贝类提取物对鼠血浆及血管壁中p g f i a 和t x b 2 的影响及抗血栓形成作用的研究结果表明，海洋贝类提取物( e m s ) 能降低血浆及血管壁中筹办栓互a 2 水平，具有调节t x b 2 与前列环素平衡、抑制血栓形成的作用【2 1 】。殊母贝糖胺聚糖具有一定的体外抗凝血作用嘲。3 多糖研究的发展趋势【1 - 2 , 2 2 - 2 3 】随着糖生物学的兴起，人们逐渐认识到多糖具有丰富的生物活性且毒副作用较小，目前已成为研究的热点之一，尤其在以下几方面尚待深入研究3 1 动物多糖的分离纯化技术多糖的分离纯化技术一直是一个难点，纯度不够结构数据就不可靠，分子量信息也没有意义，构效关系乖活性的关系也就无从谈起，多糖的研究方法还比较落后，提取纯度差及稳定性不高等因素仍影响和制约了对糖生物学效应和其结构之间的内在联系的研究，也使得要在分子水平上阐明它们的药理作用和作用机理受到很大的限靠4 3 2 多糖的结构与功能的关系多糖的结构是其生物活性的基础，二者密切相关，多糖中单糖的组成、糖苷键的类型以及一些官能团对其生物活性都有影响，多糖及糖缀合物本身的复杂性，使得其结构与功能的关系尚未清楚，如活性中心，影响活性因素等这些因素都对多糖的开发研究以及发展产生具有深远意义的影响，需要进一步研究前言天然多糖的种类繁多，化学结构复杂，使其结构尤其是高级结构的研究难度较大，而这是研究多糖构效关系。以其为先导化舍物开发新药不可逾越的步骤目前多糖研究侧重于分离、纯化、化学组成及生物活性测定等方面，时多糖的结构特别是高级结构的研究、多糖构效关系的研究都未及深入，有很多问题有待阐明。3 3 探索多糖的化学合成途径自然界中存在许多具有各种生物活性的多糖，但并不是所有的多糖都具有活性，多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约有的多糖由于结构或理化性质等障碍而不利于其生物学活性的发挥；有的多糖尽管药效良好，但同时也会产生一些不良反应，甚至毒副作用；还有的从天然生物体内分离的多糖活性较弱通过一定的方法对多糖进行适当的结构修饰，或探索多糖的化学合成途径，有针对性地对多糖及其衍生物进行结构改造如硫酸化，乙酰化等，以提高其活性或赋予其新的生物活性，或消除其某些毒副作用，以获取高活性多糖衍生物3 4 多糖质量标准控制国内虽有不少的多糖制荆已应用于临床，但由于其化学结构不明确，质量也很难控制，造成药效重复性差，不符合国际规范，难以进入国际市场3 5 多糖的临床应用多糖有其天然性、多功能性无毒副作用，无药残无抗药性的独特优势，是用以替代化学合成物和激素类的理想饲料添加荆，在养殖业中逐渐得到应用和开发，用于增强养殖动物的体质和抗病能力，以提高动物生产性能，发挥其越来越重要的作用但是在多糖的剂量与效应关系，寻找最适剂量和简便给药途径等问题仍在未来努力的方向动物试验存在一些不稳定因素或反常现象，需对试验条件进行不断摸索，优化和规范试验动物的使用。多糖在体内的作用机制还未十分明了总之，应利用现代科学技术手段和多学科交叉的方法，深入研究多糖的结构、构型，及其与多糖活性之间的关系，从分子水平深化药理研究，为进一步明确多糖的构放关系，进而筛选“活性结构”多糖或对多糖进行化学改性，从而开发出活性更高，毒副作用更小的新药提供理论基础丽百4 本研究的目的和意义当前研究淡水贝类多糖的报道较少见，本研究选用河蚌作为研究材料，研究河蚌多糖提取工艺条件的优化，河蚌多糖分离纯化，河蚌多糖的体外抗氧化作用、对罗非鱼免疫功能和抗氧化性能的影响以及对罗非鱼外周血淋巴细胞增殖的影响等生物学功能的影响，河蚌多糖的组成和结构的初步分析等，以期能够分离出具有生物活性的多糖，为进一步合理开发我国丰富的贝类资源提供理论依据和技术资料5 