（临床医学专业论文）系统性红斑狼疮的临床分子流行病学研究.pdf

煳 目录 缩略词表3 摘要。4 a b s t r a c t 6 前言8i j u 吾8 实验流程图1 l 1 研究样本来源及主要材料仪器12 2 实验主要技术2 1 3 实验结果2 6 4 讨论。6 2 5 结论7 2 附表7 3 论文参考文献7 7 综述。；。j 。“。矗。8 0 致谢9 9 缩略词表 缩写英文名中文名 a n a a p a n o v a b p c i d n t p e d t a h r l n n p l e o d o r p a g e p c r p q r f l p r p m s l e s n p s s c p a n t i - n u c i e l ca n t i b o d y a m m o n i u mp e r s u l f a t e a n a i y s i so fv a r i a n c e b a s ep a r c o n f i d e n c ei n t e r v a l d e o ) ( yr - b o n u c l e o “d etr p h o s p h a t e e t h y i e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d h a z a r dr a t e l u p u sn e p h r t i s n e u f o p s y c h i a t r i ci u p u se r y t h e m a t o s u s o p t i c a id e n s i t y o d d sr a t i 0 p o i y a c r y i a m i d eg e ie i e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h o c o m e ca r m i o n ga m l r e s tr c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o i y m o r p h i s m r l v o i a t i o np e rm i n u t e s y s t e m i ci u p u se n ，t h e m a t o s u s s i n g l en u c l e o t i d ep 0 l y m o r p h i s m s i n g i es t r a n dc o m f o r m a t l o n p o l y m o r p h i s m 抗核抗体 过硫酸铵 单因素方差分析 碱基对 置信区间 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸二钠 风险率 狼疮。| 肾炎 精神神经狼疮 光密度值 相对危险度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 多聚酶链式反应 ( 染色体) 短臂 ( 染色体) 长臂 限制性片段长度多念性 转每分钟 系统性红斑狼疮 单核苷酸多态性 单链构象多态性 t b eb u f f e rtr s b or i ca c i d e d t ab u f f e rt b e 缓冲液 t eb u f f e rtr i s e d t ab u f f 色rt e 缓冲液 t e m e d n ，n ，n ，n t e t r a m e t h y i e t h y i e d i a m i n e n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 t e sb u f f o r tr s e d t a n a c b u f f e rt e s 缓冲液 t r i s t r i h y d r o y m e t h y i e t h y i e d i a m i n e ( t r i s )三羟 p 綦氮堆甲烷 3 摘要 背景：系统性红斑狼疮( s l e ) 是一种病因不明的可累及全身多系统多器官的自 身免疫性疾病，随着人类基因组计划的完成，广泛认为s l e 为一种多基因多致 病因素疾病。近年来发现，f c y r a 参与s l e 的发病，特别是其与i g g 的结合 在抗原抗体复合物的清除中起着重要作用。新近有报道认为c d 2 4 作为协同刺激 因子调节细胞免疫，可能与自身免疫性疾病尤其是中枢神经系统受累的发病相 关。而c y p 2 c 19 + 2 基因是重要的细胞色素p 4 5 0 酶的主要突变型之一，与s l e 的c t x 治疗有着密切联系。目前这三个s n p s 位点在s l e 患者中的临床分子流 行病学研究还相对较少。 目的：研究中国人群中，f c y r af 1 5 8 v 、c d 2 4 a 5 7 v 、c y p 2 c 1 9 2 单核苷酸 多态性( s n p s ) 的分布。