多糖研究的总体流程提取图1多糖的分流程图f i g 1t h eg e n e r a lp r o c e d u r eo fn a t u r a lp o l y s a c c h a r i d e第一章河蚌多糖的提取第一章河蚌多糖的提取动物性多糖主要与细胞膜上的蛋白质和脂质以共价键连接，形成糖蛋白和糖脂，因而，必须以各种有效方法破坏多糖链与其他物质的共价结合方能达到提取多糖的目的尽管多糖品种繁多，但其分离提取方法基本相似，目前常用- 如- f - - 种方法提取分离，即碱溶液提取法、中性盐溶液提取法和酶解法或碱解与酶解相结合的方法【2 4 】本研究拟采用中性盐溶液进行河蚌多糖提取条件探讨和提取工艺条件下的优化，为今后的研究提供素材1 材料、试剂及仪器1 1 试验材料新鲜河蚌( a n o d o n t a ) 购于洪山桥下1 2 试验试剂丙酮浓硫酸苯酚，氯仿正丁醇磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇，葡萄糖、苯酚( 均为分析纯) 1 - 3 试验仪器数码恒温水浴锅h h 4 ，国华电器有限公司；u v - 1 6 0 0 紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；恒温循环器h x l 0 5 0 ，北京德天佑科技发展有限公司；r e 5 2 c s 2 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；恒温水浴锅b 2 6 0 ，上海亚荣生化仪器厂；s h z i i i 型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；m k c 3 0 0 n 高速组织捣碎机，日本松下；s t a t t o r i u s b p 2 1i d 电子天平d = 0 0 1m g ，北京塞多利斯天平有限公司；电热恒温水浴槽，北京市医疗设备厂2 试验方法2 1河蚌丙酮粉制备1 2 5 函】将河蚌全脏器用高速组织捣碎机捣碎，分别用等体积的丙酮和无水乙醇各浸泡8 h 和2 h ，滤除滤液后置烘箱中5 0 3 2 烘干后粉碎后过7 0 目筛，得淡黄色的丙酮粉，放干燥器中备用2 2 中性盐提取河蚌多糖的单因素试验7第一章河蚌多糖的提取本试验分别考察了提取时问提取温度，料液比及次数对提取河蚌总糖得率的影响2 2 1 提取时问对总糖得率的影响延长提取时间会提高提取率，但当细胞中的有效成分已完全溶出时，而延长提取时问，非但不能提高提取率。反而会增加提取液中杂质的含量本试验称取河蚌丙酮粉6 份各2g ，按科液比l ：7 0 ，分别在8 0 下水浴0 5 、1 2 、3 4 ，5h 蔫心得上清液，接苯酚硫酸法测定河蚌总糖浓度，计算总糖得率2 2 2 提取温度对总糖得率的影响：温度过低，不利于多糖物质的溶出；而温度过高，容易引起多糖的降解本试验称取河蚌丙酮粉5 份各2g ，按料液比1 ：7 0 ，分别在6 0 7 0 ，8 0 ，9 0 ，1 0 0下水浴3h ，离心得上清液，接苯酚硫酸法测定河蚌总糖浓度，计算总糖得率。