通过对s l e 患者进行基因分子水平的研究，并与其临 床资料进行相关性分析，研究这些基因多态性位点对s l e 特别是狼疮肾炎( l n ) 的遗传易感性、病程变化和治疗效果等的影响，为s l e 的基因诊断及治疗策略 选择提供理论根据。 方法：采用病例一对照研究，收集在北京协和医院就诊的3 2 4 名s l e 患者和相匹 配的非自身免疫性疾病的3 1 9 名健康志愿者、体检对照，利用多聚酶链式反应 ( p c r ) 、限制性片段长度多态性( r e l p ) 以及单链构象多念性一聚丙烯酰胺凝 胶电泳( s s c p p a g e ) 、d n a 测序验证等技术检测f c y r 川af 1 5 8 v c d 2 4 a 5 7 v 、c y p 2 c 1 9 + 2 基因型。进一步结合临床资料进行统计分析。 结果： 1 在本研究人群中，f c y r 川a 基网的f 等位基因频率约为6 0 8 。s l e 组的 f f 基因型、f 等位基因显著高于对照组。l n 组的v 基因携带者( f v + w ) 人 数显著低于无l n 组，而晚发l n 组的f 基闪携带者( f f + f v ) 人数显著高于早 发首发l n 组。 2 在本研究人群中，c d 2 4 基因的t 等位基冈频率约为3 4 8 。c d 2 4 基凶 多态性在s l e 组和对照组之间存在显著差异，携带t 等位基因可能是s l e 患者 患病的一个危险因素。在n p l e 组与无n p l e 组之l 日j ，未发现c d 2 4 基囚多态 性与n p l e 的发病有显著相关。 3 在本研究人群中，c y p 2 c 1 9 2 突变型的分布频率约为2 9 9 。c y p 2 c 1 9 + 2 基因多念性与c t x 产生毒性作用的十日关性分析表明c y p 2 c 1 9 + 2 这一突变可显 4 著减少产生性腺毒性的可能性，至于是否会减少骨髓抑制的可能，差异未发现有 统计学意义，而与c 。r x 用药后是否出现肝功异常无关。c y p 2 c 19 + 2 突变型基 因携带者( g a + a a 基因型) 在c t x 对l n 的治疗反应上显著差于不携带a 基因 的患者( g g 基因型) 。 结论： 1 f c v r a 基因多态性与s l e 的发病有关，f f 纯合子基因型可能存在对l n 的易感性。w 纯合子基因型可能对l n 晚发存在一定保护作用。 2 c d 2 4 e 2c 2 2 6 t 基因多态性与s l e 的发病有关，t 等位基因可能会增加s l e 的易感性，而与n p l e 的发病无直接相关。 3 c y p 2 c 19 + 2 突变型可能会降低c t x 的治疗效果，减少部分毒性作用的发生。 关键词： 系统性红斑狼疮；狼疮肾炎；环磷酰胺；单核苷酸多态性 a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：s y s t e m i cl u p u se n ，t h e m a t o s u s ( s l e ) i sa na u t o i m m u n e d i s e a s ec h a r a c t e r i z e db yt h es y s t e m i co r g a nd a m a g e s t h ec a u s eo fs l ei s n o ty e tv e 吖c l ar i f i e d 觚e rt h ep u b l i c a “0 no ft h ee n t i r eh u m a ng e n o m e ，i ti s b e i i e v e d 廿1 a ts l ei sc a u s e db yac o m p l e xi n t e r p l a yb e t w e e nv ar o u sg e n e t i c a n de n v i r o n m e n t a if a c t o r s f c y r 川a ，c d 2 4a n dc y p 2 c 19 2p i a yam a i o rr o l e j nt h ep a t h o g e n e s i s ，c o u r s ea n dt r e a t m e n to fs l e b u tt h ep o i y m o r p h i s m so f t h e s eg e n e sh a v en o tb e e nw j d e i ys t u d i e d o b j e c t i v e ：t bs t u d yt h ef r e q u e n c i e so ff c y r l | l a ，c d 2 4a n dc y p 2 c 19 2 p o l y m o r p h i s m si nc h i n e s ep o p u i a t i o na n dt h ep o t e n t i a ir o i eo ft h e s es i n