2 2 3 料液比对总糖得率的影响一般来说，只要能将活性物质溶出，料液比越小越好，因为料液比过大时，会给以后的浓缩带来不便本试验称取河蚌丙酮粉6 份各2g ，按料液比1 ：5 0 、l ：6 0 ，1 ：7 0 、l ：8 0 、1 ：9 0 、l ：1 0 0 ，分别在8 0 下水浴2 h ，离心得上渍波，按苯酚硫酸法测定河蚌总糖浓度，计算总糖得率2 2 4 提取次数对总糖碍率的影响称取河蚌丙酮粉5 份各2g ，按料液比l ：7 0 ，置于8 0 c 下水浴，分别提取1 、2 ，3 次，每次2h ，合并提取液，离心得上清液，按苯酚硫酸法澍定河蚌总糖浓度，计算总糖得率2 3 正交试验确定最佳提取条件根据单因素的试验结果，选取试验影响的主要影响因素浸提温度，提取时间，料液比三项作为考察因素，在各因素最佳值附近分别取三个水平，依据l 9 ( 3 4 ) 正交试验表进行设计，作3 因素3 水平正交试验，以确定中性盐提取河蚌多糖的最优工艺2 4 河蚌总糖得率的计算由新鲜河蚌制得丙酮粉，得率为4 5 按笨酚硫酸法进行测定，使用标准曲线计算按以下公式计算总糖得率河蚌总糖得率( ) = ( 总糖的浓度x 稀释倍数x1 0 石) ，样品重量x1 0 0 4 5 第一章河蚌多糖的提取2 5 总糖含量的测定1 2 他9 j多糖的栓测目前尚无统一的方法，文献报道多糖的检测方法可分为二天类一粪是直接测定多糖本身，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用斐林法、苯酚硫酸法、硫酸蒽酮法等测定多糖前者昂贵的仪器多糖纯品和特定的酶，且操作繁琐，在应用中受限制；后者方法简单、快速本次试验采用苯酚一硫酸比色法测定总糖含量其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糖醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长4 9 0n m 处和一定浓度范围内，其吸光度a 值与糖浓度c 呈线性关系，从而可用比色法测定其含量2 5 1苯酚一硫酸比色法测定波长的选择 3 0 - 3 1 取一定量的标准品和河蚌粗多糖溶液经苯酚浓硫酸显色后，在4 0 0 6 0 0n m范围内进行光谱扫描，选择最大的吸收峰波长2 5 2 标准曲线的制备【3 0 。3 2 】精密称取1 0 5 c 下干燥至恒重的葡萄糖2 0m g ，置5 0 0m l 量瓶中，加水至刻度，摇匀，配得4 0pg m l 的葡萄糖标准溶液精密吸取葡萄糖标准溶液0 4 ，0 6 ，0 , 8 ，1 0 ，1 2 1 4 1 6 1 8 m l ，分别置于1 0 m l 具塞刻度试管中，各以水补至2 0m l 然后分别加入5 苯酚溶液1m l ，摇匀，迅速加入浓硫酸5m l ，振摇室温放置5r a i n ，放入沸水中1 5r a i n 取出置冷水中冷却3 0m i n ，最后加水至刻度，摇匀，以2 m l 的蒸馏水按同样显色操作作为空白，用紫外分光光度计在入- - 4 9 0 n m 处测定吸光度以a 值为纵坐标对葡萄糖浓度绘制标准曲线2 5 3 样品总糖含量的测定准确称取2 5m g 两种方法提取的河蚌粗多糖，蒸馏水溶解后转移至2 5 0m l 容量瓶，稀释至刻度，摇匀。得样品制备液浓度为1 0 0u g m l 的受试品溶液精密吸取河蚌粗多糖储备液lm l ( 5 份) ，用蒸馏水补至2m l ，按照上述方法分别测其吸光度，以标准曲线和下式计算样品中总糖的百分含量总糖含量( ) - ( c d ) w 1 0 0 式中c 为供试液葡萄糖浓度，d 为供试液的稀释倍数；w 为样品重量3 结果与讨论第一章河蚌多糖的提取3 1 总糖含量的测定3 1 1苯酚一硫酸比色法测定波长的选择从扫描图谱看，葡萄糖对照品溶液河蚌粗