g l e n u c l e o t i d ep o i y m o r p h i s m s ( s n p s ) i ns l ea n di u p u sn e p h r t j s ( l n ) m e t h o d s ：w es t u d i e d3 2 4u n r e i a t e dc h i n e s es l ep a t i e n t sa n d3 19c o n t r o i s f c y r 川af 15 8 vp o i y m o r p h i s mw a sg e n o t y p e db ys p e c 币cp r i m e 卜p o i y m e r a s e c h a j nr e a c t j o n ( p c r ) c d 2 4a 5 7 v 、c y p 2 c19 + 2p o i y m o r p h j s mw e r eg e n o t y p e d b yp c ra n d - r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o i y m o r p h i s m ( r f l p ) r e s u i t s ： 1 t h eo b s e r v e df r e q u e n c yo ffa e i eo ff c y r l i i ap o i y m o r p h i s mi s6 0 8 i n c h i n e s e p o p u i a t i o n 。f c y r i i i ap o l y m o r p h i s mr e v e a l e das i g n i f c a n t d i 仟e r e n c eo fb o t hg e n o t y p ea n da e i ed i s t r i b u t l o nb e t w e e ns l ep a t i e n t s a n dc o n t r o i s ，l i qp a t i e n t sh a v eas j g n j f j c a n td e c r e a s ei nc a r r j e rf r e q u e n c yo f t h e 、，- a e i e ，w h i l et h ec a r r e rf r e q u e n c yo ft h ef a l l e i er l v e a i sas i g n i f c a n t d i f l - er l 号n c eb e t w e e nt h ep a t i e n t so fd i 仟色r e n tc o u r s eo fl n 2 t h eo b s e r v e df r e q u e n c yo fta l | e i eo fc d 2 4p o l y m o r p h i s mi s 3 4 8 i n c h i n e s ep e o p l e c d 2 4p 0 i y m o r p h i s mr e v e a l e da s i g n i f c a n td i f f e r e n c ei n s l ep a t j e n t sa n dc o n t r o i s ，w h i c hs u g g e s t sta e i eo fc d 2 4m i g h tb ear s k f a c t o rf b rs l e t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i 仟e r e n c eo fb o t hg e n o t y p ea n da l | e i e d i s t r i b u t i o no fc d 2 4 p o f y m o r p h i s m i n n e u r o p s y c h i a t r i ci u p u s e n r t h e m a t o s u s ( n p l e ) p a t i e n t sa n do t h e rs l ep a t i e n t s 3 t h eo b s e n ，e df r e q u e n c yo faa e i eo fc y p 2 c 19 + 2p o i y m o r p h i s mi s2 9 9 i nc h i n e s e p o p u i a t i o n p a t j e n t sw h ow e r ee i t h e r h e t e r o z y 9 0 u s o r h o m o z y g o u sf o rc y p 2 c 19 2h a das i g n i f c a n t l yi o w e rr i s ko fo v ar a n 6 t o i c i t y ，a n dai o w er b u tn o ts i g n i f i c a n t i y r i s k0 fm a r r o wr e s t r a i n t ，w h i e t h e r ew a sn oo b v i o u sa s s o c i a t i o nb e t w e e nc y p 2 c 19 + 2p o i y m o r p h i s ma n d h e p a t i cd y s f u n c t i o n t h ec y p 2 c 1 9 + 2p o i y m o r p h i s m ，e s p e c i a yt h ec a r r e r o fa a i l e l e ，m i g h tr e d u c et h ec i i n i c a ir e s p o n s et oc y c i o p h o s p h a m i d e ( c t x ) i np a t i e n t sw t hi u p u sn e p h r i t i s c o n c l u s i o n ： 1 f c v r l li ap o i y m o r p h i s m sm i g h tb er e i a t e dt os l ei nc h i n e s ep o p u i a t i o n t h eh o m o z y 9 0 u sf fg e n o t y p e0 ff c y r l i l am i g h tb et h er j s kf a c t o rf b rl n ， w h i et h eh o m o z y g o u swg e n o t y p em g h tb et h ep r o t e c t i v ef a c t o rf o rl a t e o n s e ti u p u sn e p h r i t i s 2 c d 2 4p o l y m o r p h i s m sm i g h tb er e l a t e dt os l el nc h i n e s ep o p u l a t i o n ，a n dt a e l eo fc d 2 4m i g h tp l a yar o i ei ns u s c e p t i b i l i t yt os l e ，w h i i en o a s s o c i a t i o ni sf 6 u n df 6 rn e u r o p s y c h i a t r ci u p u se r y t h e m a t o s u s ( i 、i p l e ) 3 t h ec y p 2 c 19 + 2p o i y m o r p h i s mm i g h ti n f l u e n c et h ec n i c a lr e s p o n s et o c y c i o p h o s p h a m i d e ( c t x ) i np a t i e n t sw i t hi u p u sn e p h r t j s ，a n dm a yl o w e rt h e r i s ko fs o m et o x i c i t yo fc t x k e y w o r d s： s y s t e m i ci u p u se r y t h e m a t o s u s ， l u p u sn e p h r j t i s ， c y c i o p h o s p h a m i d e ，s i n g i en u c i e o t i d ep o i y m o r p h i s m 7 _ l j j 一 刚吾 系统性红斑狼疮( s y s t e m i ci u p u se r y t h e r m a t o s u s ，s l e ) 是由多重遗传和 环境因素联合致病的一种极具代表性的自身免疫性疾病，以显著增多的自身抗体 产生、免疫，炎症反应系统功能异常及多器官受累为病理生理特征【1 】。本病的患 病率约为7 0 ，1 0 万，男女比例约为1 ：7 1 0 ，好发年龄为育龄期女性。目前已证实 s l e 的遗传学背景十分复杂，涉及了机体免疫系统调节通路上的多种重要分子的 编码基因。因此关于s l e 以及狼疮肾炎、神经精神狼疮等器官损害的免疫遗传学 研究一直是近年来的热门方向。 文献报道，约5 0 一7 0 的s l e 患者会出现肾脏受累，即狼疮肾炎( l n ) ，约 1 3 2 4 的患者会出现神经系统受累，即神经精神狼疮，约3 0 5 3 的患者会出现 血液系统的受累【2 】。一旦出现这些重要脏器的受累，则会显著影响s l e 患者的治 疗决策，同时，也在一定程度上可以影响患者的预后。 l n 的发病机制之一，是循环免疫复合物在肾脏的沉积，研究认为其与抗原 抗体的清除障碍有关，即i g g 和i g gf c 受体结合的亲和力发生了改变，因此f c 受 体在这一过程中起着重要作用。l n 中形成病理性免疫复合物和病理性自身抗体 抗d s d n a 抗体的i g g 主要有l g g l 和i g g 3 两种类型。l g g l 、i g g 3 与补体结合的能 力较强，因而造成的肾脏炎症较重【3 4 】。参与这两者i g g 清除的主要是f c y r 川， 因此有理由相信，f c y r 川基因的变异，将会影响抗原抗体复合物的清除。 f c v r 川基冈位于染色体1 q 2 3 ，片段长度约2 2 k b ，其中存在的单核苷酸多态 性( s n p ) 位点位于5 5 9 位的核苷酸t g 突变，从而对于氨基酸序列第1 5 8 位由f ( 苯丙氨酸) 变为v ( 缬氨酸) ，该位点恰好位于蛋白的胞外i g g 结合结构域，因 此改变了f c v r 川a 与i g g 的结合能力。以往的研究证实，与i g g 的结合能力为 w f v f f ，因而推测f 基因的携带者其清除抗原抗体复合物的能力下降，从而 导致抗原抗体复合物的沉积，造成个体易感s le ，尤其是l n 【5 7 】。 2 0 0 0 级的程婉滢在我科既往研究课题f c v r 川基因多态性与系统性红斑 狼疮中，对1 0 0 例s l e 患者及1 2 7 例对照进行了初步s n p 研究。受样本量限制， 在f c y r 基因多念性与s l e 及l n 的发病相关性分析中发现存在差异，但均未达 到统计学显著差异。在对不同l n 病程的患者分析中，发现w 等位基因型的分布 频率差异但同样木达到统计学显著性【8 】。本课题将扩大样本量，对这一基因 多念性位点进行进一步研究。 c d 2 4 是一种分子量介j 二2 8 7 5 k u 的低分子量高度糖基化膜糖蛋白，其短肽 骨架共l l l 2 8 3 0 个氮基酸残基组成。c d 2 4 的功能基因定位于常染色体6 q 2 1 区带， 8 其2 号外显子+ 2 2 6 位点存在c t 碱基的替换，该位碱基的替换可导致在磷脂酰 肌醇( g p i ) 锚定区假想的裂解位点( 1 ) 之前紧跟一个非保守性的氨基酸的替换 丙氨酸( a ) 替换成缬氨酸( 、) ，影响其糖基化模式，从而影响其生物学功能的 发挥【9 1 1 】。 目前c d 2 4 与自身免疫性疾病的研究相对较少，较多广泛而成熟的研究主要 集中于肿瘤方面，认为其可能参与肿瘤发病。近年来的研究趋势表明，c d 2 4 很 可能会成为预后差的一个重要标志，并应用于临床诊断【1 2 】。 c d 2 4 这种g p i 关联蛋白可在多种类型细胞中表达，并通过多重糖基化与不 同配体( 包括p 一选择素、c d 仃1 、v l a 4 和v c a m 1 等) 结合锚定于细胞表面， 包括活化t 细胞，b 淋巴细胞系，成熟粒细胞，巨噬细胞及树突状细胞等，这些 黏刚分子对于s l e 患者的特异性组织和炎症反应位点的淋巴细胞协同刺激具有 重要意义【13 】。另外，目前为止，p 选择素是唯一一种被证实可抑制急性炎症介 质表达水平增高的配体【1 4 】。c d 2 4 与p 选择素及其他黏附分子的相互作用也许可 部分解释c d 2 4 在s l e 发病中的生物学作用。 此外，有研究证实在自身激活t 细胞进入中枢神经系统后，c d 2 4 对t 细胞在 中枢神经系统中的局部扩增及持续存在是非常重要的【1 5 】，这些在多发性硬化的 研究中得到认同。因此可以推测，c d 2 4 t 等位基因很可能可更有效的使自身反 应t 细胞在c n s 中持续存在，启动c n s 的自身免疫反应【1 6 】，在n p l e 的发病中 占有一席之地。 环磷酰胺( c y c i o p h o s p h a m i d e ，c t x ，国外称c p a ) 是治疗自身免疫性疚 病，如系统性红斑狼疮( s l e ) 等的最常见药物之一。其药物代谢强度和持久性 受剑药物代谢酶的活性高低的影响。在众多代谢酶中，c y p 4 5 0 酶在环磷酰胺的 代谢中起着非常重要的作用【1 7 】。 与p 4 5 0 酶系有关的多摹因家族定位于1 0 号染色体( 1 0 q 2 4 1 1 0 q 2 4 3 ) ， c y p 2 c 1 9c d n a 全长1 9 4 0b p 。c y p 2 c 1 9 的最主要的突变为2 种，即表现为外 显子5 上的m 1 突变和表现为外显子4 上的m 2 突变，分别被命名为c y p 2 c 1 9 + 2 和 c y p 2 c 1 9 + 3 【1 8 1 9 】。这两种突变型在亚洲人群中的频率较高( 与白种人相比) ， 与药物代谢关系最为密切，c y p 2 c 1 9 + 2 即为m l 突变，是由于外显子5 第6 8 1 位碱 基发生g - a 突变，形成一个异常剪切位点，使得转录时丢失4 0 个碱基对 ( 6 4 3 _ 8 2b p ) ，从而导致下游提i 舀产生1 个终止密码子，使得蛋白合成过早被终 止，丧失催化活性，在亚洲人群中约占1 8 _ 2 3 【2 0 2 1 】。在众多突变型中， c y p 2 c 1 9 + 2 皋因型足唯一可显著影响c t x 清除的突变型【2 2 】，推测其列与c t x 的治疗反应和毒 # 作用均有一定相关性。 9 临床工作中，环磷酰胺冲击是治疗狼疮肾炎特别是活动期狼疮肾炎强化治疗 的主要选择之一，然而并不是所有的患者对这种治疗方法都有理想的治疗反应， 并且c t x 不良反应是令临床医生担心的另一方面【2 3 】。如何在两者间取得较好的 平衡，是每一个临床医生必须面对的选择。如果c y p 2 c 1 9 基因多态性对c t x 在 体内的代谢、治疗效果以及毒性作用都存在影响，则其分型将为临床选择和判断 提供一定依据。 本研究在建立系统性红斑狼疮临床资料及科研样本库的基础上，将对中国人 群中上述三个基因的多态性分布频率进行研究。并采用病例对照研究，分析 f c y r 川基囚多态性与s l e 、l n 的发病及不同病程l n 的相关性，探讨c d 2 4 基因 多态性与s l e 、n p l e 的发病的相关性，评估c y p 2 c 1 9 基因多态性与环磷酰胺治 疗反应及毒性作用的相关性。 l o 实验流程图 1 研究样本来源及主要材料仪器 1 1 研究对象 1 1 1 系统性红斑狼疮组( s l e 组) 患者共3 2 4 例。 样本采集时间：2 0 0 7 年1 0 月至2 0 1 0 年5 月。 样本来源：北京协和医院普通内科、免疫科、肾内科病房住院的系统性红斑狼疮 患者，以及门诊就诊的系统性红斑狼疮患者。所有患者签署知情同意书。 入选标准： 符合1 9 9 7 年a c r 诊断标准( 见附表1 ) 或临床诊断系统性红斑狼疮。 1 1 2 对照组 对照组：包括健康对照和体检对照，共3 19 例。 样本采集时间：2 0 0 8 年1 月至1 0 月 样本来源：健康对照来自协和医院及协和医科大学自愿参加的医师及学生，共5 5 人。体检对照来自协和医院体检中心的查体者，共2 6 4 人。 入选标准：血常规白细胞、红细胞及血小板i l 数正常，自细胞分类j 下常；尿常规 正常；a n a 筛查阴性；其中健康对照无免疫病家族史。 1 1 3 血样采集： 患者采集9m 1 人外周静脉血，5m i 放于2 e d t a 抗凝管中，4m l 于普通 管中；采集健康对照者5m l 外周静脉血，置于5m i2 e d t a 抗凝管中；采取 体检对照者外周静脉血2m l ，置于2m i2 e d t a 抗凝管中。5 0 0 0 r p m 离心5 分钟分离血浆与血清，分装于0 5m le p p e n d o r f 管，血细胞与血凝块保留于采 血管中，均放入2 0 低温冰箱保存。 1 1 4 相关定义 1 ) 狼疮肾炎定义：2 4 小时尿蛋白 0 5 9 d 或尿常规大于+ + + ；2 ) 尿检町见管 型：可为红细胞、血红蛋白、颗粒管型或混合性管型；3 ) 肾活检诊断为狼疮肾 炎：三条中至少符合一条。 2 ) 狼疮肾炎的不同病程：为了解分子遗传学与狼疮发病的关系，我们根据患者 自首发症状至出现狼疮肾炎表现之间的时间不同，将不同的狼疮肾炎病程定义如 下： 首发狼疮肾炎：患者最初发病即有肾脏受累，相关检查符合狼疮肾炎定义。 早发狼疮肾炎定义：患者自首发症状至出现狼疮肾炎表现之间的病程不超过一 年( s 1 2 月) ，包括首发狼疮肾炎。 晚发狼疮肾炎定义：患者自首发症状至出现狼疮肾炎表现之间的病程超过一年 ( 1 2 月) 。 3 ) 狼疮肾炎治疗反应( 详见讨论部分) ： 完全缓解：尿蛋白小于0 5 9 ，d 。尿沉渣正常。白蛋白或肌酐基线水平以下不大 于1 5 。 部分缓解：尿蛋白0 孓- 3 5 9 d 且下降幅度3 0 以上，或尿蛋白大于3 5 9 ，d 但下 降幅度大于7 0 。白蛋白大于3 0 9 ，l 或者肾功稳定。 无效：尿蛋白大于等于3 5 9 d 且下降幅度小于7 0 ，或尿蛋白小于3 5 9 d 但下 降幅度小于3 0 。白蛋白小于3 0 9 ，l 。肌酐大于5 3 u m o i ，l ( 0 6 m g ，d i ) 或基线以 上大于1 5 。 4 ) 精神神经性狼疮( n e u r o p s y c h i a t r cl u p u se r y t h e m a t o s u s ，n p l e ) ：定义 见附表2 。 5 ) c t x 用药后出现性腺毒性( 详见讨论部分) ：年龄在1 8 至4 0 岁之间，至少使 用c t x3 个月，出现明显的月经紊乱。 6 ) c t x 用药后出现骨髓抑制( 详见讨论部分) ：使用c t x 前血常规w b c 计数基 本i 卜常范围内，木次用药后1 周内w b c 低十4 o 1 0 9 ，l ，停药或使用升白药后可 恢复。 7 ) c t x 用药后出现肝功能异常( 详见讨论部分) ：使用c t x 前肝功基本正常( a l t 小于两倍正常值) ，术次用药后2 周内肝功升高至a l t 正常值两倍以上，停药或 使用保肝药后可恢复。 1 。2 试剂和仪器 1 2 1 实验主要仪器： 仪器名称生产厂家 s o n ，a r c5 c 离心机 t g l 1 6 8 高速台式离心机 低温离心机 电磁搅拌器 恒温水浴箱 紫外分光光度计 紫外灯 紫外灯凝胶成像系统 b i o r a dm y c y c i e rp c r 仪 o 2m ip c r 薄壁反应管 移液器( 2 0 u l ，2 0 0 u i ，10 0 0 u i ) d y y 8 型稳压稳流电泳仪 垂直电泳槽 水平电泳槽( j y 一3 3 3 ) t v r 3 12 a 紫外透射仪 g a s 7 0 0 1b 凝胶图像扫描仪 d u 6 4 0 分光光度仪 电子天平 精密p h 计( p h 3 3 c ) 电热恒温水浴箱( d s y 2 4 ) 制冰机( s i m f 1 2 3 ) 2 0i ，1 0 0l ，1 0 0 0i 加样器 一次性使用真空静脉血样采集容器 ( e d t a 抗凝管5 m i ，e d t a 抗凝管 2 m i ，普通管4 m i ) 0 5 m i ，1 5 m ie p p e n d o r f 管 封口膜( p a r a f i l m ) 10 0 0 u i ，2 0 0 u i ，微量移液器枪头 ( m i c r o p i p e t t e rt i p s ) 重蒸酚用蒸馏器 1 4 s o r v a c o u s a 上海安亭科学仪器厂 b e c k m a n u s a 江苏江阴科研器械厂 北京医疗设备厂 h i t a c h i ，j a p a n t m a r dc o u s a b i o r a d 公司 b i o r a d 公司 a x y g e n 公司 g i i s o n f r a n c e 北京六一仪器厂 北京君意机电技术公司 北京君意机电技术公司 s p e c t r 0 1 n e u v l b e c k m a n o h a u s 上海精密科学仪器有限公司 余姚长江温度仪器厂 s a n y o n g i l s o n f r a n c e 碧迪医疗器械有限公司 a x y g e n 公司 a m e r i c a nn a t i o n a ic a nt m a ) ( y g e n 公司 上海精密科学仪器有限公司 1 5 试剂名称 试剂提供厂家 t a qd n a 聚合酶 d n t p s ( 2 5n m o i ，ie a c hd n t p ) 氯化钠 无水乙醇 冰醋酸 盐酸 硼酸 酚 氯仿 异戊醇 t e m e d 蛋白酶k 氢氧化钠 溴化乙锭 溴酚蓝 二甲苯青 十二烷基硫酸钠 琼脂粉 丙烯酰胺 n ，n ，n ，n 甲叉双丙烯酰胺 过硫酸铵 tr s 碱 甲酰胺 凡士林 8 一羟基奎琳 乙胺四乙酸二钠( e d t a n a 2 ) 生理盐水注射液 硝酸银( 分析纯) 甲醛 甘油 1 6 北京奇华盛生物制品公司 p h a r m a c i ac o 。u s a 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 p r o m e g a m e r c k 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京鼎国生物技术公司 4 一。 北京鼎国生物技术公司。 。 f i u k a g l b c o ，b rl u s a s i g m au s a b o e h r n g e rm a n n h a m ， g e r m a n y g l b c o u s a 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 四川科伦药业股份有限公司 广东汕头市西陇化t 厂 北京市旭东化： 厂 北京化工厂 液体石蜡北京益利精细化学品有限公司 聚蔗糖4 0 0 ( f i c o 4 0 0 ) 上海化学试剂厂 欧蒙抗核抗体( a n a )马赛克间接免疫 荧光法检测试剂盒杭州医学实验诊断有限公司 p c rm a r k e r北京百泰克生物技术有限公司 10 电泳上样缓冲液 t a k a r a 公司 f c v r af 特异性引物( 扩增产物7 4 b p ) 奥科生物公司 上游： 5 一c t g a a g a c a c a t r 几广t a c t c c c a a a 一3 下游： 5 - t c c a a a a g c c a c a c t c a a a g a c 一3 v 特异性引物( 扩增产物7 4 b p ) 上游： 5 c t g a a g a c a c a t r r t t a c t c c c a a c 3 下游： 5 一t c c a a a a g c c a c a c t c a a a g a c 3 非特异性引物( 扩增产物4 0 9 b p ) 上游： 5 g a g a c t g a a a a a c c c t l - g g a a t c 一3 下游： 5 g c t t t c t c a g a c c t c c a t g t a g 一3 c d 2 4 引物( 扩增产物4 5 3 b p ) 卜游： 5 一t t g 丁1 g c c a c t 丁g g c a t t _ 厂r t g a g g c 3 下游： 5 g g a t r g g g t 丌a g a a g a t g g g g a a a 3 c y p 2 c 19 + 2 引物( 扩增产物3 0 9 b p ) 上游： 5 一c a g a g c t l g g c a t a t l _ g t a t c 一3 下游： 5 一g t a a a c a c a c a a c t a g t c a a tg 一3 b s t x i 限制性内切酶 。 s m a l 限制性内切酶 6 电泳上样缓冲液 奥科生物公司 奥科生物公司 n e b 公司 n e b 公司 t a k a r a 公司 1 7 一 1 2 3 主要试剂的配制： 1 ) t e s 缓冲液： t r i s 碱 1 2 1g n a c l 5 8g o 5m m o l 儿e d t a 2m i 加蒸馏水定容至1l ，高压灭菌。 2 ) 1 0 s d s 溶液： 称取1 0gs d s ，加蒸馏水定容至1 0 0m i 。 3 ) t e 缓冲液： 1 0m m o l ，lt r i s h c i 1m m o l ，le d t a p h8 0 p h8 o 4 ) 1 0 t b e 电泳缓冲液： t r i s 碱 10 8g 硼酸 5 5g 0 5m m o l ，le d 。r a ( p h 8 o )4 0m i 加蒸馏水定容至1l 。 5 ) t r i s c i 缓冲液 t r i s 碱 去离子水 磁力搅拌器溶解 加h c ；调至所需p h 值 定容至1 l 1 2 1 1 4g 8 0 0m i 6 ) 生理盐水的配制： 称量1 8g 氯化钠，加入5 0 0m i 去离子水，使氯化钠融化后，定容至2 0 0 0m i 。 7 ) 氯仿，异戊醇( 2 4 ：1 ) 溶液的配制： 氯仿4 8 0 m i ，加入异戊醇2 0m l ，混匀，装入棕色瓶中，4c 保存。 8 ) 蛋白酶k 溶液： 用灭菌去离子水配成2 0m g m i 浓度的储存液，分装保存于2 0c 。 9 ) 4 0 2 9 ：1 丙烯酰胺储存液配制： 丙烯酰胺 3 8 6 6 7 9 甲叉双丙烯酰胺 1 3 3 3g 以去离子水定容至1 0 0m i ，4c 避光保存。 1 0 ) 4 0 4 9 ：1 丙烯酰胺储存液配制： 丙烯酰胺 3 9 2g 1 8 甲叉双丙烯酰胺 0 8g 以去离子水定容至10 0m i ，4c 避光保存 1 1 ) d n a 上样缓冲液的配制： 溴酚蓝 0 _ 2 5 二甲苯青 0 2 5 聚蔗糖4 0 0 1 5 以去离子水定容，4c 保存。 12 ) s s c p 上样缓冲液的配制 甲酰胺 9 8 d n a 上样缓冲液 2 1 3 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳固定液的配制： 无水乙醇 5 0m i 冰醋酸5 0m i 以蒸馏水补至5 0 0m l 。室温保存。 1 4 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳染色液的配制： 硝酸银 0 5g 甲醛 7 5 0 u i 以蒸馏水补至5 0 0m l 。室温、避光保存。 1 5 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳显色液的配制： 氢氧化钠 2 5g 甲醛 7 5 0u l 以蒸馏水补至5 0 0m l 。室温保存。 1 2 42 琼脂糖凝胶的制备： 称1 6g 琼脂糖，加入8 0m | 1 t b e 电泳缓冲液中，置微波炉中加热至琼脂 糖完全融化。取出烧瓶，待溶液温度降至约5 0 左右时，加入溴化乙锭( 1 0 m g ，m i ) 至终浓度0 5g m l ，稍静置。在凝胶板中插入齿梳，倒入液态凝胶液， 观察是否有气泡，可用枪头挑出。静置1 小时后成为固态琼脂糖凝胶。4 保存。 1 2 52 5 琼脂糖凝胶的制备： 称2g 琼脂糖，加入8 0m 1 1 t b e 电泳缓冲液中，置微波炉中加热至琼脂 糖完全融化。取出烧瓶，待溶液温度降至约6 0 左右时，加入溴化乙锭( 1 0 m g m 1 ) 至终浓度o 5g m i ，稍静置。在凝胶板中插入齿梳，倒入液念凝胶液， 观察是甭有气泡，可用枪头挑出静置1 小时厉成为固念琼瞻糖：疑胶? 4 保存： 1 9 1 2 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备： 1 ) 根据所需凝胶的浓度及胶床的容积配制胶溶液( 见聚丙烯酰胺凝胶电泳液的 配制) 。 2 ) 根据模具体积计算所需配制胶液的容积，每板4 0 m i 的配置方法见下表： 试剂1 0 丙烯酰胺( 2 9 ：1 ) 凝胶 丙烯酰胺溶液 1 0 x t b e t e m e d 10 过硫酸铵溶液 水 2 9 ：1 丙烯酰胺储1 字液1 0 m i 4 m i 2 8 u i 2